Il significato dei numeri è 1 128 sifilide. Metodi di base per diagnosticare la sifilide e indicatori di decodifica

19.12.2021

La sifilide è considerata una malattia venerea, il cui principale colpevole è il treponema pallido. I batteri specificati possono entrare nel corpo dopo il rapporto sessuale o attraverso l'uso domestico.

Le misure diagnostiche volte a identificare questa malattia sono di natura complessa. I risultati del test possono essere influenzati da vari antibiotici, gravidanza e altri fattori che verranno descritti nell'articolo.

Quando viene prescritta un'analisi per la sifilide - indicazioni per la diagnosi

Alcuni pazienti, venendo per un esame da un ginecologo o da un andrologo, non forniscono informazioni oggettive sulla qualità della loro vita sessuale.

Forse il motivo è il solito imbarazzo, o forse il motivo è la mancanza di informazioni nel campo delle malattie sessualmente trasmissibili.

Il medico può inviare un esame anche se la sifilide non si manifesta in alcun modo e il paziente è sicuro al 100% che non potrebbe essere infettato da questo disturbo. Il fatto è che la patologia in questione può essere trasmesso attraverso il contatto familiare o essere asintomatico.

Il test per la sifilide è prescritto se:

È necessario registrarsi durante la gravidanza.
Il paziente desidera donare il sangue come donatore.
C'è la possibilità di assumere una certa posizione (soldato, paramedico, cuoco, ecc.), Che richiede il superamento di una commissione medica speciale.
Una persona si trova in luoghi di detenzione.
C'è stato un rapporto sessuale con un paziente con la sifilide.
La madre di un neonato è malata di sifilide.
Il paziente mostrava i segni della malattia indicata. Spesso si tratta di eruzioni cutanee nell'area genitale.
La prima analisi ha confermato la presenza della malattia in questione.

Se è presente la sifilide, vengono eseguiti esami del sangue regolari. Questo è necessario per controllare la qualità del trattamento.

Dopo la terapia, anche il sangue viene prelevato dal paziente per la ricerca.

Come eseguire correttamente il test per la sifilide -

Per le manipolazioni della ricerca, usano spesso sangue da una vena... In determinate situazioni, l'assistente di laboratorio può prelevare il campione desiderato per la diagnosi. dal dito o dal midollo spinale.

L'intervallo dal momento della consegna alla ricezione dei risultati può essere diverso: da un giorno a due settimane... Tutto sarà determinato dal tipo di test.

Quando ci si prepara per la consegna di un esame del sangue per identificare il disturbo in questione, è necessario attenersi alle seguenti raccomandazioni:

I cibi grassi il giorno prima del test devono essere esclusi dalla dieta. Provocherà l'opalescenza del siero sanguigno, che distorcerà i risultati ottenuti.
Dovresti astenerti dal cibo per almeno 8 ore. prima di fare il test per la sifilide.
Alcol, nicotina possono interferire con la valutazione della risposta. Gli esperti consigliano di non bere bevande contenenti alcol 24 ore prima dei test e dovresti aspettare con le sigarette almeno un'ora prima dell'esame.
Se il paziente sta assumendo antibiotici, l'analisi specificata deve essere eseguita almeno una settimana dopo la fine del trattamento.

Modalità di invio del materiale per la ricerca e decifrazione degli indicatori

Al giorno d'oggi, nessuno dei metodi per diagnosticare questa malattia può garantire l'accuratezza delle informazioni ricevute. In ogni caso, gli errori ci sono e possono raggiungere il 10%.

A questo proposito, applica un insieme di metodi di ricerca.

Analisi sierologiche - test aspecifici e specifici

Questo tipo di diagnosi è indicato con sintomi limitati della malattia o in sua completa assenza.

La sierodiagnostica è di due tipi:

1. Test non specifici

Sono rilevanti quando è necessario testare un ampio gruppo di persone per la sifilide, ma questa tecnica non è adatta quando è necessario confermare la diagnosi.

Il test è semplice, ma il medico dovrebbe dare la valutazione finale.

Questi tipi di diagnostica includono i seguenti test:

A) Microreazione di precipitazione (MP)

Uno studio simile è indicativo dopo un mese dall'infezione. Il sangue di un dito è soggetto a esame, ma a volte può essere utilizzato il liquido cerebrospinale.

Un risultato positivo del test ( gli anticorpi nel titolo variano da 1: 2 a 1: 320 ) non significa che il paziente sia malato di sifilide: è possibile confermare finalmente la diagnosi superando ulteriori test.

Una reazione negativa può derivare da due opzioni:

Il paziente non ha la sifilide.
La sifilide è presente, ma allo stadio iniziale di sviluppo.

B) Reazione di Wasserman ( PB, RW)

Il materiale di prova utilizzato qui è lo stesso dell'analisi di cui sopra.

Questo metodo di esame è in grado di fornire informazioni oggettive almeno 6 settimane dopo l'infezione. Si può parlare della presenza della patologia venerea indicata se i titoli anticorpali sono 1: 2 - 1: 800.

I risultati delle analisi per RV sono valutati dai seguenti segni matematici:

« — »Non c'è la sifilide.
« + "O" ++ "- viene indicata una reazione debolmente positiva.
« +++ "- una reazione positiva.
« ++++ "- il paziente ha una reazione fortemente positiva alla sifilide.

2. Test specifici

Esistono molte analisi diverse di questo tipo di esame che prendono di mira anticorpi specifici. Non compaiono immediatamente nel sangue, ma circa un mese dopo l'infezione e possono persistere lì per diversi anni (se non trattati).

Il medico deve ragionevolmente scegliere l'uno o l'altro tipo di analisi, conoscere ciascuno di essi in dettaglio, essere guidato dai risultati ottenuti ed essere in grado di differenziare la diagnosi dopo aver ricevuto una risposta.

I tipi più comuni di test specifici sono:

A) La reazione di immunofluorescenza (RIF)

È rilevante nelle primissime fasi della sifilide, ma il periodo ottimale per il test è di 6-8 settimane dopo l'infezione.

Lo studio richiede sangue capillare/venoso.

Gravidanza, i difetti del tessuto connettivo possono causare una falsa reazione, che viene valutata dal segno " — «.
I risultati positivi sono espressi da plus (" + ") Da uno a quattro.

B) Reazione di agglutinazione passiva (RPHA)

In questo test, una piccola quantità di sangue viene rimossa dal dito/vena, che viene poi mescolata con globuli rossi di ariete/gallo. Se l'agente patogeno di questa malattia è presente nel flusso sanguigno, i micro-oggetti si uniscono, seguiti dalla loro subsidenza.

Questo tipo di test è molto sensibile: può confermare una reazione positiva alla sifilide molto tempo dopo il trattamento.

Anche la mononucleosi e gli errori nella struttura del tessuto connettivo possono causare una reazione falsamente positiva.

Ci vuole un massimo di 1 ora per ottenere una risposta e i pazienti possono controllarsi da soli 4 settimane dopo l'infezione: nelle fasi precedenti, gli anticorpi non verranno prodotti in volume sufficiente.

Puoi giudicare per quanto tempo l'infezione è nel sangue dai titoli:

Se il loro valore non supera 1: 320, l'infezione si è verificata di recente.
Più alti sono i titoli, più lungo è il treponema nel corpo.

C) Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

Uno dei metodi più affidabili per diagnosticare questo disturbo, che iniziò ad essere utilizzato alla fine del secolo scorso.

È molto indicativo già 21 giorni dopo l'infezione e un risultato positivo del 98-99% indicherà la presenza di sifilide.

L'ELISA viene spesso utilizzato dopo test non specifici o in combinazione con alcuni test specifici.

Test ELISA rilevando un particolare gruppo di anticorpi nel sangue ( IgA, IgM, IgG) permette di conoscere lo stadio della malattia:

Se il campione di sangue contieneIgA ma assenteIgM,IgG: dal momento in cui il treponema pallido è entrato nel corpo, non sono trascorsi più di 14 giorni.
Se identificatoIgA,IgM, ma noIgG: l'infezione è avvenuta circa 28 giorni fa.
La presenza nel sangue di tutti gli anticorpi sopra elencati indica che è trascorso più di un mese dall'infezione..
Se la reazione del sangue alla presenzaIgA è negativo e accesoIgM,IgG positivo: è trascorso un enorme periodo di tempo dal momento dell'infezione o il trattamento della malattia ha avuto successo.

D) La reazione di immobilizzazione dei treponemi pallidi (RIBT)

Uno dei metodi più popolari per diagnosticare la sifilide.

Non ha senso usarlo nelle prime fasi dell'infezione, tuttavia, dopo la 12a settimana, i risultati del test RIBT sono affidabili al 99%.

Questo metodo diagnostico viene utilizzato in caso di sospetto di neurosifilide, sifilide degli organi interni o in combinazione con analisi non specifiche.

Quando si assumono antibiotici duranti, il paziente deve attendere almeno 25 giorni dopo la fine della terapia. Gli antibiotici idrosolubili richiedono meno tempo per essere eliminati dall'organismo: 7-8 giorni.

Il sangue viene prelevato da una vena, a stomaco vuoto, e i risultati vengono interpretati come percentuale di immobilizzazione:

Se il livello di immobilizzazione non supera il 20%, il test per la sifilide è considerato negativo.
Se viene superato il 50%, la reazione alla patologia indicata è positiva.

In altri casi, è prescritto un riesame.

E) Immunoblotting

Uno dei metodi di ricerca più recenti utilizzati quando altri test danno risultati discutibili.

Con la manipolazione diagnostica indicata, è possibile rilevare anche una minima quantità di anticorpi nel sangue: ha una precisione quasi del 100%.

Non tutte le cliniche effettuano questo tipo di test: non è economico.

Analisi di laboratorio

Il prezzo di costo dell'analisi in questione è molto basso e il risultato può essere scoperto entro 30 minuti.

1.Per eseguire tale studio, viene prelevato un campione dal paziente da difetti ulcerativi / erosivi. , che si trovano nella zona genitale. L'esame microscopico di un campione prelevato viene spesso eseguito in laboratorio.

Le aree interessate vengono inizialmente pulite con soluzione salina. Ciò contribuirà a proteggere l'area danneggiata dall'ingresso di microrganismi dannosi.

2. Inoltre, utilizzando un anello speciale, irritare la superficie alcuni minuti fino a quando appare un liquido bianco-trasparente. Dovresti stare più attento con questa manipolazione: è impossibile che le impurità del sangue entrino nel campione prelevato.

3. Il liquido estratto viene trasferito in un bicchiere trasparente. A volte è mescolato con soluzione salina.

Si può parlare di una reazione positiva quando vengono identificati i treponemi tipici, che avranno almeno 8 riccioli. Se il risultato è negativo, la procedura viene ripetuta (a volte più volte).

La sifilide trna è un test specifico volto a rilevare l'antigene IgG. In genere, si ricorre a questo studio dopo aver ricevuto un risultato positivo con RPR o per valutare l'efficacia del trattamento selezionato. La sifilide Trna è un test altamente sensibile che può mostrare un risultato positivo fino a 20 anni dopo il successo della terapia e, in alcuni casi, tracce residue della malattia possono persistere per il resto della tua vita.

Il test per la sifilide tpha (reazione di emoagglutinazione passiva) è stato proposto da T.Rathlev nel 1965. L'essenza del metodo consisteva nella reazione di adesione e precipitazione degli eritrociti, la cui superficie, nella sifilide, contiene antigeni al treponema pallidum, che si osserva solo se nel sangue sono presenti anticorpi antitreponemici.

Si raccomanda di eseguire l'analisi Trna un mese dopo la data prevista dell'infezione. Prima della raccolta stessa, dovresti astenerti dal mangiare per almeno 8 ore. Se i risultati del test trna indicano l'assenza di infezione, ma il paziente presenta sintomi di primi sintomi di infezione o in passato ha avuto rapporti sessuali con una persona che è stata trovata infetta da spirochete, allora si raccomanda di condurre un altro controllo studio con un intervallo di 2 settimane. A differenza di un risultato falso negativo per tpha, quando si utilizza questo metodo per rilevare l'antigene IgG, che può essere causato da uno studio troppo precoce, si può osservare un risultato falso positivo per treponema pallidum in tre casi:

Mononucleosi infettiva;
malattia di Lepre;
Lesioni sistemiche dei tessuti connettivi.

Oggi, lo studio tpha è utilizzato come il test sierologico specifico più efficace per confermare un risultato positivo di altri test per la sifilide o, se necessario, per valutare l'efficacia del trattamento.

I risultati degli studi sulla presenza dell'antigene IgG non si limitano a soli due segni "negativi" o "positivi", i risultati dello studio indicano anche il titolo di anticorpi, da cui è guidato il medico curante durante il periodo del paziente rimanere in ospedale per valutare l'efficacia dell'effetto terapeutico. Dalla dimensione dei titoli, si può concludere sull'attuale periodo di infezione e sul successo delle misure terapeutiche. Quindi, i titoli caratteristici del primo stadio della malattia vanno da 1:80 a 1:320. Con il passaggio della malattia allo stadio secondario, l'analisi per la tpha sifilide mostrerà un notevole aumento dei titoli a 1: 5120, seguito da una diminuzione del periodo di latenza a 1:80. Dopo una terapia di successo, i titoli possono diminuire in modo significativo, ma rimarranno positivi per molti anni dopo la dimissione.

A volte, con un test tpha positivo, i titoli sono così bassi che la diagnosi di sifilide solleva seri dubbi. In questo caso viene annotata la dubbia datazione ottenuta e si consiglia di ripetere la ripresa dopo 1-2 settimane.

Di solito, i test per la sifilide trn vengono eseguiti al mattino per un breve periodo di tempo, che è associato alla necessità di uno studio, tra cui viene indicata la necessità di consegnare campioni di sangue al laboratorio entro e non oltre 2 ore dopo la sua raccolta. In questo caso, i campioni devono essere trasportati a temperature fino a + 8 ° .

Il siero del sangue donato da una persona a stomaco vuoto viene utilizzato come materiale di prova per il tpha. Se tutte le condizioni necessarie sono soddisfatte durante il prelievo di sangue e la successiva analisi, l'accuratezza dei dati ottenuti sarà del 76% - con sifiloma primario, 100% - con una forma secondaria della malattia e 94 - in una fase avanzata dello sviluppo della malattia. La rilevazione di treponemi pallidi durante i periodi di decorso asintomatico della malattia è di circa il 97%. E il livello di specificità, che arriva fino al 99%, consente di escludere quasi completamente varianti di risultati falsi positivi, facilitando la diagnosi differenziale dei pazienti.

Test treponemici per la sifilide. Descrizione generale.

Per diagnosticare in modo affidabile la sifilide e identificare gli anticorpi anti-sifilitici nel corpo del paziente (nel siero del sangue o nel liquido cerebrospinale), vengono utilizzate speciali tecnologie di laboratorio, i cosiddetti metodi sierologici.

Quando si eseguono test diagnostici per la sifilide, vengono utilizzate varie reazioni sierologiche: agglutinazione, precipitazione, immunofluorescenza, legame del complemento, test immunoenzimatico, ecc. Tutte queste reazioni sierologiche si basano sull'interazione di antigeni e anticorpi.

Si chiamano test sierologici specifici treponemico perché questi test utilizzano treponemi pallidi o i loro antigeni, cioè antigeni di origine treponemica. Lo scopo dei test treponemici è identificare anticorpi specifici contro le strutture antigeniche dell'agente eziologico della sifilide, cioè anticorpi diretti specificamente contro i batteri T. pallidum stessi e non contro i tessuti corporei danneggiati dal treponema. Gli anticorpi anti-treponemici specifici della classe IgM possono essere rilevati alla fine della seconda settimana di malattia.

7. Risultati falsi positivi e falsi negativi

I risultati positivi di RV per la sifilide in persone che non soffrono di questa malattia sono chiamati falsi positivi. La frequenza dei risultati falsi positivi in individui sani è dello 0,2-0,25%. Se la percentuale di risultati RV falsi positivi non specifici in persone sane è molto piccola, in alcune malattie può essere alta.

Tutti i risultati non specifici delle reazioni sierologiche possono essere suddivisi nei seguenti gruppi principali:

1. Malattie causate dalla presenza di antigeni comuni in patogeni simili (spirochete): febbre ricorrente, imbardata, bejel, pinta, treponema del cavo orale, leptospira.

2. Reazioni positive dovute a cambiamenti nel metabolismo lipidico e cambiamenti nelle globuline sieriche. Questi includono risultati positivi in donne in gravidanza, pazienti con gotta, disturbi lipidici a seguito di avvelenamento con piombo, fosforo, dopo l'assunzione di salicilato di sodio, digitale, ecc. Queste reazioni dovrebbero includere reazioni positive in alcune malattie infettive (tifo, malaria, polmonite , lebbra, endocardite, collagenosi, infarto del miocardio, commozione cerebrale, malattie oncologiche, cirrosi epatica, ecc.)

3. Errori tecnici della condotta. Errata scelta della dose del complemento, mancato rispetto delle condizioni e dei termini di conservazione dei reagenti, esclusione dei campioni di siero di sangue di controllo dalla reazione, utilizzo di provette e strumenti contaminati.

8. Modifica della reazione di Wasserman

Ci sono modifiche della formulazione della reazione di Wasserman nelle versioni qualitative e quantitative, al freddo, con liquido cerebrospinale.

Modifica camper al freddo si è rivelato più sensibile. Una caratteristica del metodo per impostare la reazione di Wasserman al freddo è la natura trifase dei regimi di temperatura ai quali si verifica il legame del complemento. Questa reazione è posta anche con cardiolipina e antigene treponemico.

Oltre alla valutazione qualitativa della RT, esiste un metodo per la sua impostazione quantitativa con varie diluizioni di siero sanguigno (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Il titolo delle reagine è determinato dalla diluizione massima, che dà comunque un risultato nettamente positivo (4+). L'impostazione quantitativa del RV è importante nella diagnosi di alcune forme di sifilide e nel monitoraggio dell'efficacia della terapia.

9. Ambito

In Russia, RSKt fa parte del complesso dei test sierologici standard per la sifilide (CSR).

La reazione di Wasserman con l'antigene treponemico e cardiolipina (RSKt) viene utilizzata per

diagnostica di tutte le forme di sifilide,
monitorare l'efficacia del trattamento,
esami di persone che hanno avuto contatti sessuali con un paziente con la sifilide,
esami di persone con sospetto clinico e anamnestico di sifilide
durante l'esame profilattico per la sifilide di pazienti negli ospedali psichiatrici e neurologici, donatori e donne in gravidanza, comprese quelle inviate per l'interruzione artificiale della gravidanza.

Attualmente, per ordine del Ministero della Salute della Federazione Russa, si raccomanda di sostituire l'RSKT con metodi treponemici più sensibili (ELISA o RPGA).

All'estero, la reazione di Wasserman con l'antigene treponemico non è stata utilizzata per molto tempo nella pratica clinica di laboratorio e non è inclusa nell'elenco dei test standard raccomandati dall'Organizzazione mondiale della sanità.

Complesso di reazioni sierologiche classiche (CSR)

DAC- esso complesso di reazioni utilizzato per la sierodiagnosi della sifilide come metodo standard. Questo complesso di reazioni include la reazione di Wasserman con l'antigene della cardiolipina (estratto di cuore bovino arricchito con lecitina e colesterolo) e l'antigene treponemico (sospensione di treponemi pallidi apatogeni trattati con ultrasuoni), nonché una microreazione di precipitazione (PMP) con siero o inattivato con antigene cardiolipina

I CSR diventano positivi nel mezzo del periodo primario (la sua divisione in sieronegativi e sieropositivi è determinata precisamente dalla CSR), nel periodo secondario i CSR sono positivi nel 98-100% dei pazienti e nel periodo terziario - solo nel 60-70 %. Cioè, all'aumentare della durata della malattia, la positività al DAC diminuisce gradualmente.

Vantaggi del DAC:

1) Economicità, semplicità e velocità di impostazione. Ciò è particolarmente tipico per la reazione di microprecipitazione: il cancro della vescica è attualmente il principale metodo di screening (selezione);

2) I test non treponemici sono utili per monitorare la cura della sifilide.

Svantaggi del DAC:

1) Valutazione soggettiva dei risultati delle reazioni ("ad occhio");

2) Bassa sensibilità nelle forme tardive di sifilide;

3) Mancanza di specificità rispetto ai test più moderni. Quando vengono eseguiti, si notano spesso reazioni false positive (DM).

LPR può essere causato da cross-reattività tra la spirocheta pallidum e altri microbi, disturbi del metabolismo lipidico e proteico, instabilità delle membrane cellulari e formazione di autoanticorpi. I DM si osservano nelle infezioni acute (malaria, mononucleosi infettiva, ecc.) e croniche (tubercolosi, lebbra, epatite, borreliosi, ecc.), infarto del miocardio, cirrosi epatica, collagenosi (soprattutto nel LES), oncopatologia, vaccinazione, uso di droghe, abuso di alcol e cibi grassi. I DAC possono essere falsi positivi nelle ultime settimane di gravidanza, dopo il parto e in alcune donne durante le mestruazioni. Risultati DAC falsi negativi possono essere associati all'infezione da HIV.

RIT, RIBT - Reazione di immobilizzazione del treponema pallido

La reazione di immobilizzazione del treponema pallido (RIBT; Treponema pallidum immobiliization test, TPI) è un metodo classico che serve a rilevare anticorpi treponemici specifici. La reazione RIBT utilizza come antigene il treponema pallido patogeno T. pallidum (ceppo Nichols) cresciuto in un testicolo di coniglio. Il RIBT si basa sulla perdita di mobilità dei treponemi pallidi vivi dopo l'esposizione agli anticorpi del siero del sangue e del complemento del paziente. I risultati vengono valutati utilizzando la microscopia in campo oscuro. Nonostante il test RIBT sia stato introdotto nella pratica clinica come test specifico per la sifilide, è laborioso, tecnicamente difficile, dispendioso in termini di tempo e costoso da utilizzare.

1. Storia del metodo RIBT

Il test di immobilizzazione del treponema pallidum (RIBT) è in realtà il primo test specifico per la diagnosi della sifilide. Questa reazione fu presentata nel 1949 dai ricercatori americani R. W. Nelson e M. M. Mayer e discussa in dettaglio in lavori scientifici nei decenni successivi. In precedenza sono stati fatti tentativi falliti di utilizzare treponemi vivi nei test. Grazie al fatto che Nelson è stato in grado di creare un ambiente in cui i treponemi sono rimasti vitali fino a 8 giorni, la sua ricerca è stata coronata da successo.

2. Principio del metodo RIBT

Il metodo si basa sul fenomeno della pallida perdita di mobilità treponemica in presenza di anticorpi anti-treponemici immobilizzanti del siero sanguigno studiato e del complemento in condizioni anaerobiche. I treponemi pallidi patogeni vivi ottenuti da conigli infettati artificialmente con la sifilide fungono da antigene.

3. Dichiarazione del test RIBT

Il siero del test, il complemento e l'antigene sono coinvolti nella reazione. Il siero sanguigno del soggetto viene aggiunto a treponemi vivi ottenuti dai tessuti del testicolo di coniglio dopo infezione artificiale. In presenza di anticorpi-immobilizine anti-treponemici nel siero, i treponemi pallidi smettono di muoversi (vengono immobilizzati). Gli anticorpi-immobilisine sono anticorpi antitreponemici tardivi.

La reazione viene allestita con sieri inattivati al calore o con campioni di siero essiccati su carta paraffinata (gocce secche). L'inattivazione del siero mediante riscaldamento viene effettuata per 30 minuti a una temperatura di 56 ° C. Prima di prelevare il sangue, l'esaminato non deve ricevere farmaci, in particolare preparati di penicillina. L'assunzione di droghe viene annullata per la durata del loro possibile ritardo nel corpo.

Come antigene vengono utilizzati batteri del ceppo Nichols ottenuti da orchite sifilitica di coniglio di 7-10 giorni (infiammazione del testicolo). Il periodo dal momento dell'impostazione della reazione alla registrazione dei suoi risultati dura 18-20 ore, quindi, per mantenere la vitalità e una buona mobilità dei microrganismi, è necessario un mezzo di sopravvivenza.

Il complemento di cavia è utilizzato nel RIBT. Per ottenere il complemento, il sangue deve essere prelevato in condizioni sterili da diverse cavie.

In caso di contaminazione batterica il complemento viene scartato. Il complemento in scatola non deve essere utilizzato nella reazione di immobilizzazione del treponema pallido, perché è tossico per i microrganismi.

Un eccesso di complemento viene utilizzato nella reazione di immobilizzazione. La sua quantità dipende in gran parte dall'ambiente di sopravvivenza per il treponema pallidus.

RIBT viene posto in scatole sterili, pre-irradiate con lampada al quarzo battericida per 45-60 minuti. Ciascun siero sanguigno viene esaminato in due provette: esperto e controllo... Il siero in esame e l'antigene vengono aggiunti ad entrambe le provette nelle quantità richieste. Il complemento attivo viene versato nella provetta e la stessa quantità di siero di sangue di cavia inattivato viene aggiunta alla provetta di controllo. Dopo il riempimento, il contenuto delle provette viene miscelato agitando delicatamente.

RIBT procede in condizioni anaerobiche. I tubi con gli ingredienti vengono posti in un micro-anaerostato, dal quale l'aria atmosferica viene aspirata da una pompa a vuoto e viene iniettata una miscela di gas da un cilindro (95 parti di azoto e 5 parti di anidride carbonica). Il microanaerostato con provette viene posto in un termostato (35 ° C) per 18-20 ore.

La valutazione dei risultati del RIBT viene effettuata dopo aver rimosso i tubi dal termostato e dal micro-anaerostato (cioè, dopo 18-20 ore dall'esperimento). Utilizzando una pipetta Pasteur, una goccia del contenuto della provetta viene applicata su un vetrino, che viene coperto con un vetrino coprioggetto ed esaminato nel campo scuro di un microscopio (obiettivo 40, oculare 10X). Diversi campi visivi vengono esaminati in diverse parti del preparato, contando in ciascuno il numero di treponemi pallidi mobili e immobili. Il conteggio inizia con la preparazione dal controllo, e poi dalla provetta sperimentale.

Nella messa in scena di una reazione vengono utilizzati 5 studi di controllo: con siero sanguigno ovviamente positivo e negativo, con complemento attivo e inattivato e un terreno di sopravvivenza per treponema pallido. Il siero del sangue di controllo negativo viene utilizzato per valutare il grado di mobilità dei treponemi pallidi in questo esperimento. Siero sanguigno di controllo positivo - per valutare il grado di attività immobilizzante nelle condizioni di questo esperimento. Lo studio del complemento attivo e inattivato e dell'ambiente viene effettuato per determinare il loro effetto sulla mobilità dei treponemi pallidi.

Con una mancanza di complemento nell'esperimento, gli anticorpi immobilizzanti non mostrano la loro attività correttamente e i treponemi rimangono mobili. Pertanto, dopo l'esperimento, viene effettuata la determinazione del complemento residuo al fine di valutare se la mobilità dei treponemi pallidi nelle provette fosse dovuta all'assenza di complemento. Per questo viene utilizzato un sistema emolitico: una miscela di una sospensione di eritrociti di pecora e siero emolitico diluito conservato in un termostato.

Il complemento residuo viene determinato aggiungendo un sistema emolitico a ciascuna provetta nel volume richiesto. I tubi vengono posti in un termostato a 37 ° per 45 minuti. Nelle provette dovrebbe verificarsi l'emolisi degli eritrociti, nelle provette di controllo dovrebbe esserci un ritardo nell'emolisi. L'assenza di emolisi nelle provette indica una quantità insufficiente di complemento, in questi casi lo studio deve essere ripetuto. Uno studio ripetuto del siero del sangue non viene eseguito solo se si nota un'immobilizzazione del 100% dei treponemi pallidi.

4. Tenendo conto dei risultati di RIBT

Il conteggio dei treponemi immobilizzati che hanno perso mobilità viene effettuato al microscopio, utilizzando il metodo della microscopia in campo oscuro. Al ricercatore è richiesta l'abilità di valutare il movimento dei treponemi. Dovrebbe prestare attenzione all'intensità dei movimenti eseguiti dal treponema pallido. In questo batterio non è sempre possibile osservare contrazioni ondulatorie e movimenti di flessione, a volte solo rotazionali. Dovresti anche essere in grado di distinguere i movimenti attivi del treponema dal movimento con flusso di fluido.

Per valutare i risultati della reazione, viene calcolata la percentuale di immobilizzazione dei treponemi pallidi, ovvero il rapporto tra treponemi mobili e immobili nell'esperimento (con complemento attivo) e controllo (con complemento inattivo) secondo la formula:

X = (M - C) × 100 / M

dove M è il numero di treponemi mobili nel controllo; C - il numero di treponemi mobili nell'esperimento; X -% immobilizzazione. Nel lavoro pratico, la percentuale di immobilizzazione viene determinata secondo una tabella precompilata utilizzando la formula sopra.

La reazione di immobilizzazione del treponema pallido è valutata come

positivo quando immobilizzato 51 - 100% treponema,
debolmente positivo: 31 - 50% treponema immobile,
dubbioso: 21 - 30% treponema immobile,
negativo: 0 - 20% treponema immobile.

La reazione di immobilizzazione del treponema pallido diventa positiva alla fine del primario - l'inizio del periodo secondario della sifilide (da 7-8 settimane dal momento dell'infezione e oltre). Allo stesso tempo, il RIBT è di scarsa utilità per diagnosticare le prime fasi della sifilide, poiché gli anticorpi che immobilizzano i treponemi pallidi e vengono rilevati nella reazione compaiono solo 3-6 settimane dopo l'infezione. Gli anticorpi-immobilisine appartengono alla classe delle immunoglobuline IgG. Appaiono nel sangue più tardi delle reagine (anticorpi anticardiolipina), degli anticorpi della fluoresceina (rilevati da RIF ed ELISA) e delle precipitine (rilevate dal cancro della vescica).

In futuro, RIBT rimane positivo. C'è un'alta sensibilità della reazione nelle forme tardive di sifilide. Con sifilide secondaria, tardiva, neurosifilide, sifilide congenita, un risultato RIBT positivo viene registrato nel 95-100% dei casi. Con la sifilide terziaria, con lesioni specifiche degli organi interni, del sistema nervoso, quando il RV è spesso negativo, il RIBT dà risultati positivi nel 98 - 100% dei casi.

Il RIBT è stato a lungo riconosciuto come il test più specifico per la sifilide. Secondo la letteratura, la specificità del RIBT è del 99%, la sensibilità varia dal 79 al 94%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità del RIBT (in totale, per tutti gli stadi della sifilide) è dell'87,7%.

7. Ambito del metodo

L'ambito di applicazione di RIBT si sta gradualmente restringendo a causa della durata dell'installazione, dei costi elevati e dell'intensità della manodopera. RIBT è un'analisi piuttosto complessa e costosa che richiede personale altamente qualificato e un vivaio. A questo proposito, l'uso di questo metodo è notevolmente diminuito negli ultimi anni. Negli Stati Uniti, questo test è attualmente utilizzato solo nei laboratori di ricerca.

In base alla complessità e al costo elevato di RIF e RIBT, ha senso utilizzarli per diagnosticare forme tardive e latenti di sifilide. Il RIBT mantiene la sua posizione di "reazione arbitrale" nella diagnosi differenziale delle prime forme latenti di sifilide e dei risultati falsi positivi. Questa reazione può essere utile nella diagnosi di neurosifilide e quando ci sono discrepanze nei risultati di altri test sierologici.

RIBT diventa positivo molto più tardi di RIF e RV. Pertanto, non viene utilizzato per diagnosticare forme infettive di sifilide.

RIBT, come RIF, diventa molto lentamente negativo nel processo di terapia antisifilitica. Di conseguenza, non è adatto per monitorare il corso della terapia antisifilitica.

I risultati falsi positivi (LPR) in RIBT sono rari e si notano principalmente in un certo numero di treponematosi (imbardata, pinta, bejel), che non si trovano in Russia, così come nella lebbra, sarcoidosi, LES, tubercolosi, cirrosi epatica e alcune altre malattie rare di natura non sifilitica. Man mano che i pazienti invecchiano, il numero di risultati RIBT falsi positivi aumenta.

Il RIBT può rivelarsi falso positivo se il siero del test contiene sostanze treponemicida (ad esempio penicilline, tetracicline, eritromicina), che causano l'immobilizzazione aspecifica dei treponemi pallidi. Ciò può essere una conseguenza del paziente che assume antibiotici treponemocidi, pertanto l'esame non viene eseguita durante l'ultimo mese in persone che hanno ricevuto antibiotici. Il sangue per RIBT può essere testato non prima di 2 settimane dopo la fine dell'assunzione di antibiotici e altri farmaci anti-sifilitici.

9. Modifiche della reazione di immobilizzazione del treponema pallido

Oltre alla tecnica microanaerostatica, esiste un'impostazione RIBT melange secondo N.M. Ovchinnikov. Le condizioni anaerobiche durante la formulazione della reazione si creano ponendo la miscela di reazione in un melange (miscelatore di leucociti), le cui estremità sono chiuse con un anello di gomma. La tecnica della reazione melange consente di fare a meno di una pompa per vuoto, un cilindro con una miscela di azoto e anidride carbonica e un microanerostato. In uno studio comparativo su un ampio materiale clinico, i risultati ottenuti non sono inferiori alla tecnica anaerostatica classica.

10. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi di RIBT

RIBT è un metodo diagnostico tecnicamente complesso e costoso. La tecnologia richiede fondi significativi per l'allevamento di conigli e per i test. Questo laborioso test è attualmente utilizzato principalmente per scopi scientifici. Nella maggior parte dei paesi esteri, da quasi 40 anni, il RIBT è stato praticamente utilizzato non per scopi diagnostici, ma solo per lavori di ricerca.

Svantaggi della reazione:

RIBT richiede lavoro con treponemi pallidi patogeni vivi del ceppo Nichols, che rimane infettivo per l'uomo nonostante l'adattamento per i conigli
l'impostazione della reazione è difficile, lunga e costosa
richiesto il vivaio
è necessario personale altamente qualificato per impostare la reazione, registrare i risultati e mantenere il vivaio
soggettività nella valutazione dei risultati
mancanza di automazione
non c'è modo di standardizzare questo metodo sierologico.
la reazione non è applicabile sullo sfondo della terapia antisifilitica in corso
incapacità di utilizzare per controllare la guarigione. RIBT nei pazienti con sifilide può rimanere positivo per molti anni (e anche per tutta la vita), nonostante il trattamento completo ricevuto.
la reazione può dare risultati falsi positivi in pazienti con tumori maligni, diabete, lebbra, malattie autoimmuni, polmonite, gravi patologie cardiovascolari.

I vantaggi di RIBT sono:

1) Sensibilità sufficientemente alta;

2) Alta specificità.

RIF (reazione di immunofluorescenza)

La reazione di immunofluorescenza (RIF) è un metodo diagnostico espresso per rilevare antigeni di microbi o determinare anticorpi. I test basati sulla rilevazione di un segnale fluorescente sono considerati uno dei migliori test per la sifilide.

1. Storia del metodo

L'anticorpo treponemico fluorescente (FTA) è stato sviluppato per la prima volta nel 1957 da Deacon e altri (Deacon, Falcone e Harris).

2. Principio del metodo

Il metodo RIF si basa sul fatto che antigeni tissutali o microbi trattati con sieri immunitari con anticorpi marcati con fluorocromi sono in grado di brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza. I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente brillano lungo la periferia della cellula sotto forma di un bordo verde.

Come antigene in RIF, viene utilizzata una sospensione di treponemi pallidi patogeni vivi del ceppo di Nichols da orchite di coniglio, che viene essiccata su un vetrino e fissato con acetone. Il siero del sangue del paziente viene aggiunto all'acetone essiccato e fissato al bicchiere di treponemi pallidi.

Dopo il lavaggio, la preparazione viene trattata con siero contenente anticorpi contro le immunoglobuline umane marcate con fluoresceina. Il campione viene nuovamente lavato e visualizzato al microscopio a fluorescenza. Se il siero del test contiene anticorpi anti-treponemici-fluoresceine, si noterà un bagliore giallo-verde di treponemi.

3. Il metodo di condurre la ricerca con il metodo RIF

L'antigene fissato sul vetrino (treponema pallido patogeno) viene trattato con il siero in esame. Dopo il lavaggio, la preparazione viene trattata con siero luminescente marcato con fluorocromo contro le immunoglobuline umane. In questo caso, il complesso fluorescente risultante (globulina antiumana + tioisocianato di fluoresceina) si lega alla globulina umana sulla superficie del treponema pallidus, fornendo la luminescenza del treponema pallidum al microscopio luminescente.

Per rilevare i complessi antigene-anticorpo, viene utilizzato un siero luminescente, che è un'immunoglobulina anti-specie (anti-umana) coniugata con FITC. La presenza di anticorpi contro i treponemi nel siero è determinata dalla luminescenza dei treponemi quando esaminati al microscopio luminescente. Il test viene effettuato in versione qualitativa e semiquantitativa.

4. Contabilità dei risultati

I risultati del RIF vengono visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza. I risultati sono valutati dal grado di luminescenza dei treponemi nella preparazione. In presenza di anticorpi, la luminescenza dei treponemi è visibile, ma se non ci fossero anticorpi anti-treponemici nel siero, i treponemi non sono visibili. Il grado di luminescenza dei treponemi pallidi essiccati fissati al vetro è indicato in "più" (da "-" a "++++"). Risultato negativo - nessun bagliore o livello di sfondo - 1+.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare

La reazione di immunofluorescenza (RIF) è abbastanza sensibile in tutte le fasi dell'infezione, dalla fine del periodo di incubazione alla sifilide tardiva. Il periodo primario della sifilide nel decorso classico inizia 3-4 settimane dopo l'infezione. Il RIF diventa positivo nei primi giorni del periodo primario o anche alla fine del periodo di incubazione, dalla 3a settimana dopo l'infezione. I risultati del RIF restano positivi in tutti i periodi, anche nelle forme tardive.

RIF diventa positivo un po' prima di RV. Secondo alcuni rapporti, un RIF positivo si verifica nell'80% dei pazienti con sifilide sieronegativa primaria. Nel periodo secondario, il RIF è positivo in quasi il 100% dei casi. È sempre positivo nella sifilide latente e dà risultati positivi del 95-100% nelle forme tardive della malattia e nella sifilide congenita.

6. Sensibilità e specificità

La reazione di immunofluorescenza (RIF) è un gruppo di metodi con elevata sensibilità e specificità. Il RIF è sensibile in tutte le fasi dell'infezione, dal periodo di incubazione alla sifilide tardiva. Secondo l'OMS, la sensibilità del RIF nella sifilide primaria è del 70-100%, nella sifilide secondaria e tardiva - 96-100%, specificità - 94-100%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità del RIF in tutte le forme di sifilide è del 99,1%.

La specificità di RIF può essere aumentata pretrattando il siero studiato con un assorbente - un antigene treponemico ultrasonico che lega gli anticorpi di gruppo (RIF-abs).

7. Ambito del metodo

RIF viene utilizzato:

come reazione di conferma nella sifilide precoce e latente
quando si stabilisce una diagnosi retrospettiva
per differenziare forme latenti di sifilide e risultati di test falsi positivi per la sifilide.
come test di conferma per la neurosifilide.

Il RIF è ampiamente utilizzato come test di conferma, ma non è destinato all'uso di routine o allo screening perché è tecnicamente difficile da impostare. Per eseguire la RIF è necessaria la presenza di un vivaio o l'acquisizione di una sospensione di treponemi pallidi patogeni, che limitano le possibilità della reazione. Tuttavia, negli ultimi anni, sul mercato domestico hanno iniziato a comparire sistemi di test che consentono di condurre una reazione in assenza di un vivarium e di un proprio ceppo di laboratorio di treponemi pallidi patogeni.

8. Fonti e cause di errori di stadiazione, risultati falsi positivi e falsi negativi

I decisori durante la messa in scena del RIF sono rari (con collagenosi, borreliosi).

Il RIF è ancora considerato uno dei migliori test per la sifilide, il "gold standard" della sierodiagnosi. RIF rispetto a RIBT è più facile da configurare,

Nonostante l'alto valore diagnostico, l'introduzione diffusa del RIF nella pratica quotidiana è ostacolata dalla necessità di utilizzare T. pallidum vivo, dall'alto costo e dalla durata dello studio. La formulazione della reazione è laboriosa. Inoltre, la valutazione dei risultati del RIF è soggettiva.

I vantaggi del RIF e RIBT sono:

1) Alta sensibilità (soprattutto per RIF);

2) Alta specificità (soprattutto per RIBT).

Svantaggi del RIF e RIB:

1) Complessità tecnica, alto costo dei metodi.

2) Valutazione soggettiva dei risultati, mancanza di automazione;

3) RIF e RIBT nei pazienti con sifilide possono rimanere positivi per molti anni (e anche per tutta la vita), nonostante il trattamento completo ricevuto. Pertanto, queste reazioni non possono essere utilizzate per controllare la guarigione.

10. Modifiche del metodo

In pratica, per la sierodiagnosi della sifilide, sono state e sono state utilizzate diverse modificazioni della reazione di immunofluorescenza:

RIF-addominali- il metodo più sensibile di sierodiagnosi della sifilide, diventa positivo prima di altre reazioni (dalla 3a settimana dall'infezione);
RIF-200(il siero del paziente viene diluito 200 volte durante l'installazione) - un metodo altamente specifico per la sierodiagnosi della sifilide.
RIF-10(10 volte la diluizione del siero testato) è un metodo più sensibile del RIF-200.
RIF-c effettuato con liquido cerebrospinale.
RIF-abs-IgM- rilevazione precoce di anticorpi anti-treponemici della classe IgM.

1. La modifica più diffusa è RIF-addominali- la reazione di immunofluorescenza con assorbimento. Prima di innescare la reazione, il siero del soggetto viene impoverito da una miscela di treponemi non patogeni per escludere reazioni crociate. Gli anticorpi di gruppo vengono rimossi dal siero studiato utilizzando treponemi culturali distrutti dagli ultrasuoni, che aumenta significativamente la specificità della reazione. Poiché il siero del test viene utilizzato in una diluizione 1: 5, RIF-abs è altamente sensibile.

Le principali indicazioni per l'uso di RIF-abs nella pratica clinica sono:

diagnostica delle forme latenti e tardive di sifilide,
identificazione di risultati falsi positivi di CSW e cancro della vescica, specialmente nelle donne in gravidanza e nei pazienti somatici con sospetta sifilide,
stabilire una diagnosi retrospettiva della malattia.

RIF-abs non è molto informativo nella valutazione dei risultati del trattamento: nell'85% dei pazienti che hanno ricevuto un'adeguata terapia antisifilitica, i risultati positivi del RIF persistono per molti anni.

Questa reazione è chiamata il "gold standard" per la sierodiagnosi della sifilide. Viene utilizzato per casi di arbitrato, ma per un risultato affidabile è necessaria una sospensione fresca e concentrata di T. pallidum ceppo Nichols da sette giorni di orchite in un coniglio, che non deve essere congelato.

2.In URSS, è stato installato in due modifiche: RIF-10 e RIF-200, cioè con una diluizione del siero in esame di 10 e 200 volte. RIF-200: il siero del test viene diluito 200 volte per ridurre il numero di risultati falsi positivi. Ciò fornisce un'elevata specificità della reazione, ma la sua sensibilità diminuisce leggermente. RIF-10 è più sensibile, ma fornisce più spesso risultati positivi non specifici rispetto a RIF-200, che è altamente specifico. RIF-10 è più sensibile, RIF-200 e RIF-abs sono più specifici.

La sensibilità di RIF-200 e RIF-abs è stimata all'84-99% e la specificità - 97-99%.

3. RIF-c effettuato con liquido cerebrospinale. La reazione viene impostata utilizzando l'intero liquido cerebrospinale per identificare lesioni specifiche del sistema nervoso centrale.

4. Reazione RIF-abs-IgM proposto per la rilevazione di anticorpi anti-treponemici precoci della classe IgM. Questa reazione può essere utilizzata per diagnosticare la sifilide congenita, le forme precoci di sifilide e la diagnosi differenziale dei casi di reinfezione e recidiva.

Ci sono 2 modifiche note di questa reazione:

- FTA-ABS-IgM, basato sull'utilizzo nella seconda fase della reazione di un coniugato anti-IgM (anticorpi anti-IgM umane marcati con fluoresceina) al posto dell'anti-globuline fluorescenti umane;

- Versione russa di RIF-abs-IgM, caratterizzata dal fatto che al siero del sangue viene aggiunto un assorbente che rimuove gli anticorpi IgG e il RIF-abs viene posizionato con gli anticorpi IgM rimanenti.

Le principali indicazioni per l'impostazione di RIF-abs-IgM sono:

- sierodiagnosi della sifilide congenita in assenza di manifestazioni manifeste di sifilide congenita nel bambino sulla pelle e sulle mucose;

- diagnosi differenziale di reinfezione e recidiva clinico-sierologica o sierologica della sifilide, in cui RIF-abs-IgM sarà negativo e RIF-abs - positivo;

- Valutazione dell'efficacia della terapia per la sifilide acquisita precocemente o congenita: dopo un adeguato trattamento, il RIF-abs-IgM diventa negativo entro i successivi 3-6 mesi.

Questa reazione può essere utilizzata per rilevare la sifilide congenita. È noto che grandi molecole di IgM non possono attraversare una placenta sana. Di conseguenza, gli anticorpi di classe M contro il treponema pallido possono comparire nel corpo del bambino sia a causa di una violazione della funzione di barriera della placenta, sia sono prodotti dal corpo di un bambino con la sifilide. Gli anticorpi della classe IgM compaiono nel sangue di un paziente con sifilide nelle prime settimane della malattia e gli anticorpi della classe IgG compaiono più tardi. La determinazione separata degli anticorpi di entrambe le classi risulta estremamente utile nella diagnosi della sifilide congenita nei bambini, poiché la presenza di anticorpi IgM in un bambino nel primo mese di vita indicherà che sono formati dal corpo di un bambino con sifilide, mentre la rilevazione delle sole IgG parlerà di origine materna di queste ultime.

Impostazione della reazione 19S (IgM) -RIF-abs presuppone la separazione preliminare mediante filtrazione su gel di molecole 19S IgM più grandi da

frazioni di molecole 7S IgG più piccole. Ulteriori studi sulla reazione RIF-abs di siero sanguigno contenente solo la frazione 19S IgM,

elimina tutte le possibili fonti di errore. Ma la tecnica per mettere in scena questa reazione è complessa e laboriosa e richiede attrezzature speciali e formazione di specialisti.

Reazione di immunoadesione (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Questa reazione si basa sull'uso del fenomeno descritto da Rieckenberg nel 1912. Il RIP si basa sul fatto che i treponemi tissutali virulenti sensibilizzati con il siero di un paziente affetto da sifilide, in presenza di complemento ed eritrociti, aderiscono alla superficie degli eritrociti e, durante la centrifugazione, vengono trasportati con essi nel sedimento, scomparendo dal liquido surnatante.

Per impostare la reazione, vengono utilizzati i seguenti ingredienti: siero di prova, antigene, complemento, eritrociti del donatore, soluzione isotonica di cloruro di sodio. Come antigene viene utilizzata una sospensione di treponemi pallidi del ceppo Nichols.

Questo test è stato ampiamente studiato da autori nazionali e stranieri negli anni 50-60 in relazione alla sierodiagnosi della sifilide. I dati sul valore di RIP come test diagnostico sono stati contrastanti. La reazione ha richiesto la massima accuratezza, poiché versamento impreciso degli ingredienti, con un eccesso o una mancanza del materiale di prova nella preparazione, sono stati ottenuti risultati inaffidabili.

In Russia, L.V. Sazonov, che ha ottenuto risultati simili in RIP e RIT utilizzando una sospensione appena preparata di treponemi pallidi patogeni del ceppo Nichols. Tuttavia, l'uso di un antigene riscaldato o preservato dal fenolo ha fortemente distorto i risultati della reazione e ha reso l'antigene instabile. Consiglia questo test per sostituire RIT L.V. Sazonova lo trovò impossibile.

G.P. Avdeeva, utilizzando altri regimi di temperatura e tempo nella produzione dell'antigene, ha ottenuto altri risultati durante lo studio del RIP. Secondo i suoi dati, la sensibilità di questa reazione è superiore alla sensibilità di KCP e RIT, ma leggermente inferiore a RIF e la specificità di RIP, RIT e RIF è vicina.

Tuttavia, la mancanza di un rilascio commerciale dell'antigene per RIP non ha consentito uno studio più ampio di questo test e della sua attuazione pratica.

RPHA-reazione di emoagglutinazione passiva

Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA)è un test sierologico comune ben consolidato nella pratica di laboratorio. ha un livello abbastanza alto di efficienza nella ricerca.

1. Storia del metodo RPGA

Per la prima volta, l'uso di RPHA per la diagnosi di sifilide è stato segnalato da G. Blumental e W. Bachman (1932). Nel 1965, per la diagnosi di sifilide, fu proposta una reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva. La modifica della reazione con l'uso di vari antigeni è stata segnalata da T. Ratlev nel 1965-1967. La micromodifica dell'RPHA è stata proposta da R.M. Sokh. e coautori nel 1969. Il primo sistema di test commerciale è stato sviluppato dagli scienziati giapponesi Tomisava et. al. nel 1969

2. Il principio del metodo RPGA

Dalla sospensione omogenea preparata di eritrociti, "caricata" di antigeni, quando viene aggiunto il siero di prova contenente anticorpi, precipita un precipitato sotto forma di scaglie. Il sedimento risultante è costituito da eritrociti, "incollati" da anticorpi, ed è chiamato "emoagglutinato"... Una sospensione di eritrociti viene preparata in anticipo e fornita come parte dei sistemi di test diagnostici.

Il processo di adesione dei globuli rossi, sulla cui superficie sono presenti gli antigeni, è chiamato "emoagglutinazione". Il legame avviene sotto l'azione di anticorpi specifici (agglutinine). La reazione si chiama "Passivo" da gli antigeni dell'eritrocita non reagiscono e gli eritrociti stessi svolgono esclusivamente una funzione di indicatore ausiliario.

La reazione di emoagglutinazione passiva (indiretta) è un tipo di reazione di agglutinazione in cui gli eritrociti (dal greco háima - sangue) vengono utilizzati come portatori di antigeni e non altre particelle. Nel caso generale, nella reazione di agglutinazione sotto l'azione di anticorpi, si verifica l'adesione e la precipitazione di microbi o altre cellule - non necessariamente eritrociti, ma, ad esempio, particelle di lattice, batteri o altre particelle corpuscolari che trasportano antigeni.

Nella reazione di emoagglutinazione passiva per la diagnosi di sifilide, gli eritrociti di una pecora o di un uccello, ricoperti di antigeni di treponemi pallidi, vengono utilizzati come antigene. Quando si aggiunge siero contenente anticorpi specifici, gli eritrociti si uniscono (agglutinazione).

La reazione RPHA è classificata come metodo immunologico, perché si basa sull'interazione specifica dell'antigene patogeno del treponema pallidum con un anticorpo. Secondo la "teoria del reticolo", l'agglutinazione è il risultato della "cucitura" di molecole di antigene di superficie con molecole di anticorpi (immunoglobuline).

3. Impostazione della reazione di emoagglutinazione passiva

L'RPHA viene posto in piastre di plastica o in provette con diluizioni del siero sanguigno del paziente, a cui viene aggiunto erythrocyte diagnosticum.

Il processo di combinazione dell'antigene con gli eritrociti è chiamato sensibilizzazione e l'antigene corpuscolare artificiale ottenuto in questo modo è chiamato eritrociti sensibilizzati. Gli eritrociti diagnostici sono eritrociti sensibilizzati con un antigene.

Per la preparazione del diagnosticum si utilizzano eritrociti di montone o di uccelli (solitamente pollo), trattati prima con formalina, poi con tannino, che vengono sensibilizzati con un antigene ecografico di treponema pallido patogeno (ceppo Nichols) o proteine ricombinanti di treponema pallido (TpN15, TpN17, TpN47). Inoltre, possono essere utilizzati eritrociti di un montone sensibilizzato con un antigene ultrasonico di treponemi pallidi culturali.

Viene testato solo il siero (non utilizzare plasma sanguigno). I campioni emolizzati e torbidi non sono adatti. Gli eritrociti non sensibilizzati (per escludere la presenza di anticorpi anti-eritrociti) fungono da controllo negativo. I controlli positivi e negativi vengono utilizzati per ciascuna serie di test.

Campioni del siero del sangue studiato e degli eritrociti del test vengono introdotti nei pozzetti (cellule) della piastra immunologica. Se il siero del sangue del paziente contiene anticorpi anti-treponemici specifici, quando il siero del test viene aggiunto al pozzetto con l'antigene, si verifica la formazione di complessi antigene-anticorpo associati alla superficie dei portatori (eritrociti). Visivamente, questo si manifesta con l'adesione degli eritrociti, cioè l'emoagglutinazione, che è visibile ad occhio nudo. I complessi immuni "anticorpo-antigene-eritrocita", che scendono gradualmente sotto l'influenza della gravità, sono distribuiti su tutta la superficie del fondo del foro e formano un'immagine caratteristica di un "ombrello capovolto".

A seconda della quantità di anticorpi contenuti nel campione in esame, l'immagine dell'"ombrello rovesciato" varia dal massimo, che occupa l'intera superficie del fondo del pozzetto, ad una piccola area nella parte centrale e più bassa di esso ( con illuminazione al centro e formazione di un anello più intenso di eritrociti stanziati lungo la periferia).

Gli immunocomplessi non si formano se non sono presenti anticorpi specifici nel campione o quando alla reazione vengono aggiunti eritrociti di controllo (intatti). In questo caso, gli eritrociti vengono gradualmente raccolti nel punto più basso del fondo del foro, formando una figura a forma di punto compatto o "bottone", a volte con una leggera illuminazione al centro.

Se il siero del sangue di una persona contiene anticorpi anti-eritrociti, si formerà comunque un "ombrello", sia in reazione con eritrociti di prova che con eritrociti di controllo. In questo caso, si consigliano altre tecnologie mediche per rilevare anticorpi antitreponemici specifici.

Possibile fenomeno prozona (impossibilità di reazione per eccesso di anticorpi), eliminato per diluizione del siero.

4. Tenendo conto dei risultati della reazione di emoagglutinazione passiva

I risultati di RPHA vengono presi in considerazione visivamente dopo 60-120 minuti durante l'impostazione del micrometodo e dopo 2-4 ore o il giorno successivo durante l'impostazione della macrovariante. Quando si utilizzano eritrociti di uccelli più grandi (nucleati), si ottiene un'immagine più chiara, i risultati vengono registrati in una data precedente.

È possibile determinare il titolo (titolo alto di RPHA ≥ 1: 2 560).

I risultati dello studio vengono valutati secondo il sistema 4+ (da "-" a "++++") in base alla dimensione del film formato. Quando appare l'agglutinazione, gli eritrociti si trovano sulla superficie del foro sotto forma di "ombrello" e se il risultato è negativo, gli eritrociti scivolano liberamente verso il basso e si accumulano sul fondo al centro del foro sotto forma di un "pulsante".

La valutazione generalmente accettata dei risultati dell'RPHA:

4+ - RPGA positivo. Gli eritrociti agglutinati sotto forma di "ombrello" rivestono uniformemente l'intera superficie del foro;

3+ - RPGA positivo. Gli eritrociti rivestono l'intera superficie del foro, ma alcuni di essi "scivolano" verso il centro. In questo caso si forma un anello evidente lungo la periferia del sedimento;

2+ è un RPHA debolmente positivo. Gli eritrociti formano un film in una piccola area della parte inferiore del pozzo, formando un denso anello di sedimenti eritrocitari con una notevole illuminazione al centro;

1+ - RPHA non definito, gli eritrociti formano un sedimento sciolto sul fondo del pozzo con bordi indistinti e una leggera fessura al centro;

(-) - RPHA negativo, tutti gli eritrociti giacciono sul fondo del pozzo sotto forma di un sedimento compatto ("bottoni" o riccioli) su uno sfondo circostante pulito (senza sedimentazione granulare circostante).

Nella pratica straniera, i risultati di RPHA sono anche valutati come reattivi (in caso di formazione di agglutinati), debolmente reattivi (se le formazioni sono insignificanti) e non reattivi (se non si osserva agglutinazione).

I risultati della reazione possono essere presi in considerazione automaticamente utilizzando analizzatori speciali. Oltre alla ricerca qualitativa, in tutti i sistemi di test viene fornita un'analisi quantitativa con determinazione del titolo.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare RPHA

La RPHA diventa positiva a metà del periodo primario (7-8 settimane dal momento dell'infezione, 3-4 settimane dopo la comparsa di un'ulcera dura) e dopo il trattamento rimane positiva per anni.

Con un livello molto alto di anticorpi contro il treponema nel siero studiato (che è più tipico della sifilide secondaria), è possibile un risultato falso negativo di RPHA (il cosiddetto fenomeno "prozona").

Gli anticorpi specifici dell'agglutinina vengono rilevati nel sangue di persone che hanno avuto la sifilide da molto tempo, pertanto l'RPHA non può essere raccomandato per la diagnosi differenziale della reinfezione o per la determinazione della gravità del processo infettivo.

RPHA non è usato per controllare la guarigione, perché può rimanere positivo molti anni dopo il recupero. Allo stesso tempo, può essere utilizzato come metodo aggiuntivo (al cancro della vescica o RPR) per monitorare l'efficacia del trattamento, esaminando la dinamica della diminuzione dei titoli anticorpali. Un prerequisito per questo è l'uso dello stesso sistema di test RPHA utilizzato durante il primo esame (prima del trattamento) del paziente, nonché la conduzione dello studio nello stesso laboratorio.

6. Sensibilità e specificità di RPHA

RPHA è considerato un test altamente sensibile e specifico. Questa reazione è un test diagnostico prezioso in tutte le forme di sifilide, ma è particolarmente sensibile nelle forme successive della malattia. A seconda dello stadio della malattia, la sensibilità dell'RPHA varia. Nella sifilide primaria, la sensibilità dell'RPHA è del 76% (e superiore), nella sifilide secondaria - fino al 100%. Con latente precoce - 97%, con sifilide tardiva - 94%, con una specificità del 98-100%. La minore sensibilità nelle forme fresche della malattia è spiegata dalla successiva formazione di agglutinine.

Secondo l'istituzione statale TsNIKVI Roszdrav, la sensibilità dell'RPHA nella diagnosi di varie forme di sifilide era del 99,4%. La maggior parte dei ricercatori nota una specificità del 98-99% dell'RPHA.

In termini di sensibilità e specificità, RPHA non è inferiore e nelle forme tardive e nella sifilide congenita supera persino RIF e RIBT.

7. Ambito del metodo RPGA

L'RPHA può essere utilizzato sia come test di screening che come test di conferma; può essere usato semiquantitativamente con il calcolo del titolo anticorpale. Sono stati sviluppati un metodo quantitativo per l'impostazione dell'RPHA, un micrometodo e una reazione di microemoagglutinazione automatizzata.

8. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi di RPGA

Secondo la letteratura, RPHA ha costantemente occupato una posizione di primo piano nella pratica clinica nella maggior parte dei paesi del mondo. RPHA è il test più utilizzato nelle cliniche STI all'estero.

La tecnica RPHA è di facile esecuzione, non richiede attrezzature particolari: per la sua impostazione è necessaria solo una piastra per l'emoagglutinazione. La ricerca non richiede molto tempo; la reazione è altamente sensibile e specifica. L'approvazione del metodo nella pratica clinica ha dimostrato che è estremamente semplice, economico e sensibile. Come IFA, RPGA è semplice da implementare, non richiede personale altamente qualificato e attrezzature speciali e la sua automazione è possibile.

Vantaggi del test RPGA:

semplice nella messa in scena e nell'interpretazione,
non richiede attrezzature speciali,
tempo per ottenere il risultato - 45 minuti,
adatto per lo screening di massa (sono necessari solo 25 μl di siero alla diluizione 1:20),
alto grado di standardizzazione,
la presenza di controlli interni,
lunga durata,
prezzo accettabile
la capacità di automatizzare la contabilità.

Va inoltre notato gli svantaggi dell'RPHA:

la possibilità di reazioni aspecifiche in presenza di anticorpi anti-eritrociti,
mancanza di correlazione tra titolo e stadio della sifilide,
successiva reazione positiva nelle prime fasi della sifilide,
la possibilità di reazioni falsamente positive in persone che hanno assunto alcol, tossicodipendenti,
sensibilità alle vibrazioni e alla temperatura in laboratorio.

I vantaggi di RPGA rispetto a RIBT e RIF sono:

utilizzo di sistemi di test industriali,
la capacità di automatizzare la reazione,
non è necessario lavorare con treponema pallido dal vivo,
non c'è bisogno di un vivaio.

9. Fonti e cause di errori nell'impostazione di RPGA, risultati falsi positivi e falsi negativi

La reazione di emoagglutinazione passiva è uno studio relativamente semplice; quando lo si esegue, è necessario seguire tutte le raccomandazioni dei produttori del diagnosticum e le regole di lavoro nel laboratorio di diagnostica clinica. Gli errori commessi possono portare alla comparsa e alla registrazione di risultati di reazione sia falsi negativi che falsi positivi. Risultati falsi positivi di RPHA possono essere dovuti all'influenza del fattore umano e di fattori di natura biologica.

Si possono ottenere risultati falsi positivi

nello studio dei sieri sanguigni di pazienti con treponematosi non venerea,
a causa del fattore reumatoide
a causa di anticorpi che cross-reagiscono con l'antigene treponemico, che si formano durante vari disordini metabolici sistemici o indotti da farmaci e farmaci,
a causa di livelli anormali di immunoglobuline;
nei neonati - a causa della formazione di anticorpi IgM contro le IgG della madre nel corpo del feto o del bambino, che complica l'interpretazione dei risultati e la diagnosi di sifilide congenita.

Errori causati dall'influenza del fattore di partecipazione umana alla ricerca:

micropiastre contaminate
pipettaggio errato
vibrazioni in laboratorio
la temperatura dell'aria in laboratorio è al di fuori dell'intervallo di temperatura: 18-25 gradi

Gli errori tecnici più tipici nella formulazione dell'RPGA, che portano a risultati inaffidabili, includono:

diluizione imprecisa degli ingredienti,
violazione del regime di temperatura,
violazione del tempo di incubazione dei reagenti,
violazione dei termini per l'applicazione dei reagenti sulla piastra,
incoerenza del pH delle soluzioni con il richiesto,
contaminazione della vetreria di laboratorio.

Anche i seguenti punti tecnici possono essere fonte di errori nella formulazione del RPGA:

esclusione del siero di sangue di controllo dall'impostazione della reazione;
concentrazione irregolare di eritrociti nel diagnostico a causa di una miscelazione insufficiente prima dell'uso;
violazione dei termini e delle condizioni di conservazione del diagnosticum e degli eritrociti di controllo; utilizzo di kit scaduti;
uso di provette contaminate, puntali per pipette, pipette, piastre immunologiche, soluzioni durante l'impostazione delle reazioni;
imprecisioni nella diluizione primaria di un campione di siero sanguigno;
insufficiente completezza dell'esecuzione di successive diluizioni doppie;
inosservanza del regime di temperatura e del tempo di incubazione;
la presenza di vibrazioni estranee e scuotimento della piastra immunologica durante l'incubazione;
violazione della metodologia di impostazione dell'RPHA, espressa nel rifiuto di eseguire lo studio con eritrociti di controllo.

L'uso di plasma sanguigno contenente anticoagulanti in grado di provocare agglutinazione eritrocitaria aspecifica (RPHA) può portare a risultati che non possono essere interpretati.

Il numero di risultati falsi positivi e falsi negativi è inferiore rispetto ad altri test sierologici. LPR durante la stadiazione dell'RPHA sono rari e possibili con treponematosi (imbardata, bejel, pinta). Inoltre, sono stati registrati risultati falsi positivi (meno dell'1% in totale) nei tossicodipendenti, nei pazienti con mononucleosi infettiva, borreliosi, lebbra, nelle collagenosi, cirrosi epatica, linfosarcoma, nonché nelle donne in gravidanza.

Risultati di reazione falsamente negativi possono essere dovuti alla competizione tra anticorpi IgM e IgG. Inoltre, sono possibili risultati falsi negativi nei pazienti con infezione da HIV.

10. Modifiche del metodo RPGA

Esiste una micro e macromodifica della formulazione RPGA, la prima è più spesso utilizzata a causa dell'economia, della velocità di impostazione e registrazione dei risultati.

Inoltre, è stato sviluppato un complesso diagnostico automatico per l'analisi delle immagini, che ha permesso di effettuare una valutazione automatica quantitativa dei risultati ed escludere la soggettività nell'interpretazione dei dati ottenuti. Il complesso hardware-software riconosce l'immagine, elabora i dati e fornisce la risposta in unità relative.

I lettori e gli analizzatori automatici vengono utilizzati anche per automatizzare la registrazione dei risultati RPGA.

TPPA (Treponema pallidum particelle agglutination) - una reazione di agglutinazione di particelle artificiali per la rilevazione di anticorpi contro Treponema pallidum

Riepilogo del test TPPA

Attualmente, per la diagnosi della sifilide, viene utilizzata anche una modifica del metodo di emoagglutinazione passiva - TPPA (Treponema pallidum partition agglutination), in cui l'antigene del treponema pallidum è fissato su particelle di gelatina. Poiché le particelle polimeriche artificiali non hanno i propri antigeni che determinano l'attività biologica, i kit per la sierodiagnostica della sifilide basati su di essi hanno motivo di essere considerati più perfetti. L'uso di particelle artificiali biologicamente inerti riduce al minimo l'agglutinazione aspecifica comunemente osservata con altri vettori.

Il TPPA viene utilizzato per la diagnosi sierologica di anticorpi contro vari tipi e sottospecie di treponemi patogeni. Questo test può essere utilizzato per rilevare gli anticorpi contro gli agenti causali della sifilide, della pinta, del bejel e dell'imbardata.

La procedura di ricerca è molto semplice e non richiede attrezzature speciali: vengono utilizzate micropiastre standard a forma di "U". Il test si basa sull'agglutinazione di particelle gelatinose sensibilizzate con antigeni di T. pallidum, anticorpi contenuti nel siero del sangue del paziente.

TPPA è un test treponemico di conferma utile sia per piccoli conteggi di campioni che per lo screening di massa. Il TPPA viene utilizzato all'estero come test di conferma e in sostituzione del test di microemoagglutinazione MHA-TP (saggio di microemoagglutinazione per anticorpi anti T. pallidum).

Il test TPPA ha una sensibilità dall'85% al 100% e una specificità dal 98% al 100%. La sensibilità TPPA per la sifilide primaria è dell'88%, per la sifilide secondaria e latente tardiva è del 98% -100%.

Se il TPPA viene utilizzato per diagnosticare la sifilide, gli anticorpi contro altri tipi di treponema (come T. pallidum endemicum, pertenue o carateum) possono causare risultati falsi positivi. Sono disponibili numerosi metodi per rimuovere questi anticorpi dai campioni di siero prima di iniziare il test.

Principio del test TPPA

TPPA è un metodo per l'agglutinazione passiva di particelle gelatinose nel siero o plasma umano. Il siero contenente anticorpi contro il treponema patogeno reagisce con particelle gelatinose sensibilizzate con l'antigene del treponema pallidum del ceppo Nichols, esposto agli ultrasuoni. Come risultato della reazione, nel pozzetto della piastra di microtitolazione si forma una pellicola liscia di particelle gelatinose agglutinate.

Se gli anticorpi sono assenti, le particelle si depositano sul fondo della piastra bene, formando un "bottone" compatto di particelle non agglutinate. Anche i pozzetti di controllo con particelle gelatinose non sensibilizzate dovrebbero mostrare un "pulsante" così compatto per ciascun siero, ovvero nessuna agglutinazione.

Applicazione del test TPPA

TPRA è un test universale che può essere ugualmente utilizzato con successo sia per l'esame profilattico obbligatorio di gruppi di popolazione per la sifilide (screening) sia in istituzioni dermatovenerologiche specializzate. Il vantaggio del test TPPA è la sua elevata sensibilità, che non è inferiore ai test classici, che fino a poco tempo fa erano il "gold standard" per la sierodiagnosi della sifilide. Altri vantaggi del test includono l'elevata riproducibilità, nonché la semplicità e la velocità di impostazione della reazione.

Il test TPPA viene utilizzato per confermare i risultati positivi dei test di screening non treponemici per la sifilide, come il test VDRL, e per valutare i pazienti con test non treponemici negativi ma che presentano segni o sintomi indicativi di sifilide tardiva. L'uso del TPPA come unico test di screening per la sifilide non è raccomandato.

Inoltre, il test di agglutinazione TPPA può essere utilizzato per esaminare campioni di liquido cerebrospinale nella diagnosi di neurosifilide. Allo stesso tempo, come in relazione ad altri test sierologici, l'interpretazione dei risultati dovrebbe essere effettuata con una combinazione obbligatoria con altri indicatori e sintomi della malattia.

Risultati del test TPPA

Il risultato viene valutato secondo il sistema "più" - da (-) a (2+). I risultati del test sono visibili ad occhio nudo e vengono interpretati come segue:

Grado di agglutinazione	Punteggio del test	Interpretazione
Le particelle agglutinate rivestono uniformemente il fondo della piastra	2+	Positivo
Grande anello affidabile con margini esterni irregolari e agglutinazione periferica	1+	Positivo
Le particelle formano un anello compatto con un lume al centro e liscio liscio confini esterni	±	Debolmente positivo
Le particelle formano un anello compatto al centro del foro con una leggera fessura al centro e un bordo esterno liscio	–	Negativo
Le particelle formano un "bottone" al centro del foro con un bordo esterno liscio	–	Negativo

L'analisi della redditività viene effettuata per determinare la conformità con la descrizione di cui sopra. I campioni che mostrano un risultato indeterminato (±) devono essere rianalizzati. Se in diversi test TPPA il campione mostra un risultato indeterminato, si consiglia di studiare utilizzando altri metodi.

I risultati dell'analisi non devono essere considerati isolatamente. Ad esempio, in una fase iniziale dell'infezione, il numero di anticorpi è ancora troppo piccolo, per cui il TPPA e molti altri metodi mancano di sensibilità. Pertanto, se si sospetta la sifilide, anche se i risultati del test sono negativi, i campioni devono essere esaminati nuovamente. Per fare una diagnosi, è necessario prendere in considerazione i sintomi clinici del paziente, la storia clinica e altri dati.

Come con la reazione RPHA, il fenomeno della prozona e un risultato falso negativo possono essere osservati per TPPA se il campione di siero contiene un titolo anticorpale troppo alto.

ELISA - Immunoassay

Il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è uno dei tanti metodi di diagnosi sierologica delle malattie infettive. Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) nella sierodiagnosi della sifilide è un test per gli anticorpi delle classi M, G e A (IgM, IgG, IgA) contro gli antigeni del treponema pallidum. Possibile formulazione di ELISA con liquido cerebrospinale.

L'introduzione nella pratica del test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) al posto della reazione di Wasserman e di altri test alla cardiolipina ha notevolmente migliorato la qualità della diagnosi di laboratorio della sifilide. Un vantaggio significativo di questo metodo è la capacità di automatizzare il processo di ricerca, che consente di ridurre l'influenza del fattore umano.

1. Storia del metodo ELISA

I principi di base del saggio di immunoassorbimento enzimatico sulla superficie di un supporto in fase solida sono stati sviluppati da E. Engvar et al. (1971), B. Van Weeman e A. Schuurs (1971). Il test di immunoassorbimento enzimatico sviluppato da loro è stato proposto per la prima volta per la diagnosi della sifilide nel 1975 da J. Veldkamp e A. Visser, che hanno valutato il potenziale di questo test automatizzato. L'ELISA ha iniziato ad essere ampiamente utilizzato nella diagnosi della sifilide negli anni '80, quando sono stati sviluppati e certificati test diagnostici e sono stati standardizzati i metodi di test. In URSS, V.N.Bednova, A.V. Babiy e A.V. Kotrovsky (1982, 1983) hanno sviluppato una tecnica per impostare l'ELISA per la diagnosi della sifilide.

2. Principio del metodo ELISA

Il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) dal meccanismo di reazione è vicino a RIF (vengono rilevati gli stessi anticorpi). La reazione del test di immunoassorbimento enzimatico si riferisce a reazioni immunologiche basate sull'interazione altamente specifica degli antigeni del treponema pallidum con gli anticorpi di un paziente con sifilide.

Nella pratica sifilidologica viene utilizzata principalmente la versione indiretta di ELISA. Il principio della variante di reazione indiretta più frequentemente utilizzata è il seguente. Sulla superficie dei pozzetti della piastra di polistirene sono fissati complessi immunitari, che si formano quando gli anticorpi di un paziente con sifilide interagiscono con gli antigeni del treponema pallidum. Successivamente, vengono identificati in una reazione cromatica utilizzando coniugati specifici e appropriati additivi substrato-cromogeni.

L'ordine del test è il seguente: il siero del paziente viene posto su un supporto in fase solida con un antigene attaccato. Se contiene anticorpi, sulla superficie del vettore si forma un complesso antigene-anticorpo. Per la "manifestazione" dei risultati della reazione vengono utilizzati anticorpi anti-specie alle Ig umane, coniugati con marker enzimatici. In caso di reazione positiva, l'enzima, che si è unito al complesso antigene-anticorpo, decompone il substrato aggiunto al sistema, a seguito del quale si sviluppa una colorazione di diversa intensità.

Nella reazione, la determinazione del complesso di AG e AT adsorbito sulla fase solida viene effettuata utilizzando anticorpi antiglobulina marcati con un enzima, in base alla reazione cromatica dell'enzima con il substrato.

Nella reazione, la determinazione del complesso di antigeni e anticorpi adsorbiti sulla fase solida viene effettuata utilizzando anticorpi antiglobulina marcati con un enzima.

ELISA offre la capacità di rilevare Ig sieriche di classi diverse. Esistono in commercio sistemi che consentono la determinazione separata di IgM e IgG e degli anticorpi totali.

Gli antigeni specifici utilizzati per ELISA possono avere origini diverse:

ultrasonico- sono ottenuti a seguito della distruzione della cellula batterica T. pallidum mediante ultrasuoni o altro metodo;

ricombinante- si ottengono mediante tecnologie di ingegneria genetica introducendo nel genoma di una cellula batterica (ad esempio E. coli E. coli) un gene responsabile della sintesi di uno specifico antigene di T. pallidum, seguito da un aumento della massa batterica di un microrganismo produttore, distruzione di queste cellule, isolamento e purificazione dell'antigene;

peptide- sono ottenuti per sintesi chimica sequenziale di epitopi antigenici delle proteine di T. pallidum.

Il corpo è in grado di formare anticorpi contro quasi tutte le parti della molecola dell'antigene. Questo di solito non accade con una normale risposta immunitaria. Uno o più peptidi immunogenici isolati da un antigene proteico hanno un'antigenicità speciale e la maggior parte degli anticorpi si forma contro di essi. La risposta immunitaria più intensa si sviluppa su di loro. Le regioni immunodominanti delle proteine Treponema pallidum con pesi molecolari di 15 kD, 17 kD e 47 kD hanno mostrato il valore più informativo in ELISA. Come antigene è stato utilizzato un estratto detergente o sonicato di treponemi patogeni del ceppo Nichols.

3. Il metodo di condurre la ricerca con il metodo

Il principio del metodo è identificare uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbito sulla fase solida (la superficie dei pozzetti di una piastra di plastica) con anticorpi antiglobulina marcati con un enzima (perossidasi), utilizzando una reazione di colore con un substrato, quantitativamente preso in considerazione spettrofotometricamente.

Gli antigeni utilizzati per sensibilizzare i pozzetti di una piastra di polistirene possono essere:

lisato- ottenuto a seguito della distruzione del treponema pallido mediante ultrasuoni;
peptide- ottenuto a seguito della sintesi chimica di frammenti proteici del treponema pallido e aventi reattività antigenica simile alle proteine originarie del patogeno;
ricombinante- ottenuti con metodi di ingegneria genetica, portatori di determinanti antigenici identici al treponema pallidum.

Nella pratica sifilidologica viene solitamente utilizzata una versione indiretta di ELISA.

4. Contabilità dei risultati

In ELISA, la reazione di un enzima (fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano) con un substrato viene utilizzata per visualizzare la reazione antigene-anticorpo, che cambia colore. L'intensità del colore determina la positività della reazione (da "-" a "++++"). I risultati ELISA possono essere valutati visivamente utilizzando un sistema a 4 punti o strumentalmente sotto forma di letture digitali della densità ottica ottenute su lettori speciali (come Multiscan) alla lunghezza d'onda di 492 nm. Perché la valutazione dei risultati viene effettuata spettrofotometricamente, questo esclude l'interpretazione soggettiva.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare

La tempistica del positivo ELISA è dalla 4a settimana dall'infezione. I risultati ELISA (come RIF) diventano positivi nei primi giorni del periodo primario o alla fine dell'incubazione e rimangono positivi in tutti i periodi. L'ELISA è particolarmente utile nella diagnosi precoce della sifilide: i risultati positivi del rilevamento degli anticorpi possono essere ottenuti già alla fine del periodo di incubazione della malattia (cioè a 4-6 settimane dopo l'infezione).

6. Sensibilità e specificità

ELISA è un test altamente sensibile e specifico, che è il suo vantaggio. ELISA in termini di meccanismo di reazione, sensibilità e specificità è vicino a RIF, perché gli stessi anticorpi sono coinvolti in entrambe le reazioni. La maggior parte dei ricercatori nota un'elevata specificità e sensibilità in tutte le fasi della malattia. La sensibilità di varie varianti ELISA, secondo GA Dmitriev, raggiunge il 98-100% e la specificità è del 96-100%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità di ELISA per la sifilide è del 99,1% (Ordine n. 87 M3 RF).

Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è una delle reazioni sierologiche più sensibili, consentendo la rilevazione di anticorpi da 0,0005 μg/ml e antigeni da 0,00005 μg/ml.

7. Ambito del metodo

Il metodo è raccomandato per l'uso durante l'esame di donne in gravidanza, persone di contatto, donatori e rappresentanti di gruppi a rischio. ELISA può essere utilizzato sia come test di screening che come test di conferma. In un tempo relativamente breve nella sua storia, ELISA si è evoluto da test indicativo a test di conferma. Nella diagnosi di sifilide, il test viene utilizzato anche come conferma per i campioni che mostrano risultati positivi utilizzando vari test non treponemici e RPHA.

Il metodo ELISA può essere utilizzato in versione quantitativa con il calcolo dell'indice di positività, o reattività, che permette di valutare il livello di anticorpi nel campione.

Attualmente in Russia l'uso del test immunoenzimatico per la diagnosi della sifilide è regolato dall'Ordine del Ministero della Salute della Federazione Russa n. 87 del 26 marzo 2001 "Sul miglioramento della diagnosi sierologica della sifilide" (Appendice n. 1 "Impostazione di screening e test diagnostici per la sifilide"). L'ordine prevede di sostituire l'RSK nel complesso di sieroreazione (CSR) con ELISA e RPGA.

8. Fonti e cause di errori di stadiazione, risultati falsi positivi e falsi negativi

Il test immunoenzimatico è uno studio complesso a più stadi, in cui è necessario seguire rigorosamente tutte le raccomandazioni dei produttori di kit diagnostici, le regole per la regolazione e la regolazione delle apparecchiature utilizzate nello studio.

I seguenti punti possono essere fonte di errori durante l'impostazione di ELISA:

Ricerca nella reazione di siero sanguigno iperlipidemico, emolizzato o campioni con segni di crescita batterica;

Non eseguire due o più congelamenti di un campione di materiale biologico, se necessario, utilizzare il siero di una provetta duplicata se è necessario ripetere il test;

Violazione dei termini e delle condizioni di conservazione dell'immunosorbente e della soluzione di lavaggio; utilizzo di kit di test scaduti;

Applicazione di componenti di reazione da altri kit diagnostici;

Violazione dei tempi delle fasi della reazione;

Essiccazione dei pozzetti della piastra immunologica nelle fasi della reazione;

Riutilizzo di piatti di plastica (vassoi di plastica) per la preparazione di una miscela di cromogeno e substrato;

Mancato rispetto della frequenza di controllo metrologico dei parametri di funzionamento dei dispositivi utilizzati (lavatrice e spettrofotometro);

Utilizzo di vetreria di laboratorio contaminata durante l'impostazione delle reazioni: matracci, cilindri graduati, provette, pipette, puntali per pipette;

Mancanza di accuratezza nell'eseguire diluizioni di campioni di materiale biologico;

Errori nell'introduzione di un campione di materiale biologico nel corrispondente pozzetto della piastra;

Errori durante il trasferimento dei risultati dello studio al registro, al protocollo di studio o al modulo di risposta.

L'attenta attuazione delle raccomandazioni delle istruzioni per l'uso dei kit di test diagnostici, la verifica regolare dell'accuratezza dei dispensatori di pipette e dei dispositivi automatici, l'uso di controlli interni positivi e negativi consentono di ottenere risultati ELISA con elevata riproducibilità.

9. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi

ELISA si riferisce a metodi moderni e promettenti di sierodiagnosi della sifilide per la sua semplicità, riproducibilità, disponibilità. La determinazione degli anticorpi mediante ELISA è un metodo diagnostico ideale adatto per l'esame simultaneo di un gran numero di campioni. Grazie ai suoi vantaggi, ha guadagnato popolarità in tutti i paesi.

La tecnologia ELISA prevede il rispetto di tutte le raccomandazioni dei produttori di kit di test diagnostici commerciali e la completezza della procedura di ricerca. Per svolgere studi in IFA, è necessario acquistare attrezzature speciali aggiuntive. La tecnica di impostazione richiede più tempo rispetto a RMP, RPR e RPHA.

La presenza dell'automazione di più fasi o dell'intero processo nel suo insieme consente di esaminare contemporaneamente un gran numero di campioni di materiale biologico con un alto grado di standardizzazione della ricerca, riducendo al minimo l'elemento soggettivo nella valutazione dei risultati, la possibilità di memorizzare ricerche fisse protocolli, che consente di archiviare i dati di ricerca e di fare nuovamente riferimento ad essi per analisi retrospettive.

vantaggi:

Consente la determinazione differenziata e totale degli anticorpi IgM e IgG contro l'agente eziologico della sifilide.
elevata sensibilità e specificità, che si avvicina al 100%,
riproducibilità
capacità di automazione

I vantaggi di ELISA includono un'elevata specificità (96-100%) e sensibilità (98-100%), rilevate dalla maggior parte dei ricercatori.

La presenza dell'automazione di un numero di fasi o dell'intero processo nel suo insieme consente di studiare contemporaneamente il flusso con un gran numero di campioni di materiale biologico con un alto grado di standardizzazione della ricerca, minimizzazione dell'elemento soggettivo nella valutazione di i risultati, la possibilità di memorizzare protocolli di ricerca fissi che consentono di archiviare i dati di ricerca e di farvi nuovamente riferimento per analisi retrospettive...

Svantaggi significativi delle tecniche manuali, inclusa la determinazione degli anticorpi contro gli antigeni di T. pallidum mediante ELISA, sono:

~ possibili errori del personale durante la ricerca (svista, negligenza, violazione della tecnologia);

~ impossibilità di una completa standardizzazione del processo di ricerca con una versione manuale di ELISA;

~ aumento del rischio di infezione del personale.

10. Modifiche del metodo

Insieme al classico ELISA indiretto, è noto anche il metodo trappola ELISA... È stato proposto nel 1989 da O. E. Ijsselmudien et al. per rilevare gli anticorpi IgM contro gli antigeni Tr. pallido. Il metodo è altamente specifico e sensibile.

Sulla superficie dei pozzetti della piastra vengono adsorbiti anticorpi purificati contro le immunoglobuline umane di classe M e, dopo l'incubazione del siero in esame, tutte le IgM si legano al vettore. La presenza tra gli antigeni IgM associati specifici Tr. pallidum viene rilevato utilizzando antigeni Tr. pallidum coniugato con un enzima.

Questo metodo consente di rilevare gli anticorpi non solo della classe IgM, ma anche delle classi IgG, IgA. Per questo, i pozzetti delle piastre sono sensibilizzati con anticorpi purificati per affinità di una certa classe contro le immunoglobuline umane. In questo caso, gli anticorpi di questa classe vengono catturati dal siero e il rilevamento degli anticorpi treponemici viene effettuato mediante la loro connessione con un coniugato che rappresenta la connessione di un antigene treponemico con un enzima.

L'uso di una versione trap del test immunoenzimatico riduce il rischio di reazioni falsamente positive mediate dal fattore sanguigno reumatoide, reazioni crociate tra immunoglobuline delle classi M e G. Quando si esaminano i neonati, in questo caso, risultati falsi positivi dell'analisi associati al sono escluse anche la rilevazione di IgM dirette contro le IgG antitreponemiche materne.

Sono ampiamente utilizzati come opzioni ELISA all'estero. saggio immunitario enzimatico (EIA) e il sistema Sifilide ICE... In quest'ultimo, nei pozzetti della piastra viene assorbita una miscela di anticorpi contro IgM e IgG, nonché tre proteine ricombinanti di T. pallidum. I risultati positivi vengono testati nello stesso sistema di test in due ripetizioni per fornire il risultato finale.

In Russia sono stati sviluppati numerosi sistemi di test per la sierodiagnosi della sifilide mediante ELISA con reagenti domestici. Questi sistemi sono altamente specifici e sensibili.

Oltre a quanto sopra, ci sono anche altre opzioni ELISA, comprese quelle che consentono il rilevamento diretto del patogeno nel sangue (ELISA diretto), dot-ELISA con una reazione su strisce di nitrocellulosa, ELISA con sangue capillare, nonché immunoblotting, o Western Blot, con rilevamento simultaneo di AT a vari componenti del patogeno.

Una moderna modifica migliorata di ELISA è l'immunoblotting.

ICA (saggio di immunochemiluminescenza), ICL (immunochemiluminescenza)

Con lo sviluppo della diagnostica di laboratorio nel contesto della modernizzazione dell'assistenza sanitaria nella Federazione Russa, l'automazione della ricerca di laboratorio è entrata nella pratica dei laboratori, il che consente di standardizzare le fasi analitiche della ricerca. Ciò migliora la qualità della diagnostica. Con l'introduzione dell'automazione, iniziarono ad essere utilizzati nuovi metodi ad alta tecnologia con elevata sensibilità e specificità, come il dosaggio immunologico in chemiluminescenza (CLIA)

La chemiluminescenza è il processo di emissione di fotoni durante la transizione dei prodotti elettronicamente eccitati delle reazioni chimiche ossidative al loro stato energetico iniziale. Durante la reazione di chemiluminescenza viene rilasciata una quantità significativa di energia e la resa quantica della luce emessa è piuttosto elevata. Di tutti i metodi non isotopici, la chemiluminescenza fornisce la massima sensibilità. Per i metodi immunometrici, la sensibilità della chemiluminescenza è di ordini di grandezza superiore alla sensibilità del dosaggio radioimmunologico.

Il metodo dell'immunochemiluminescenza (ICL) ha ora trovato la sua applicazione nella diagnosi di marcatori di tumori, malattie autoimmuni, diabete, marcatori cardiaci, ormoni (tiroide, ghiandole surrenali, ormoni sessuali femminili e maschili), infezioni da torcia, epatite virale, herpes di gruppo virus.

Sulla base del metodo dell'immunochemiluminescenza, sono stati sviluppati numerosi sistemi di test altamente sensibili e specifici (98-100%) per la diagnosi della sifilide, che vengono utilizzati principalmente all'estero.

Il metodo utilizza lipoproteine ricombinanti geneticamente modificate come antigeni, che sono analoghi completi degli antigeni di T. pallidum.

Sulla base dei risultati di uno studio clinico, il metodo ICA ha ricevuto il riconoscimento ed è raccomandato per l'uso nella diagnosi di laboratorio della sifilide nella Federazione Russa come test di screening e conferma se i laboratori dispongono dell'attrezzatura appropriata. Nel 2012, l'ICA è stata inclusa come test di screening e di conferma per la diagnosi di sifilide nelle Linee guida cliniche per la gestione dei pazienti con infezioni a trasmissione sessuale e infezioni urogenitali.

Pertanto, l'uso dell'ICA ad alta tecnologia, che è entrato nella pratica della diagnostica di laboratorio sia mondiale che domestica con l'introduzione dell'automazione, offre i seguenti vantaggi:

esclusione dell'influenza di fattori soggettivi nella fase analitica dello studio
sicurezza del personale durante l'esecuzione di ricerche su materiale biologico potenzialmente infetto
aumentando la velocità di ottenimento dei risultati da parte del paziente
standardizzazione della ricerca e controllo della qualità della ricerca
consegna di risultati affidabili affidabili ai pazienti
ricerca clinica di laboratorio di alta qualità.

In termini di sensibilità, il metodo ICA è paragonabile al metodo del dosaggio radioimmunologico, e in termini di semplicità di esecuzione, sicurezza per il personale e molti altri parametri, lo supera.

Il metodo ICA, che ha un'elevata sensibilità e specificità (98-100%), consente di determinare quantitativamente il livello di anticorpi contro l'agente eziologico della sifilide e può essere utilizzato per confermare l'infezione e lo screening sifilitici. Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.

Immunocromatografia (IHG).

I metodi per rilevare gli anticorpi specifici del treponema basati sui metodi dell'immunocromatografia (IHG) sono relativamente nuovi per l'uso nella Federazione Russa. Come nel metodo ICA, come antigeni vengono utilizzate lipoproteine ricombinanti ottenute con metodi di ingegneria genetica (ad esempio antigeni Tp15, Tp17, Tp47) e il peptide biosintetico TmpA. Gli antigeni elencati sono anche utilizzati in varie combinazioni nella composizione di immunosorbenti in ELISA e immunoblotting.

Il metodo IHG consente di determinare rapidamente il contenuto di anticorpi specifici del treponema per l'agente eziologico della sifilide in campioni di siero e sangue intero senza l'uso di attrezzature di laboratorio speciali e viene utilizzato nella fornitura di assistenza sanitaria di base, anche per indicazioni epidemiologiche.

Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.

PBT (test semplici e rapidi al capezzale)

Relativamente di recente, nella sierodiagnosi della sifilide, ha iniziato a svilupparsi una direzione sullo sviluppo dei cosiddetti test rapidi semplici (PBT), o test al capezzale del paziente (Point-of-care - POC). Semplici test rapidi al letto del paziente, o test immunocromatografici, consentono una rapida determinazione del contenuto di anticorpi treponemospecifici per l'agente eziologico della sifilide in campioni di siero e sangue intero senza l'uso di attrezzature di laboratorio speciali e possono essere utilizzati nella fornitura di assistenza sanitaria di base, incluso per indicazioni epidemiologiche. Limitazioni d'uso: non possono essere utilizzati per monitorare l'efficacia della terapia, possono dare un risultato falso positivo.

Questi test si basano sulla determinazione immunocromatografica degli anticorpi contro gli antigeni treponemici del treponema pallidum I vengono eseguiti su strisce; possono essere utilizzati sia sangue intero che siero (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Il formato del test consente di condurre ricerche in assenza di attrezzature speciali e senza l'uso di elettricità. Tuttavia, a causa della sensibilità e della specificità relativamente basse, questi test non sono ancora ampiamente utilizzati nella pratica.

Immunoblotting (Western Blot)

Negli ultimi anni sono emersi metodi di ricerca volti a rilevare e analizzare il contenuto di anticorpi. a ciascun antigene treponema pallido separatamente. Uno di questi metodi è il metodo di immunoblot (o blotting, immunoblotting, Western blot), che viene utilizzato per determinare gli anticorpi IgG o IgM contro il treponema pallidum. Il metodo di immunoblotting è una modifica del test immunoassorbente legato all'enzima, una variante dell'ELISA.

L'immunoblotting è uno dei metodi più moderni di sierodiagnosi della sifilide ed è attivamente utilizzato all'estero. Ha preso il nome ("Western blotting") come risposta umoristica ai nomi delle tecniche per la determinazione del DNA ("Southern blotting") e dell'RNA ("Northern blotting").

1. Storia del metodo

L'immunoblotting (Western blot) viene utilizzato per determinare gli anticorpi IgG o IgM contro gli antigeni del treponema pallidum (Herremans M. et al., 2007).

2. Immunoblot classico

Immunoblot classico(Western Blot Analysis) combina il dosaggio immunoenzimatico e il metodo elettroforetico. Gli antigeni proteici dell'agente eziologico della sifilide vengono preliminarmente separati mediante elettroforesi e trasferiti su un supporto: una membrana di nitrocellulosa (striscia). Questo trasferimento è chiamato blotting. Quindi questo vettore con punti divisi (blot), viene trattato con il siero in esame e gli anticorpi IgG o IgM, marcato con enzimi o sostanze radioattive. Il metodo prevede l'uso di proteine del treponema naturali o ricombinanti.

elettroforesiè la separazione di composti carichi in base alla loro mobilità in un campo elettroforetico. Quando viene applicata una differenza di potenziale in un mezzo, le molecole caricate positivamente si spostano su un elettrodo caricato negativamente e quelle caricate negativamente si spostano su un elettrodo positivo.

La maggior parte delle proteine globulari è assemblata in modo tale che la maggior parte dei gruppi carichi, cioè quelli idrofili, si trovino sulla superficie della proteina, mentre i residui idrofobici non carichi sono immersi all'interno del globulo. In un campo elettrico, in accordo con la loro carica, le proteine migrano verso l'elettrodo di carica opposta.

La separazione elettroforetica delle proteine viene effettuata in un mezzo gel sintetico a base di poliacrilammide. Per separare le proteine in base al loro peso molecolare, prima dell'inizio dell'elettroforesi, la miscela proteica viene preincubata in presenza di sodio dodecil solfato (SDS).

Studi dettagliati di scienziati stranieri Weber e Osborn (1969) hanno mostrato che dopo un tale trattamento, l'unico fattore che può influenzare la mobilità delle proteine nel gel di poliacrilammide (PAGE) è la dimensione della proteina, o meglio il suo peso molecolare. Ciò ha permesso di applicare il metodo dell'elettroforesi in PAGE in presenza di SDS per una determinazione sufficientemente accurata del peso molecolare di proteine e peptidi. Nella letteratura straniera questo metodo era chiamato SDS-PAGE (elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide).

Profilo di reattività nel classico test WB con antigeni naturali (elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecilsolfato). (1) - risultato positivo del controllo, (2) - risultato negativo del controllo, (3-6) - campioni clinici.

Nei test per la sifilide che utilizzano questo metodo, il treponema pallido, precedentemente purificato e distrutto nei suoi componenti costitutivi, viene sottoposto a elettroforesi in gel di poliacrilammide o agarosio. In questo caso, gli antigeni inclusi nella sua composizione sono separati per peso molecolare.

Quindi, mediante elettroforesi verticale, gli antigeni vengono trasferiti su una striscia di nitrocellulosa, che d'ora in poi contiene uno spettro di bande antigeniche invisibili all'occhio, caratteristiche del treponema pallido.

Durante l'analisi, il materiale in esame (siero, plasma sanguigno del paziente, ecc.) viene applicato su una striscia di nitrocellulosa (striscia). Se il campione contiene anticorpi specifici, durante l'incubazione si legano saldamente a bande antigeniche (complementari) strettamente corrispondenti e formano un complesso antigene-anticorpo.

Dopo la rimozione delle immunoglobuline non legate durante il lavaggio delle strisce, segue l'incubazione con anticorpi marcati con enzima contro le immunoglobuline umane (anticorpi contro IgG o IgM umane), durante la quale gli anticorpi marcati con enzimi sono attaccati ai complessi antigene-anticorpo esistenti sulla superficie della membrana.

Dopo la rimozione del coniugato non legato durante l'incubazione con la soluzione del substrato, l'enzima interagisce con il substrato, provocando una reazione cromatica - colorazione delle sezioni della membrana (sotto forma di strisce) in cui si trovano i singoli antigeni del treponema pallidum, anticorpi contro i quali erano presenti il siero di prova. L'intensità della colorazione dipende dalla quantità di anticorpi legati dal siero. Il risultato della reazione viene valutato visivamente.

La presenza di bande in alcune aree della piastra di nitrocellulosa conferma la presenza di anticorpi contro antigeni rigorosamente definiti di treponema pallidum nel siero studiato.

Gli immunodeterminanti 15, 5, 17, 44.5, 47 kD determinati con questo metodo hanno valore diagnostico nella sifilide. L'immunoblotting Ig G è simile per sensibilità e specificità al RIF con assorbimento (RIF abs). L'immunoblotting Ig M può servire come test diagnostico per la sifilide congenita.

3. Immunoblot nel formato dell'analisi immunitaria lineare

Il test immunologico lineare (LIA) consente la determinazione simultanea degli anticorpi contro gli antigeni del Treponema pallidum nel siero o plasma umano. Gli antigeni sono prestampati su strisce reattive (strisce), fornite come parte di kit diagnostici commerciali.

Le strisce sono costituite da membrana di nitrocellulosa, membrana di poliammide con supporto in plastica o membrana di nylon con supporto in plastica. Durante la produzione, diversi antigeni discreti vengono posizionati sulla striscia reattiva come linee antigeniche separate. Oltre a questi antigeni della sifilide, a ciascuna corsia vengono applicate altre quattro linee di controllo: streptavidina e campioni di controllo (3 +, 1 + e ± linea di taglio).

Per le strisce vengono utilizzati antigeni artificiali ottenuti con metodi di ingegneria genetica: proteine ricombinanti o costrutti polipeptidi sintetici. Questi sono analoghi degli antigeni di superficie del treponema pallido - TpN15, TpN17, TpN47 e TmpA con pesi molecolari di 15, 17, 47 kDa e 44,5 (TmpA), dove kDa = kiloDalton. Con il loro aiuto vengono determinati gli anticorpi sierici contro vari componenti immunodominanti dell'agente patogeno.

L'incubazione del campione in esame avviene in una cuvetta dove è posta anche la striscia reattiva. Gli anticorpi anti T. pallidum vengono determinati legandosi agli antigeni rivestiti sulle strisce reattive. Se il campione contiene anticorpi specifici per T. pallidum, formano legami con singole linee di antigeni. Quando gli anticorpi contenuti nel siero del test interagiscono con antigeni discreti di T. pallidum posti sulla striscia reattiva, si forma un complesso antigene-anticorpo sotto forma di strisce colorate rilevabili visivamente.

Tenendo conto dei risultati dell'immunoblotting, la reattività del siero a ciascuno degli antigeni viene valutata separatamente. Una risposta complessivamente positiva viene emessa quando si ottiene un risultato contemporaneamente con due o tre degli antigeni presentati.

Le procedure di ricerca vengono eseguite manualmente o su un analizzatore speciale, con l'interpretazione dei risultati utilizzando un programma informatico specializzato per le malattie infettive.

A causa dell'alto grado di purificazione degli antigeni ricombinanti e del rilevamento simultaneo di anticorpi contro i determinanti più immunogenici dell'agente eziologico della sifilide, il metodo ha un'elevata sensibilità e specificità.

4. Contabilità dei risultati

Per leggere l'intensità della colorazione delle bande antigeniche sulle strisce, sono stati sviluppati fotometri, il cui funzionamento si basa sulla riflessione del segnale, che esclude la valutazione soggettiva e offre il potenziale per l'automazione.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare

I test che utilizzano il metodo Western blotting possono rilevare anticorpi specifici contro gli antigeni del Treponema pallidum in una fase molto precoce della malattia. I più significativi nella diagnosi della sifilide sono gli anticorpi contro gli antigeni pallidi del treponema TpN15, TpN17, TmpA e TpN47. Questi antigeni sono proteine di membrana con pesi molecolari rispettivamente di 15, 17, 44,5 e 47 kDa.

Quando il treponema pallido viene introdotto nel corpo umano, gli anticorpi anti-sifilitici compaiono in questo ordine: prima si sviluppa una risposta immunitaria agli antigeni TpN17, quindi a TpN47, dopo TpN15 e successivamente a tutti i TmpA. Quando si prendono in considerazione i risultati del test, la reattività del siero a ciascuno di essi viene valutata separatamente. Ad esempio, quando in un linear blot c'è reattività solo alla linea antigenica TpN17 e TpN47, significa che la malattia è nella sua fase iniziale. Più le linee antigeniche diventano reattive, più l'infezione si sviluppa. Quando si tratta la sifilide, il modello di reattività in questo test cambia.

La determinazione delle IgM alle proteine con un peso molecolare di 15,17, 41, 47 kDa consente di identificare il 29,2% dei pazienti con sifilide secondaria, il 12,5% - con sifilide latente precoce e l'8,0% - con sieroresistenza. La ricerca delle IgG alle stesse molecole è caratterizzata da una sensibilità del 61,6% per la sieroresistenza e del 100% per la sifilide secondaria e latente precoce.

6. Sensibilità e specificità

Secondo i dati della letteratura, la sensibilità e la specificità del test sono molto elevate - rispettivamente 99,6-100 e 99,3-99,5%. Nel metodo classico, ciò si ottiene attraverso la separazione elettroforetica di proteine, glico- e lipoproteine e la massima specificità di rilevare sieri immuni o anticorpi monoclonali. In condizioni di lavoro ottimali, l'immunoblotting può rilevare l'antigene in quantità inferiori a 1 ng nel volume del test.

Anche la sensibilità del linear blot è del 99,6% e la specificità varia tra il 99,3% e il 99,5%.

Secondo gli esperti, l'immunoblotting con antigeni altamente specifici ricombinanti è simile per sensibilità e specificità ai RIF-abs.

Secondo i dati della letteratura straniera e i risultati di uno studio presso TsNIKVI, il metodo di immunoblotting nella diagnosi della sifilide ha un'elevata sensibilità (98,8-100%) e specificità (97,1-100%).

7. Ambito del metodo

L'immunoblotting (immunoblotting) è un metodo di riferimento altamente specifico e altamente sensibile. L'elevata sensibilità e specificità consentono di considerare questo metodo come un test di conferma per la sifilide. Il metodo può essere utilizzato per confermare la diagnosi, così come se altri test treponemici danno risultati discutibili e contrastanti. Con l'aiuto dell'immunoblotting, è possibile confermare la diagnosi in pazienti con risultati del test positivi o incerti ottenuti, anche con l'aiuto di RPHA o ELISA.

8. Fonti e cause di errori di stadiazione, risultati falsi positivi e falsi negativi

I risultati falsi positivi sono molto rari. Anche i risultati falsi negativi sono piuttosto rari e si osservano in pazienti con immunodeficienze - più spesso nell'infezione da HIV e con l'effetto di una "finestra" diagnostica a causa di un ritardo nella sintesi degli anticorpi, nonché in caso di errori nella fase di collocamento.

L'uso di moderni sistemi di prova impone l'esatta osservanza di tutti i requisiti sia per il materiale che per le prestazioni della reazione. Fondamentalmente, la fonte degli errori è una violazione dell'ordine e della tecnologia dello studio (soprattutto per il classico Western blot), il mancato rispetto delle raccomandazioni dei produttori di kit di test. ... Possono essere commessi errori anche nella raccolta, consegna, conservazione dei campioni di siero e nell'esecuzione dei test. Oltre ai campioni rovinati, altre possibili cause includono l'uso di kit di test scaduti ed errori nell'analisi dei risultati dei test.

9. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi

L'unicità dell'immunoblot risiede nel suo alto contenuto di informazioni e nell'affidabilità dei risultati.

Il test non richiede antigeni altamente purificati, sieri di riferimento e di controllo. L'identificazione di un bersaglio anticorpale si basa sul peso molecolare della proteina con cui reagiscono gli anticorpi del siero del paziente. In una singola reazione, è possibile rilevare il legame di anticorpi a diversi antigeni, ciascuno dei quali può essere caratterizzato con precisione. A causa di ciò, l'immunoblotting presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi per rilevare gli anticorpi, i cui risultati dipendono dalla standardizzazione, dalla sensibilità, dalla qualità del substrato, dall'instabilità o dall'insolubilità di determinati antigeni.

Il metodo è facilmente riproducibile, relativamente semplice nell'esecuzione e nell'interpretazione dei risultati, consente di determinare lo spettro di anticorpi a più antigeni di T. pallidum contemporaneamente e di valutare il contributo di anticorpi di diversa specificità alla reazione complessiva.

L'uso di antigeni peptidici e ricombinanti altamente purificati riduce al minimo la reattività aspecifica dei sieri. L'uso del metodo consente di abbandonare metodi soggettivi e laboriosi che rappresentano un pericolo per il ricercatore (inoculazione di ceppi di G. pallidum, lavoro con T. pallidum patogeno durante la messa in scena di una reazione). Ciò determina la preferenza del metodo immunoblotting rispetto ad altri test treponemici (RIF e soprattutto RIBT) per la diagnosi di sifilide.

10. Modifiche del metodo

Esistono diversi sistemi di test commerciali basati su questo metodo. Alcuni di loro sono realizzati nel formato macchia occidentale, sono costituiti da strisce su cui vengono trasferiti i componenti proteici di T. pallidum, preventivamente separati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide.

Altri sono nel formato macchia lineare, sono costituiti da strisce su cui vengono adsorbiti polipeptidi ricombinanti e sintetici, analoghi degli antigeni di superficie di T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 e TmpA, sotto forma di linee discrete.

I risultati del Western blot sono più difficili da interpretare poiché sulle strisce viene rilevata un'ampia varietà di anticorpi, molti dei quali sono specifici del gruppo. Al contrario, l'interpretazione dei risultati della macchia lineare è semplice; inoltre, ulteriori linee di controllo tracciate sulla striscia consentono una valutazione semiquantitativa del livello di anticorpi contro i quattro antigeni di T. pallidum.

tecnologia xMAP

хMAP è una tecnologia moderna che consente studi multiparametrici mediante il rilevamento simultaneo di più analiti in un campione biologico. Come fase solida si utilizzano microsfere colorate ricoperte di reagenti catturanti (oligonucleotidi, anticorpi, antigeni).

Il campione in esame viene aggiunto alla soluzione contenente le microsfere. Gli analiti rilevati nel campione si legano alla corrispondente microsfera, dopodiché alla soluzione viene aggiunto un agente di rilevamento (anticorpo di rilevamento, etichetta fluorescente). Per la rilevazione dell'analita in determinazione viene utilizzato un sistema di due laser, che consente sia una valutazione qualitativa della presenza di un analita in un campione (per questo viene utilizzato un laser rosso, che classifica le microsfere per colore), sia una valutazione quantitativa del contenuto di analita in un campione (per questo viene utilizzato un laser verde).

Lo studio viene effettuato in modalità automatica su analizzatori quali Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) dotati di software.

La produttività della tecnologia xMAP supera significativamente le prestazioni del classico test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) con un volume di biomateriale significativamente inferiore.

La tecnologia xMAP, che ha un'elevata sensibilità analitica, è attualmente utilizzata per risolvere un'ampia gamma di problemi clinici. Con il suo aiuto, in un campione di materiale biologico, viene eseguita la rilevazione simultanea di marcatori tumorali noti, marcatori cardiaci, marcatori della fase acuta e del diabete mellito, un'ampia gamma di citochine, chemochine e fattori di crescita. Il rilevamento simultaneo di più analiti in un campione biologico può ridurre significativamente il tempo di esame del paziente. Ad oggi, sono stati sviluppati numerosi sistemi di test per rilevare gli anticorpi contro i patogeni STI, in particolare l'infezione sifilitica, utilizzando il metodo xMAP.

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La sifilide è una malattia infettiva che può essere contratta attraverso il contatto sessuale. L'agente eziologico della malattia è un batterio come il treponema pallido (spirocheta), che colpisce gli organi interni, le mucose e la pelle.

Per identificare la malattia, vengono utilizzati esami del sangue e, in alcuni casi, il liquido cerebrospinale. I risultati sono indicati da più o vengono utilizzati incroci da 1 a 4.

La sifilide a quattro croci è considerata la fase più pericolosa per l'uomo. L'interpretazione delle analisi e della diagnosi è determinata esclusivamente dal medico.

Quattro fasi della malattia e le loro caratteristiche

La determinazione di una malattia a trasmissione sessuale viene effettuata studiando il sangue per la presenza di treponema.

Questo metodo per riconoscere la sifilide utilizzando un test sierologico è il più comune di molti test.

L'immunologo ha creato un sistema speciale per caratterizzare la malattia, in cui le croci indicano la quantità di anticorpi. È importante sapere che la malattia stessa non li contiene, ma sono presenti treponemi, ulcere e un'eruzione sifilitica.

Un aumento del titolo anticorpale indica la riproduzione attiva del patogeno e le croci sono contenute in qualsiasi analisi con una valutazione positiva della presenza di anticorpi. Considera le fasi della malattia e le loro caratteristiche.

Sifilide una croce

Se ci sono croci, la sifilide è positiva, tuttavia, ci sono dubbi anche osservando gli anticorpi nel sangue per combattere la malattia.

Pertanto, i medici chiamano dubbioso questo risultato del test. Spesso, il risultato di un test può indicare un'altra condizione medica.

Un risultato di 1+ significa che è passato poco tempo dalla fase di infezione. Il vantaggio può essere presente dopo il trattamento completo, quando gli anticorpi sono stati preservati.

Sifilide due croci

Due croci indicano un risultato positivo, che indica la presenza di treponema nel sangue.

Un aumento del titolo indica una bassa concentrazione nel sangue. Quindi, è necessario esaminare il batterio per approvare la conclusione 2 più prima di iniziare la terapia.

Sifilide tre croci

Un esame del sangue con un punteggio di tre croci indica un risultato positivo e non può essere confutato. Uno studio ripetuto del sangue conferma solo la diagnosi della 3a croce, che è caratteristica della malattia nell'II stadio di sviluppo.

Sifilide quattro croci

La conclusione più sfavorevole è il risultato della quarta croce. Ma questo non significa affatto che la malattia non possa essere curata.

Questa fase è caratterizzata da un'eruzione cutanea evidente, perdita di capelli e un aumento della temperatura corporea. Il numero di anticorpi è ad un livello elevato, quindi la conclusione è fuori dubbio.

Come si svolge l'esame?

Il riconoscimento della sifilide viene effettuato in due fasi, iniziando con l'esame del paziente e finendo con lo studio del sangue per gli anticorpi.

Il medico esamina il paziente, determinando già la probabilità della presenza della malattia:

rilevamento di ulcere sui genitali o nella cavità orale;
eruzioni cutanee dermatologiche, indurimento;
calvizie nella zona della testa.

Il medico chiarisce le informazioni dal paziente, sulla base di domande sulla presenza di rapporti sospetti o sul trattamento di una malattia venerea.

Esami di laboratorio

Oggi uno studio per identificare la malattia della sifilide 4 della croce può essere superato in molti modi, i più famosi sono presentati di seguito:

RPR - un test che rileva gli anticorpi nel sangue contro i fosfolipidi della membrana citoplasmatica;
La RIF (reazione di immunofluorescenza) è una reazione più sensibile, poiché mostra un risultato con valutazione positiva già al primo stadio nell'80% dei pazienti;
RW (il metodo dell'immunologo tedesco Wasserman) è un metodo di ricerca veloce e affidabile che consente di effettuare un esame e prescrivere farmaci efficaci;
saggio immunoenzimatico del sangue;
la reazione si basa sul fenomeno dell'immobilizzazione dei batteri da parte di anticorpi come le immobilizine;
l'emoagglutinazione passiva mostra la presenza e la quantità di anticorpi.

Oggi la sifilide può essere curata in qualsiasi momento. Ma è molto più facile tollerare il trattamento alle prime manifestazioni della malattia, quando l'infezione non ha colpito l'intero corpo.

La durata del trattamento e i farmaci sono prescritti da un venereologo in base alle caratteristiche individuali del corpo umano e allo stadio della lesione.

Non dimenticare che la migliore prevenzione della sifilide è una stretta relazione con un partner a lungo termine della cui salute sei completamente sicuro.

L'analisi RPGA è una tecnica che è una delle più importanti tra gli altri esami del sangue. Con l'aiuto di esso, puoi determinare lo sviluppo di spiacevoli malattie di natura infettiva intestinale. Ma spesso l'analisi viene utilizzata per rilevare la sifilide. Lo studio è altamente accurato e affidabile.

RPHA sta per reazione di emoagglutinazione passiva.

L'RPHA si basa sul fenomeno dell'agglutinazione degli eritrociti, in cui gli antigeni - i reagenti RPHA vengono adsorbiti sulla superficie, quando viene aggiunto il siero del sangue di un paziente con sifilide.

Dopo aver combinato il siero di un infetto da sifilide al reagente RPHA, si verifica l'agglutinazione (attaccamento o attaccamento) degli eritrociti e si verifica la loro precipitazione. Il grado di adesione dipende direttamente dall'accumulo e dalla densità degli anticorpi nel siero del sangue, per questo motivo RPHA aiuta non solo a rilevare la presenza di anticorpi, ma anche a identificarne la quantità.

Il risultato è diviso in infezione primaria e secondaria, che si esprime nella manifestazione di vari anticorpi. Con il primario si attivano le IgM, con il secondario - IgG. L'accuratezza dello studio della seconda fase diventa ancora più specifica. Se nella prima fase è circa del 96%, nella seconda può arrivare fino al 99%.

L'analisi è buona come studio indipendente, ma è meglio utilizzarla come metodo di conferma dopo uno studio non specifico positivo.

A causa della sua elevata accuratezza, questa analisi è sempre più utilizzata per confermare o confutare l'insorgenza di un paziente con sifilide.

Inoltre, per una maggiore affidabilità, dopo l'RPHA, può essere eseguito un altro test di conferma, ad esempio il test immunoenzimatico "treponemico".

In generale, la diagnosi viene sempre eseguita in modo completo, non utilizzando un solo tipo di esame, ma combinando vari metodi che si completano a vicenda.

Fai la tua domanda al medico di diagnostica clinica di laboratorio

Anna Ponyaeva. Laureato presso l'Accademia medica di Nizhny Novgorod (2007-2014) e la residenza in diagnostica clinica e di laboratorio (2014-2016).

Un piccolo svantaggio, o meglio una caratteristica dell'analisi, è la sua sensibilità anche dopo che la malattia è stata curata. Il risultato è mantenuto positivo per tutta la vita di una persona che ha avuto la sifilide. Per questo motivo, l'RPHA non viene utilizzato per diagnosticare una malattia precoce o tardiva. È anche impossibile con l'aiuto di questa analisi rivelare l'efficacia del trattamento.

Con qualsiasi risultato positivo, c'è il sospetto di infezione. Ma di tanto in tanto può verificarsi una reazione falsamente positiva. È vero, la sua presenza quantitativa di solito non supera il 3% ed è dovuta a una serie di motivi non infettivi.