Kopējās antioksidantu aktivitātes noteikšanas metode. Racionāls uzturs, pārtikas piedevas un biostimulanti Trap metode antioksidantu aktivitātes noteikšanai

24.10.2023

1 Boļšakova L.S. 1Milentjevs V.N. 2Saņņikovs D.P. 3Kazmins V.M. 2

1 Federālā valsts budžeta augstākās profesionālās izglītības iestāde "Oryol State Institute of Economics and Trade"

2 Federālā valsts budžeta iestāde “Ķīmiskās apstrādes un lauksaimniecības radioloģijas centrs “Orlovsky”

3 Federālā valsts budžeta augstākās profesionālās izglītības iestāde "Valsts universitāte — izglītības, pētniecības un ražošanas komplekss"

Tika pētīta iespēja izmantot hemiluminiscenci, lai novērtētu barības vielu antioksidantu aktivitāti. Piedāvātā metode ir balstīta uz luminola hemiluminiscenci sārmainā vidē, kuras intensitāte ir atkarīga no peroksīdu daudzuma hemiluminiscējošā paraugā. Ķīmiluminiscence tika reģistrēta, izmantojot izstrādātu instalāciju, kas satur dozēšanas sūkni, gaismas necaurlaidīgu kameru, stikla vakuuma fotopavairotāju un datorsistēmu. Lai uzlabotu hemiluminiscenci, luminolam tika pievienots kālija dzelzs sulfīda šķīdums. Ķīmiluminiscences intensitātes izmaiņas tika reģistrētas analizējamā parauga ievadīšanas brīdī luminola šķīdumā. Kā analizējamais paraugs tika izmantots pienenes ekstrakts, kas iegūts sausā zemas temperatūras destilācijā. Tas satur fenola savienojumus, kas pazīstami ar savu augsto antioksidantu aktivitāti. Konstatēts, ka ar hemiluminiscences metodi var noteikt dažādu pārtikas savienojumu antioksidantu īpašības.

Tika pētīta iespēja izmantot hemiluminiscenci, lai novērtētu barības vielu antioksidantu aktivitāti. Piedāvātā metode ir balstīta uz luminola hemiluminiscenci sārmainā vidē, kuras intensitāte ir atkarīga no peroksīdu daudzuma hemiluminiscējošā paraugā. Ķīmiluminiscence tika reģistrēta, izmantojot izstrādātu instalāciju, kas satur dozēšanas sūkni, gaismas necaurlaidīgu kameru, stikla vakuuma fotopavairotāju un datorsistēmu. Lai uzlabotu hemiluminiscenci, luminolam tika pievienots kālija dzelzs sulfīda šķīdums. Ķīmiluminiscences intensitātes izmaiņas tika reģistrētas analizētā parauga ievadīšanas brīdī luminola šķīdumā. Kā analizējamais paraugs tika izmantots pienenes ekstrakts, kas iegūts sausā zemas temperatūras destilācijā. Tas satur fenola savienojumus, kas pazīstami ar savu augsto antioksidantu aktivitāti. Konstatēts, ka ar hemiluminiscences metodi var noteikt dažādu pārtikas savienojumu antioksidantu īpašības.

Bibliogrāfiskā saite

Paņičkins A.V., Boļšakova L.S., Milentjevs V.N., Saņņikovs D.P., Kazmins V.M. ĶĪMIMISCES IZMANTOŠANA PĀRTIKAS VIELU ANTIOKSIDĀTO ĪPAŠĪBU NOVĒRTĒŠANAI // Racionāls uzturs, pārtikas piedevas un biostimulanti. – 2014. – Nr.6. – P. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (piekļuves datums: 17.12.2019.). Jūsu uzmanībai piedāvājam izdevniecības "Dabaszinātņu akadēmija" izdotos žurnālus

], tomēr antioksidantu kā ķīmisko savienojumu definīcija nesniedz pilnīgu priekšstatu par pētāmā objekta aizsargājošajām īpašībām: tās nosaka ne tikai konkrētā antioksidanta daudzums, bet arī katra no tiem aktivitāte. Antioksidanta aktivitāte jeb antioksidanta aktivitāte, AOA, ir ātruma konstante antioksidanta reakcijai ar brīvo radikāli (kInH). Ķīmiluminiscences (CL) metode ļauj noteikt kopējo antioksidantus saistošo radikāļu daudzumu paraugā (kopējā antioksidanta kapacitāte, TAU), bet, izmantojot CL kinētikas matemātiskās modelēšanas metodi, arī sēnīšu veidošanās un reakcijas ātrumu. radikāļi ar antioksidantiem, tas ir, AOA [, ,].

Visizplatītākā hemiluminiscences metodes modifikācija kopējās antioksidanta kapacitātes noteikšanai ir balstīta uz luminola izmantošanu kā hemiluminiscences aktivatoru [, , ,]. Paraugu ievieto hemiluminometra kivetē, pievienojot luminolu, ūdeņraža peroksīdu un savienojumu, kas spontānas sadalīšanās (termolīzes) rezultātā spēj veidot radikāļus, piemēram, 2,2'-azobis-(2-amidinopropāna) dihidrohlorīdu (ABAP). ): ABAP → 2R. Molekulārā skābekļa klātbūtnē alkilgrupa R veido peroksilgrupu ROO: R + O 2 → ROO. Tālāk peroksilgrupa oksidē hemiluminiscējošo zondi luminolu (LH 2), un veidojas luminola radikālis (LH): ROO + LH 2 → ROOH + LH. No LH, veidojoties starpproduktiem (luminola hidroperoksīds un luminola endoperoksīds), elektroniski ierosinātā stāvoklī veidojas luminola oksidācijas galaprodukta aminoftalskābes molekula, kas izstaro fotonu, kā rezultātā tiek novērota hemiluminescence. . CL intensitāte ir proporcionāla fotonu veidošanās ātrumam, un tā, savukārt, ir proporcionāla LH stacionārajai koncentrācijai sistēmā. Mijiedarbojoties ar radikāļiem, antioksidanti pārtrauc aprakstīto transformāciju ķēdi un novērš fotona veidošanos.

Savienojumi, kas ir jutīgi pret termolīzi, nav vienīgais iespējamais radikāļu avots, analizējot parauga antioksidantu spēju, izmantojot hemiluminiscences metodi. Alternatīvas ir sistēmas mārrutku peroksidāze-ūdeņraža peroksīds [, ], hemīns-ūdeņraža peroksīds, citohroms Ar–kardiolipīns–ūdeņraža peroksīds uc Reakcijas shēma luminola oksidēšanai ar peroksidāzēm aplūkota Kormjē et al. .

Šo sistēmu CL kinētiskās līknes atspoguļo divus reakcijas posmus: CL intensitātes palielināšanās stadiju un plato vai pakāpeniskas luminiscences samazināšanās stadiju, kad CL intensitāte ir vai nu nemainīga, vai lēnām samazinās. Darbā ir aprakstītas divas pieejas kopējās antioksidantu kapacitātes mērīšanai, kas ņem vērā šo līkņu iezīmi. TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) metode ir balstīta uz CL latentā perioda mērīšanu. τ un tos var izmantot, lai noteiktu antioksidantus, piemēram, Trolox vai askorbīnskābi: tiem ir raksturīga augsta reakcijas ātruma konstante ar radikāļiem, un šī iemesla dēļ tos var saukt par spēcīgiem antioksidantiem. Latentajā periodā notiek to pilnīga oksidēšanās. TAR (Total Antioxidant Reactivity) metode mēra ķīmiskās luminiscences slāpēšanas pakāpi. q hemiluminiscences līknes plato vai maksimumā: formula, kur I ir hemiluminiscences intensitāte bez antioksidanta, un I 1 ir CL intensitāte antioksidanta klātbūtnē. Šo metodi izmanto, ja sistēma satur pārsvarā vājus antioksidantus ar zemām mijiedarbības ar radikāļiem ātruma konstantēm – daudz zemākām salīdzinājumā ar luminola konstanti.

Antioksidantu iedarbību raksturo ne tikai rādītāji τ Un q. Kā redzams no darbiem [,], antioksidantu, piemēram, urīnskābes iedarbība hemin–H 2 O 2 –luminola sistēmā vai tokoferola, rutīna un kvercetīna iedarbība citohroma sistēmā Ar–kardiolipīns–H 2 O 2 –luminols, ko raksturo CL maksimālā pieauguma ātruma izmaiņas ( v maks). Kā liecina kinētikas matemātiskās modelēšanas rezultāti, šo antioksidantu mijiedarbības ar radikāļiem ātruma konstantu vērtības ir tuvas luminola konstantes vērtībai, tāpēc šādus antioksidantus var saukt par vidēja stipruma antioksidantiem.

Ja pētāmais materiāls, jo īpaši augu izejvielas, saturēja tikai viena veida antioksidantus, tad to saturu varētu raksturot ar vienu no trim iepriekš uzskaitītajiem rādītājiem ( τ , q vai v maks). Bet augu materiāli satur dažāda stipruma antioksidantu maisījumu. Lai atrisinātu šo problēmu, daži autori [ , , , ] izmantoja ķīmiskās luminiscences gaismas summas izmaiņas noteiktā laikā ∆S, kas aprēķinātas pēc formulas , kur ∆ S 0 un ∆ S S- CL gaismas summas uz noteiktu laiku t attiecīgi kontroles un testa paraugos. Laikam jābūt pietiekamam, lai visi sistēmā esošie antioksidanti oksidētos, tas ir, lai testa parauga CL līkne sasniegtu kontroles parauga CL līknes līmeni. Pēdējais pieņem, ka pētniekiem ir ne tikai jāreģistrē mirdzuma gaismas summa, bet arī pietiekami ilgu laiku jāreģistrē CL kinētikas līkne, kas ne vienmēr tiek darīts.

Tā kā visi izmērītie rādītāji ir atkarīgi no ierīces un mērīšanas apstākļiem, vielas antioksidanta iedarbība pētāmajā sistēmā parasti tiek salīdzināta ar antioksidanta iedarbību, kas ņemta par standartu, piemēram, Trolox [,].

Daudzi autori ir izmantojuši mārrutku peroksidāzes – ūdeņraža peroksīda sistēmu, lai analizētu augu materiālu kopējo antioksidantu spēju. Darbos [,], lai novērtētu antioksidantu daudzumu paraugos, tika izmantots CL latentais periods (TRAP metode), bet darbos [, ,] - laukums zem CL attīstības līknes. Taču uzskaitītie darbi nesniedz skaidru pamatojumu viena vai otra parametra izvēlei OAU novērtēšanai.

Pētījuma mērķis bija noteikt, kā dažāda veida antioksidantu attiecība ietekmē TOA, un modificēt ķīmiluminiscences metodi tā, lai varētu precīzāk noteikt TOA augu materiālos. Lai to izdarītu, mēs sev izvirzījām vairākus uzdevumus. Vispirms salīdziniet pētāmo objektu CL kinētiku ar trīs veidu standarta antioksidantu (stipru, vidēju un vāju) kinētiku, lai saprastu, kāda veida antioksidanti dod galveno ieguldījumu pētāmo objektu OAU. Otrkārt, aprēķiniet pētāmo objektu OAE, izmērot CL gaismas summas samazināšanos šo objektu ietekmē, salīdzinot ar antioksidanta iedarbību, kas nodrošina lielāko ieguldījumu OAE.

MATERIĀLI UN METODES

Pētījuma objekti bija a/s Krasnogorskleksredstva (Krievija) ražotie vilkābeļu, pīlādžu un mežrozīšu gurnu rūpnieciskie paraugi, kā arī autoru Maskavas apgabalā dabiskās augšanas apstākļos savāktie un 60–80° temperatūrā žāvēti aveņu augļi. C, līdz tie pārstāja izdalīt sulu un deformēties, nospiežot.

Reaģenti antioksidanta kapacitātes analīzei, izmantojot hemiluminiscences metodi, bija: KH 2 PO 4, 20 mM buferšķīdums (pH 7,4); peroksidāze no mārrutku saknēm (aktivitāte 112 vienības/mg, M = 44 173,9), 1 mM ūdens šķīdums; luminols (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazīndions, 3-aminoftalskābes hidrazīds, M = 177,11), 1 mM ūdens šķīdums; ūdeņraža peroksīds (H 2 O 2, M = 34,01), 1 mM ūdens šķīdums; antioksidantu šķīdumi (askorbīnskābe, kvercetīns, tokoferols). Visus reaģentus ražo Sigma Aldrich (ASV).

Vilkābeļu, pīlādžu un mežrozīšu augļu novārījumus un aveņu augļu uzlējumu gatavoja pēc PSRS Valsts farmakopejas metodēm, kas noteiktas vispārīgajā farmakopejas rakstā “Uzlējumi un novārījumi”.

Kopējās antioksidantu kapacitātes noteikšana tika veikta, reģistrējot hemiluminiscenci ar Lum-100 hemiluminometru (DISoft, Krievija), izmantojot PowerGraph 3.3 programmatūru. Lai noteiktu OAE augu materiālos, 40 μl luminola koncentrācijā 1 mM, 40 μl mārrutku peroksidāzes koncentrācijā 0,1 μM, no 10 līdz 50 μl novārījuma vai uzlējuma (atkarībā no koncentrācijas) un fosfātu buferšķīdumu. nepieciešamo daudzumu ievietoja ierīces kivetē, lai kopējais parauga tilpums būtu 1 ml. Ierīcē tika uzstādīta kivete, un CL tika ierakstīts, novērojot fona signālu. Pēc 48 sekunžu ilgas fona signāla ierakstīšanas kivetei pievienoja 100 μl H2O2 koncentrācijā 1 mM un CL ierakstīšanu turpināja 10 minūtes. Tika sagatavoti četri paraugi ar dažādām katra augu objekta koncentrācijām. CL tika reģistrēts arī askorbīnskābes, kvercetīna un tokoferola šķīdumiem piecās dažādās koncentrācijās katram antioksidantam. Pēc tam novārījumu un uzlējumu paraugu OAU tika pārrēķināts uz kvercetīnu.

Luminola, mārrutku peroksidāzes un ūdeņraža peroksīda koncentrācijas izvēlētas tā, lai pieņemamā laikā (ne vairāk kā 10 min.) noteiktu ārstniecības augu materiālu ūdens ekstraktu antioksidantu spēju. Šajā laikā antioksidantu askorbāta un flavonoīda kvercetīna (galveno augu materiālu antioksidantu) ķīmiskās luminiscences līknes sasniedza plato, kas norāda uz pilnīgu antioksidantu iznīcināšanu sistēmā. Pētīto paraugu atšķaidījumi un standarta antioksidantu šķīdumu koncentrācijas (norādītas attēlu leģendās) tika izvēlēti tā, lai visas CL kinētiskās līknes tiktu izmērītas pie vienādas ierīces jutības.

Antioksidantu kapacitāte tika aprēķināta no laukuma izmaiņām (∆ S) zem hemiluminiscences (gaismas summas) kinētiskās līknes, pievienojot vielu, kas satur antioksidantu. Šim nolūkam mēs aprēķinājām S 0 sistēmai bez antioksidanta un no tā atņēma laukumu S S, raksturojot sistēmu, kurai tika pievienots antioksidants. Vērtība ∆ S atkarīgs no hemiluminometra jutības un mērīšanas apstākļiem. Attiecība ∆ S/C V(Kur C- pētāmā bioloģiskā materiāla koncentrācija kivetē, g/l, un V- kivetes tilpums, l) izsaka 1 g pētāmā materiāla, t.i., augu izejvielu, antioksidanta spēju.

Līdzīgi tika aprēķināta antioksidanta kapacitāte ∆ S A standarta antioksidanta, piemēram, kvercetīna, šķīdumu, kas ievietots tādā pašā reakcijas maisījuma tilpumā. Attiecība ∆ S A / C A V(Kur C A- antioksidanta svara koncentrācija kivetē, g/l) izsaka 1 g antioksidanta antioksidanta spēju.

Katram standarta antioksidantam tika reģistrēts signāls no vairāku koncentrāciju šķīdumiem, lai nodrošinātu, ka aprēķini ir lineārās attiecībās un iegūtie rezultāti ir reproducējami. Patiešām, tika iegūta lineāra atkarība (∆ S A = k A C A) signālu no koncentrācijas, no kuras aprēķināts stehiometriskais koeficients k A. Saskaņā ar Fišera kritēriju vērtības, kas iegūtas standarta antioksidantiem k A statistiski nozīmīgi ar varbūtību 0,975. Pēc tam signāls no četrām koncentrācijām tika reģistrēts katram no četriem augu paraugiem, un visiem paraugiem tika iegūta signāla lineāra atkarība no koncentrācijas (∆ S = k·C), no kura tika aprēķināts stehiometriskais koeficients k. Ar varbūtību 0,975 (Fišera tests) augu paraugiem iegūtās k vērtības ir statistiski nozīmīgas. Augu materiāla kopējā antioksidanta kapacitāte standarta antioksidanta masas izteiksmē (mg%) tika noteikta, izmantojot formulu.

Vērtības tika uzrādītas kā vidējā aritmētiskā ± standarta novirze (M ± δ) pie p

PĒTĪJUMA REZULTĀTI

Ķīmiluminiscences kinētikas pētījums nātrija askorbāta klātbūtnē (1. att. Nātrija askorbāta ietekme uz hemiluminiscences kinētiku" data-note="Sistēmas komponentu koncentrācijas: luminols - 40 µM, mārrutku peroksidāze - 4 nM, ūdeņraža peroksīds - 100 µM Līknes: 1 - kontroles paraugs 3 - 0,15 µM nātrija askorbāts.">1) parādīja, ka šim antioksidantam ir raksturīgs latentais periods; pilnībā nomākts Tā ilgums ir proporcionāls antioksidanta daudzumam sistēmā. Tajā pašā laikā nemainās ne CL līkņu slīpums, ne CL intensitāte antioksidants, kas pārtver visus sistēmā izveidotos radikāļus, tostarp luminola radikāļus, un CL neattīstās, kamēr viss askorbāts nav oksidēts.

Citi pētnieki arī ir parādījuši, ka ķīmiskās analīzes rezultāti un TAU vērtība, kas noteikta ar hemiluminiscences metodi, bieži nesakrīt. Darbā peroksidāzes–luminola–ūdeņraža peroksīda sistēmā noteiktā kopējā antioksidanta kapacitāte korelē ar triterpēna savienojumu saturu. Taču šo pašu autoru darbos, kuros izpētes objekts bija cits augs, viņi nenovēroja OAE korelāciju ar kādas vielu grupas, tostarp flavonoīdu, saturu.

Šādas neatbilstības ir saistītas ar vismaz trim faktoriem. Pirmkārt, svarīga ir antioksidantu aktivitāte, t.i., to mijiedarbības ātrums ar radikāļiem, kas dažādiem augu paraugā iekļautajiem antioksidantiem ir atšķirīgs. Pēc Izmailova teiktā, meksidola, tokoferola un kvercetīna attiecīgo reakciju ātruma konstantes korelē kā 0,04: 2: 60. Otrkārt, katra antioksidanta molekula, nonākot ķīmiskā reakcijā, var pārtvert dažādu skaitu radikāļu. Saskaņā ar darbu kvercetīns, urīnskābe un askorbīnskābe pārtvēra attiecīgi 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 un 0,5 ± 0,2 radikāļus uz vienu reaģējušo antioksidanta molekulu (izmantota hemin-H 2 O 2 sistēma -luminols). Treškārt, pētījuma rezultātus varētu ietekmēt peroksidāzes aktivitātes klātbūtne pašu augu paraugos, tāpat kā darbā, kā arī kalcija klātbūtne paraugos, kas, kā redzams darbā, spēj palielināt. mārrutku peroksidāzes aktivitāte noteiktos apstākļos. Tas parasti izraisa augstāku CL intensitāti plato nekā kontroles līknēs, ko mēs tomēr neievērojām.

Pirmais faktors krasi ierobežo tāda parametra izmantošanu kā gaismas summas izmaiņas, jo ķīmiskās luminiscences mērīšanas laikam jābūt garākam par visu testa paraugā esošo antioksidantu patēriņa laiku. Par šī momenta iestāšanos var spriest, tikai izmērot hemiluminiscences kinētiku. Turklāt vājo antioksidantu ieguldījums TAU ir krasi nenovērtēts, jo laiks to pilnīgai oksidēšanai ir daudzkārt ilgāks par pieļaujamo mērījumu ilgumu (10–20 min).

Antioksidanta stehiometriskais koeficients ir vēl svarīgāks. Radikāļu skaits n pārtverts ar to ir vienāds ar , kur ρ ir stehiometriskais koeficients, un ∆ m- antioksidanta koncentrācijas izmaiņas mērījuma laikā, mūsu gadījumā - testējamās vielas sākotnējā koncentrācija testa paraugā.

Gaismas luminiscences summas atšķirība bez antioksidanta un tā klātbūtnē ir proporcionāla n. Kopējais pārtverto radikāļu skaits ir , kur ρ i ir konkrēta antioksidanta stehiometriskais koeficients, un m i- tā koncentrācija mērīšanas laikā. Kopējais pārtverto radikāļu skaits acīmredzami nav vienāds ar kopējo antioksidantu daudzumu, jo koeficienti ρ i ne tikai nav vienādi ar vienotību, bet arī būtiski atšķiras dažādiem antioksidantiem.

Lielums n ir proporcionāls gaismas summu starpībai, kas izmērīta noteiktā laika periodā starp paraugu, kas satur antioksidantu, un kontroles paraugu, kas nesatur antioksidantus: S = k n, Kur k- koeficients, nemainīgs tādos pašos mērīšanas apstākļos.

Rakstā aplūkotā metode ļauj noteikt kopējo antioksidantu kapacitāti, savukārt ķīmiskā analīze ļauj noteikt kopējo antioksidantu saturu produktā. Tāpēc šķiet, ka ķīmijluminiscences metode ir informatīvāka nekā ķīmiskās analīzes.

Apstākļi, kurus izvēlējāmies augu izejvielu kopējās antioksidanta kapacitātes novērtēšanai, reģistrējot hemiluminiscences kinētiku sistēmā, kas sastāv no mārrutku peroksidāzes, ūdeņraža peroksīda un luminola (komponentu koncentrācijas - attiecīgi 4 nM, 100 µM un 40 µM; 20 mM fosfāts buferšķīdums, pH 7,4), nodrošināja spēcīgu antioksidantu (askorbīnskābes) un vidēja stipruma antioksidantu (kvercetīna) oksidēšanos 10 minūtēs. Šāds mērījumu ilgums ir ērts un nodrošina nepieciešamo mērījumu kvalitāti.

Ķīmiluminiscences kinētikas analīze parādīja, ka pētītajos objektos (pīlādža augļu, mežrozīšu, vilkābeļu novārījumos un aveņu augļu uzlējumos) galvenie antioksidanti ir vidēja stipruma antioksidanti, tai skaitā flavonoīdi, un vājas stiprības (tokoferols u.c.). Pamatojoties uz hemiluminiscences gaismas summas samazināšanos, tika aprēķināta kopējā antioksidanta kapacitāte pētītajiem objektiem. Salīdzinot iegūtās TAU vērtības ar ķīmiskās analīzes rezultātiem, atklājās, ka produkti, kas satur vienādu daudzumu antioksidantu ar dažādām attiecībām, var atšķirties pēc spējas efektīvi aizsargāt organismu no brīvo radikāļu kaitīgās ietekmes. Aprakstītais paņēmiens ir daudzsološs, lai pētītu augu objektus, kas satur dažādu antioksidantu maisījumu. Tajā pašā laikā to raksturo vienkāršība un zemas izpētes izmaksas. Ķīmiluminiscences kinētikas mērīšanas kombinācija ar reakciju matemātisko modelēšanu ne tikai automatizēs TAU noteikšanas procesu, bet arī noteiks atsevišķu antioksidantu grupu devumu indikatorā.

Atslēgvārdi

brīvais radikālis/antioksidants/ antioksidanta aktivitāte / kopējā antioksidanta spēja / hemiluminiscence/ luminols / brīvais radikālis / antioksidants / antioksidanta aktivitāte / kopējā antioksidanta kapacitāte / hemiluminescence / luminols

anotācija zinātniskais raksts par ķīmijas zinātnēm, zinātniskā darba autors - Georgijs Konstantinovičs Vladimirovs, E. V. Sergunova, D. Ju., A. Vladimirovs

Ārstniecības augu materiāli ir viens no cilvēka ķermeņa antioksidantu avotiem. Starp metodēm antioksidantu satura noteikšanai augu objektos plaši izplatīta ir hemiluminiscences analīzes metode. Šajā darbā tas tika izmantots, lai novērtētu kopējā antioksidanta spēja(OAE) pīlādžu, mežrozīšu un vilkābeļu augļu novārījumi un aveņu augļu uzlējums. Eksperimentā tika reģistrēta kinētika hemiluminiscence sistēmā, kas sastāv no mārrutku peroksidāzes, ūdeņraža peroksīda un luminola. Sistēmas komponentu koncentrācijas un tilpums paraugā tika izvēlēti tā, lai spēcīgi antioksidanti (askorbīnskābe) un vidēji spēcīgi antioksidanti (kvercetīns) mērījumu laikā (10 min) tiktu pilnībā oksidēti. Ir ierosināta un pamatota metode OAE aprēķināšanai, pamatojoties uz gaismas summas izmaiņām hemiluminiscence augu paraugu klātbūtnē. Kinētikas analīze hemiluminiscence parādīja, ka pētītajos objektos dominē vidēja stipruma antioksidanti, tajā skaitā flavonoīdi, un vāji antioksidanti (tokoferols u.c.). Salīdzinot pētāmo objektu aprēķinātās OAE vērtības un to ķīmiskās analīzes datus, atklājās, ka produkti, kas satur vienādu daudzumu antioksidantu ar atšķirīgām attiecībām pēc veida, var atšķirties pēc spējas aizsargāt organismu no brīvo radikāļu kaitīgās ietekmes. . Aprakstītais paņēmiens ir daudzsološs, lai pētītu augu objektus, kas satur dažādu veidu antioksidantu maisījumu.

Saistītās tēmas zinātniskie darbi ķīmijas zinātnēs, zinātniskā darba autors - Georgijs Konstantinovičs Vladimirovs, E. V. Sergunova, D. Ju., A. Vladimirovs

2016 / Georgijs Vladimirovs, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Antioksidantu noteikšana ar aktivētu hemiluminiscenci, izmantojot 2,2"-azo-bis(2-amidinopropānu)
2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Dihidrokvercetīna un rutīna antioksidanta iedarbība peroksidāzes reakcijās, ko katalizē citohroms c
2008 / Demins E.M., Proskurnina E.V., Vladimirovs Yu.A.
Bioloģisko substrātu oksidatīvās un antioksidanta spējas novērtējums ar Fentona reakcijas izraisīto hemiluminiscenci
2016 / Piskarevs Igors Mihailovičs, I.P. Ivanova
Lipohidroperoksīdu satura noteikšana seruma lipoproteīnos, izmantojot mikroperoksidāzes-luminola sistēmu
2011 / Teselkins Jurijs Oļegovičs, Babenkova Irina Vladimirovna
Antioksidantu izpētes metodes
2004 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V.
Tuvas etnomedicīnā izmantoto augu antioksidanta aktivitāte
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Fosprenila antioksidantu īpašību izpēte dažādās bioloģisko testu sistēmās
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu, A. D. Agafonova
Dažādu polihlorēto bifenilu devu ietekme uz spontānas un imūnglobulīna izraisītas luminola atkarīgās hemiluminiscences stāvokli asinīs
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samokhodova O.V.
Antioksidantu aizsardzības lipīdu peroksidācijas sistēmas novērtējums bērniem ar esenciālu arteriālo hipertensiju, izmantojot spektrofotometrijas un hemiluminiscences metodes
2014 / Natjaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Koļesņikova Larisa Romanovna

Kopējās antioksidantu kapacitātes hemiluminescenta noteikšana ārstniecības augu materiālā

Ārstniecības augu materiāls ir viens no cilvēka ķermeņa antioksidantu avotiem. Ķīmiluminiscences analīze ir viena no izplatītākajām metodēm antioksidantu satura noteikšanai augu materiālos. Mūsu darbā tika izmantota ķīmiskā luminiscences analīze, lai noteiktu kopējo antioksidantu kapacitāti (TAC) pīlādžu, rožu un vilkābeļu augļu novārījumu, kā arī aveņu augļu uzlējumam. Eksperimenti noteica hemiluminiscences kinētiku sistēmā, kas sastāv no mārrutku peroksidāzes, ūdeņraža peroksīda un luminola. Sistēmas komponentu koncentrācijas un tilpumi tika izvēlēti tādi, lai spēcīgi antioksidanti (askorbīnskābe) un vidēja spēka antioksidanti (kvercetīns) mērījumu laikā (10 minūtes) tiktu pilnībā oksidēti. Tika piedāvāta un pamatota KPN aprēķināšanas metode, kuras pamatā ir ķīmiskās luminiscences gaismas summas izmaiņas augu paraugu klātbūtnē. Ķīmiluminiscences kinētikas analīze parādīja, ka pētītajos objektos dominē vidēja spēka antioksidanti, tostarp flavonoīdi un vāji antioksidanti (tokoferols un citi). Salīdzinot pētāmo objektu aprēķinātās KPN vērtības un to ķīmiskās analīzes datus, atklājās, ka produkti, kas satur vienādu daudzumu antioksidantu ar dažādām antioksidantu attiecībām, var atšķirties pēc to spējas aizsargāt organismu pret brīvo radikāļu kaitīgo ietekmi. . Aprakstītais paņēmiens ir daudzsološs, lai pētītu augu objektus, kas satur dažādu veidu antioksidantu maisījumus.

Zinātniskā darba teksts par tēmu “Ķīmiluminiscences metode kopējās antioksidanta kapacitātes noteikšanai ārstniecības augu materiālos”

hemiluminiscences metode kopējās antioksidanta kapacitātes noteikšanai ārstniecības augu materiālos

G. K. Vladimirovs1^, E. V. Sergunova2, D. Izmailovs1, A. Vladimirovs1

1 Medicīnas biofizikas katedra, Fundamentālās medicīnas fakultāte, M. V. Lomonosova Maskavas Valsts universitāte

2 Farmācijas fakultātes Farmakognozijas katedra,

Pirmā Maskavas Valsts medicīnas universitāte, kas nosaukta I. M. Sečenova vārdā, Maskava

Ārstniecības augu materiāli ir viens no cilvēka ķermeņa antioksidantu avotiem. Starp metodēm antioksidantu satura noteikšanai augu objektos plaši izplatīta ir hemiluminiscences analīzes metode. Šajā darbā tā tika izmantota, lai novērtētu pīlādžu, mežrozīšu un vilkābeļu augļu novārījumu un aveņu augļu uzlējuma kopējo antioksidantu kapacitāti (TAC). Eksperimentā hemiluminiscences kinētika tika reģistrēta sistēmā, kas sastāv no mārrutku peroksidāzes, ūdeņraža peroksīda un luminola. Sistēmas komponentu koncentrācijas un tilpums paraugā tika izvēlēti tā, lai spēcīgi antioksidanti (askorbīnskābe) un vidēji spēcīgi antioksidanti (kvercetīns) mērījumu laikā (10 min) tiktu pilnībā oksidēti. Ir ierosināta un pamatota metode OAE aprēķināšanai, kuras pamatā ir ķīmiskās luminiscences gaismas summas izmaiņas augu paraugu klātbūtnē. Ķīmiluminiscences kinētikas analīze parādīja, ka pētītajos objektos dominē vidēja stipruma antioksidanti, tai skaitā flavonoīdi, un vāji antioksidanti (tokoferols uc). Salīdzinot pētāmo objektu aprēķinātās OAE vērtības un to ķīmiskās analīzes datus, atklājās, ka produkti, kas satur vienādu daudzumu antioksidantu ar atšķirīgām attiecībām pēc veida, var atšķirties pēc spējas aizsargāt organismu no brīvo radikāļu kaitīgās ietekmes. . Aprakstītais paņēmiens ir daudzsološs, lai pētītu augu objektus, kas satur dažādu veidu antioksidantu maisījumu.

Atslēgas vārdi: brīvie radikāļi, antioksidants, antioksidanta aktivitāte, kopējā antioksidanta kapacitāte, hemiluminiscence, luminols

Finansējums: darbu atbalstīja Krievijas Zinātnes fonds, grants Nr.14-15-00375.

Ex3 Korespondencei: Georgijs Konstantinovičs Vladimirovs

119192, Maskava, Lomonosovska pr-t, 31, korpuss 5; [aizsargāts ar e-pastu]

Raksts saņemts: 10.03.2016 Raksts pieņemts publicēšanai: 18.03.2016

ārstniecības augu materiālā kopējās antioksidanta kapacitātes hemiluminescentā noteikšana

1 Medicīnas biofizikas katedra, Fundamentālās medicīnas fakultāte, Lomonosova Maskavas Valsts universitāte, Maskava, Krievija

2 Farmācijas fakultātes Farmakognozijas katedra,

Pirmā Sečenova Maskavas Valsts medicīnas universitāte, Maskava, Krievija

Atslēgas vārdi: brīvie radikāļi, antioksidants, antioksidanta aktivitāte, kopējā antioksidanta kapacitāte, hemiluminiscence, luminols

Finansējums: šo darbu atbalstīja Krievijas Zinātnes fonds, grants Nr. 14-15-00375.

Pateicības: autori pateicas Andrejam Aleksejevam no Lomonosova Maskavas Valsts universitātes par palīdzību eksperimenta veikšanā. Jāadresē sarakste: Georgijs Vladimirovs

Lomonosovska prospekts, d. 31, k. 5, Maskava, Krievija, 119192; [aizsargāts ar e-pastu] Saņemts: 10.03.2016 Pieņemts: 18.03.2016

Organismā izveidotie brīvie radikāļi izjauc šūnu membrānu struktūru, kas, savukārt, izraisa dažādu patoloģisku stāvokļu attīstību. Radikāļu destruktīvo oksidatīvo iedarbību novērš organisma antioksidantu aizsardzības sistēma, kurā liela nozīme ir mazmolekulāriem savienojumiem – radikāļu pārtvērējiem (slazdiem). Viens no antioksidantu avotiem ir ārstniecības augu materiāli, kā arī uz tiem balstītas zāles, kuru antioksidantu potenciāla izpēte palīdz palielināt to profilaktisko un ārstniecisko iedarbību.

Darbos ir apskatītas galvenās antioksidantu noteikšanas metodes, tomēr antioksidantu kā ķīmisko savienojumu definīcija nesniedz pilnīgu priekšstatu par pētāmā objekta aizsargājošajām īpašībām: tās nosaka ne tikai konkrētā antioksidanta daudzums, bet arī pētāmā objekta aizsargspējas. bet arī pēc katras darbības. Antioksidanta aktivitāte jeb antioksidanta aktivitāte, AOA, ir ātruma konstante antioksidanta reakcijai ar brīvo radikāli (kInH). Ķīmiluminiscences (CL) metode ļauj noteikt kopējo antioksidantus saistošo radikāļu daudzumu paraugā (kopējā antioksidanta kapacitāte, TCA), bet, izmantojot CL kinētikas matemātiskās modelēšanas metodi, arī sēnīšu veidošanās un reakcijas ātrumu. radikāļi ar antioksidantiem, tas ir, AOA.

Molekulārā skābekļa klātbūtnē alkilgrupa R^ veido peroksilgrupu ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv No LH, veidojoties starpvielām (luminola hidroperoksīds un luminola endoperoksīds), elektroniski ierosinātā stāvoklī veidojas luminola oksidācijas galaprodukta aminoftalskābes molekula, kas izstaro fotonu. , un rezultātā tiek novērota hemiluminiscence . CL intensitāte ir proporcionāla fotonu veidošanās ātrumam, un tā, savukārt, ir proporcionāla LH stacionārajai koncentrācijai sistēmā. Mijiedarbojoties ar radikāļiem, antioksidanti pārtrauc aprakstīto transformāciju ķēdi un novērš fotona veidošanos.

Savienojumi, kas ir jutīgi pret termolīzi, nav vienīgais iespējamais radikāļu avots, analizējot parauga antioksidantu spēju, izmantojot hemiluminiscences metodi. Alternatīvas ir sistēmas mārrutku peroksidāze-ūdeņraža peroksīds, hemin-ūdeņraža peroksīds, citohroms c-kardiolipīns-ūdeņraža peroksīds uc Reakcijas shēma luminola oksidēšanai ar peroksidāzēm ir apskatīta Kormjē et al. .

Šo sistēmu CL kinētiskās līknes atspoguļo divus reakcijas posmus: CL intensitātes pieauguma stadiju un plato vai pakāpeniskas luminiscences samazināšanās stadiju, kad

CL intensitāte ir nemainīga vai lēnām samazinās. Darbā ir aprakstītas divas pieejas kopējās antioksidantu kapacitātes mērīšanai, kas ņem vērā šo līkņu iezīmi. TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) metode ir balstīta uz CL t latentā perioda mērīšanu, un to var izmantot, lai noteiktu antioksidantus, piemēram, Trolox vai askorbīnskābi: tiem ir raksturīga augsta reakcijas ātruma konstante ar radikāļiem, un šī iemesla dēļ to var sauc par spēcīgiem antioksidantiem. Latentajā periodā notiek to pilnīga oksidēšanās. TAR (kopējā antioksidantu reaktivitāte) metode mēra ķīmiskās luminiscences slāpēšanas pakāpi q hemiluminiscences līknes plato vai maksimumā:

kur I ir hemiluminiscences intensitāte bez antioksidanta un 11 ir CL intensitāte antioksidanta klātbūtnē. Šo metodi izmanto, ja sistēma satur pārsvarā vājus antioksidantus ar zemām mijiedarbības ar radikāļiem ātruma konstantēm – daudz zemākām salīdzinājumā ar luminola konstanti.

Antioksidantu iedarbību raksturo ne tikai rādītāji t un c. Kā redzams no darbiem, antioksidantu, piemēram, urīnskābes hemin-H2O2-luminola sistēmā vai tokoferola, rutīna un kvercetīna iedarbību citohroma c-kardiolipīna-H2O2-luminola sistēmā raksturo maksimālās ātruma izmaiņas. CL (utx) palielināšanās. Kā liecina kinētikas matemātiskās modelēšanas rezultāti, šo antioksidantu mijiedarbības ar radikāļiem ātruma konstantu vērtības ir tuvas luminola konstantes vērtībai, tāpēc šādus antioksidantus var saukt par vidēja stipruma antioksidantiem.

DE = DE0 - DE,

kur DE0 un DE5 ir CL gaismas summas noteiktā laikā? attiecīgi kontroles un testa paraugos. Laikam jābūt pietiekamam, lai visi sistēmā esošie antioksidanti oksidētos, tas ir, lai testa parauga CL līkne sasniegtu kontroles parauga CL līknes līmeni. Pēdējais pieņem, ka pētniekiem ir ne tikai jāreģistrē mirdzuma gaismas summa, bet arī pietiekami ilgu laiku jāreģistrē CL kinētikas līkne, kas ne vienmēr tiek darīts.

Tā kā visi izmērītie parametri ir atkarīgi no ierīces un mērīšanas apstākļiem, vielas antioksidanta iedarbība pētāmajā sistēmā parasti tiek salīdzināta ar standarta antioksidanta, piemēram, Trolox, iedarbību.

Daudzi autori ir izmantojuši mārrutku peroksidāzes-ūdeņraža peroksīda sistēmu, lai analizētu augu materiālu kopējo antioksidantu spēju. Lai novērtētu antioksidantu daudzumu paraugos, tika izmantots CL latentais periods (TRAP metode), un darbos tika izmantots laukums zem CL attīstības līknes. Taču uzskaitītie darbi nesniedz skaidru pamatojumu

viena vai otra parametra izvēle OAU novērtēšanai.

MATERIĀLI UN METODES

Pētījuma objekti bija a/s Krasnogorskleksredstva (Krievija) ražoto vilkābeļu, pīlādžu un mežrozīšu industriālie paraugi, kā arī autoru Maskavas apgabalā dabiskās augšanas apstākļos savāktie un 60-80° temperatūrā žāvēti aveņu augļi. C, līdz tie pārstāja izdalīt sulu un deformēties, nospiežot.

Reaģenti antioksidantu kapacitātes analīzei ar hemiluminiscences metodi bija: KH2PO4, 20 mM buferšķīdums (pH 7,4); peroksidāze no mārrutku saknēm (aktivitāte 112 vienības/mg, M = 44 173,9), 1 mM ūdens šķīdums; luminols (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazīndions, 3-aminoftalskābes hidrazīds, M = 177,11), 1 mM ūdens šķīdums; ūdeņraža peroksīds (H2O2, M = 34,01), 1 mM ūdens šķīdums; antioksidantu šķīdumi (askorbīnskābe, kvercetīns, tokoferols). Visus reaģentus ražo Sigma Aldrich (ASV).

sasniedza plato, kas liecina par pilnīgu antioksidantu iznīcināšanu sistēmā. Pētīto paraugu atšķaidījumi un standarta antioksidantu šķīdumu koncentrācijas (norādītas attēlu parakstos) tika atlasītas tā, lai visas CL kinētiskās līknes tiktu mērītas pie vienas un tās pašas ierīces jutības.

Antioksidanta kapacitāte tika aprēķināta no laukuma (AS) izmaiņām zem hemiluminiscences (gaismas summas) kinētiskās līknes, pievienojot vielu, kas satur antioksidantu. Lai to izdarītu, sistēmai bez antioksidanta mēs aprēķinājām S0 un no tā atņēmām laukumu SS, kas raksturo sistēmu, kurai tika pievienots antioksidants. AS vērtība ir atkarīga no hemiluminometra jutības un mērīšanas apstākļiem. Attiecība AS/C ■ V (kur C ir pētāmā bioloģiskā materiāla koncentrācija kivetē, g/l un V ir kivetes tilpums, l) izsaka 1 g pētāmā materiāla antioksidanta kapacitāti, t.i. , augu izejvielas.

Līdzīgā veidā mēs aprēķinājām standarta antioksidanta, piemēram, kvercetīna, šķīduma antioksidanta kapacitāti ASa, kas ievietots tajā pašā reakcijas maisījuma tilpumā. Attiecība AS/CÄ ■ V (kur CA ir antioksidanta svara koncentrācija kivetē, g/l) izsaka antioksidanta spēju 1 g antioksidanta.

Katram standarta antioksidantam tika reģistrēts signāls no vairāku koncentrāciju šķīdumiem, lai nodrošinātu, ka aprēķini ir lineārās attiecībās un iegūtie rezultāti ir reproducējami. Patiešām, tika iegūta signāla lineārā atkarība (ASa = kA ■ CA) no koncentrācijas, no kuras tika aprēķināts stehiometriskais koeficients kA. Saskaņā ar Fišera kritēriju standarta antioksidantiem iegūtās kA vērtības ir statistiski nozīmīgas ar varbūtību 0,975. Tālāk tika reģistrēts signāls no četrām koncentrācijām katram no četriem augu paraugiem, un visiem paraugiem tika iegūta signāla lineārā atkarība no koncentrācijas (AS = k ■ C), no kuras tika aprēķināts stehiometriskais koeficients k. Ar varbūtību 0,975 (Fišera tests) augu paraugiem iegūtās k vērtības ir statistiski nozīmīgas. Augu materiāla kopējā antioksidanta kapacitāte standarta antioksidanta masas izteiksmē (mg%) tika noteikta, izmantojot formulu

OAE = k ■ 105. k

Vērtības tika uzrādītas kā vidējā aritmētiskā ± standarta novirze (M ± 5) pie p<0,05.

PĒTĪJUMA REZULTĀTI

Ķīmiluminiscences kinētikas pētījums nātrija askorbāta klātbūtnē (1. att.) parādīja, ka šim antioksidantam raksturīgs latentais periods, kad CL ir gandrīz pilnībā nomākts. Tās ilgums ir proporcionāls antioksidanta daudzumam sistēmā. Šajā gadījumā ne CL līkņu slīpums, ne CL intensitāte plato nemainās. Tas izskaidrojams ar to, ka askorbīnskābe ir spēcīgs antioksidants, kas pārtver visus sistēmā izveidotos radikāļus, arī luminola radikāļus, un CL neattīstās, kamēr nav oksidēts viss askorbāts.

Tokoferola iedarbība (2. att.) izpaudās ar CL intensitātes samazināšanos plato, kas raksturīga vājiem antioksidantiem, lai gan tokoferols tiek uzskatīts par vienu no visvairāk.

spēcīgi antioksidanti. Iespējams, šī neatbilstība ir saistīta ar faktu, ka mūsu eksperimentā brīvie radikāļi atradās ūdens šķīdumā, savukārt tokoferola iedarbība parasti tiek pētīta nepolārā vidē. Pētījumā, kurā radikāļu avots bija citohroma c komplekss ar kardiolipīnu un reakcija ar luminolu notika šajā kompleksā, tokoferolam bija vidēja stipruma antioksidanta īpašības.

Izpētot dažādu kvercetīna koncentrāciju ietekmi uz mūsu sistēmu (3. att.) un salīdzinot tā un nātrija askorbāta un tokoferola kinētiskās līknes, var atzīmēt, ka kvercetīna galvenā iedarbība izpaužas kā kvercetīna slīpuma izmaiņas. līknes, t.i., vidēja stipruma antioksidantiem raksturīgo CL attīstības ātrumu.

CL līknes visiem pētītajiem novārījumiem (4. att.) atgādina kvercetīna līknes ar nelielu CL intensitātes samazināšanos beigās, t.i., sasniedzot.

Laiks, min

Rīsi. 1. Nātrija askorbāta ietekme uz hemiluminiscences kinētiku

Sistēmas komponentu koncentrācijas: luminols - 40 µM, mārrutku peroksidāze - 4 nM, ūdeņraža peroksīds - 100 µM. Līknes: 1 - kontroles paraugs; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM nātrija askorbāts.

plato. Kā parādīts darbā, šāda uzvedība ir raksturīga vidēja stipruma antioksidantiem, kas mūsu gadījumā ietver polifenolus – flavonoīdus un tanīnus. Aveņu augļu infūzijai (4. att., D) ir jūtama hemiluminiscences samazināšanās plato līmenī, kas raksturīga vājiem antioksidantiem, kas šajā gadījumā ir tokoferols. Runājot par kvercetīnu un tokoferolu, aveņu infūzija satur 4,7 ± 0,9 µmol/g kvercetīna un 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferola.

Salīdzinot četru pētīto augu materiālu ūdens ekstraktu dažādām koncentrācijām iegūtās hemiluminiscences līknes, tika parādīts, ka vidējo un vājo antioksidantu devums kopējā paraugu antioksidanta kapacitātē samazinājās šādās sērijās: aveņu infūzija (4. att.). , D), mežrozīšu novārījums (4. att., B), pīlādžu augļu novārījums (4. att., A), vilkābeles augļu novārījums (4. att., B). AS vērtības, kas balstītas uz pētāmās vielas koncentrāciju C kivetē, un kopējās antioksidanta kapacitātes vērtības kvercetīna izteiksmē ir norādītas tabulā.

REZULTĀTU APSPRIEŠANA

Eksperimentu laikā iegūtie dati un uz to pamata aprēķinātās pētāmo objektu OAE vērtības tika salīdzinātas ar tajos esošo galveno antioksidantu saturu, kas noteikts, izmantojot ķīmiskās analīzes metodes. Neskatoties uz to, ka pozitīvā korelācija starp kopējo antioksidantu daudzumu un TAU dažādos objektos ir nenoliedzama, tomēr starp šiem rādītājiem ir manāmas atšķirības. Piemēram, ja ņemam flavonoīdu, tanīnu un askorbīnskābes satura summu, tad tā izrādās lielāka par aprēķināto TAU visiem pētītajiem objektiem, izņemot vilkābeles augļu novārījumu (tabula).

Citi pētnieki arī ir parādījuši, ka ķīmiskās analīzes rezultāti un TAU vērtība, kas noteikta ar hemiluminiscences metodi, bieži nesakrīt. Ekspluatācijā kopējā antioksidanta kapacitāte, noteikta

46 Laiks, min

Es" "h chi----.

Rīsi. 2. Tokoferola ietekme uz hemiluminiscences kinētiku

Sistēmas komponentu koncentrācijas: luminols - 40 µM, mārrutku peroksidāze - 4 nM, ūdeņraža peroksīds - 100 µM. Līknes: 1 - kontroles paraugs; 2 - 0,01 µM; 3 - 0,025 µM; 4 - 0,06 µM; 5 - 0,1 µM; 6 - 0,2 µM tokoferols.

46 Laiks, min

Rīsi. 3. Kvercetīna ietekme uz hemiluminiscences kinētiku Sistēmas komponentu koncentrācijas: luminols - 40 µM, mārrutku peroksidāze - 4 nM, ūdeņraža peroksīds - 100 µM. Līknes: 1 - kontroles paraugs; 2 - 0,02 µM; 3 - 0,03 µM; 4 - 0,04 µM; 5 - 0,05 µM; 6 - 0,06 µM kvercetīns.

Laiks, min

46 Laiks, min

120 I 100 80\60 40 20

46 Laiks, min

Rīsi. 4. Pīlādžu augļu (A), vilkābele (B), mežrozīšu (C) un aveņu augļu infūzijas (D) novārījumu ietekme uz hemiluminiscences kinētiku Sistēmas komponentu koncentrācijas: luminols - 40 µM, mārrutku peroksidāze - 4 nM, ūdeņraža peroksīds - 100 µM. (A) Līknes: 1 - kontroles paraugs; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l pīlādžu augļu novārījums. (B) Līknes: 1 - kontroles paraugs; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l vilkābeles augļu novārījums. (B) Līknes: 1 - kontroles paraugs; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l mežrozīšu novārījums. (D) Līknes: 1 - kontroles paraugs; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l aveņu uzlējums.

peroksidāzes-luminola-ūdeņraža peroksīda sistēmā korelē ar triterpēna savienojumu saturu. Taču šo pašu autoru darbos, kuros izpētes objekts bija cits augs, viņi nenovēroja OAE korelāciju ar kādas vielu grupas, tostarp flavonoīdu, saturu.

Šādas neatbilstības ir saistītas ar vismaz trim faktoriem. Pirmkārt, svarīga ir antioksidantu aktivitāte, t.i., to mijiedarbības ātrums ar radikāļiem, kas dažādiem augu paraugā iekļautajiem antioksidantiem ir atšķirīgs. Pēc Izmailova teiktā, meksidola, tokoferola un kvercetīna attiecīgo reakciju ātruma konstantes korelē kā 0,04: 2: 60. Otrkārt, katra antioksidanta molekula, nonākot ķīmiskā reakcijā, var pārtvert dažādu skaitu radikāļu. Saskaņā ar darbu kvercetīns, urīnskābe un askorbīnskābe pārtvēra attiecīgi 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 un 0,5 ± 0,2 radikāļus uz vienu reaģējušo antioksidanta molekulu (izmantota hemin-H2O2-luminola sistēma). Treškārt, pētījuma rezultātus varētu ietekmēt peroksidāzes aktivitātes klātbūtne pašu augu paraugos, tāpat kā darbā, kā arī kalcija klātbūtne paraugos, kas, kā redzams darbā, spēj palielināt. mārrutku peroksidāzes aktivitāte noteiktos apstākļos. Tas parasti noved pie vairāk

augstāka CL intensitāte plato nekā kontroles līknēs, ko mēs tomēr neievērojām.

Antioksidanta stehiometriskais koeficients ir vēl svarīgāks. Tā pārtverto radikāļu skaits n ir vienāds ar

kur p ir stehiometriskais koeficients, un Am ir antioksidanta koncentrācijas izmaiņas mērījuma laikā, mūsu gadījumā testējamās vielas sākotnējā koncentrācija testa paraugā.

Gaismas luminiscences summas atšķirība bez antioksidanta un tā klātbūtnē ir proporcionāla n Kopējais pārtverto radikāļu skaits ir vienāds ar n = Y.p. m,

kur ir konkrēta antioksidanta stehiometriskais koeficients, un m ir tā koncentrācija mērījuma laikā

Pētījuma objekts Flavonoīdi, mg%* Tanīni, mg%* Askorbīnskābe, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. vienības TAU, mg% kvercetīns

Pīlādžu augļu novārījums 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Mežrozīšu novārījums 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Vilkābeļu augļu novārījums 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Žāvētu aveņu augļu uzlējums 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Piezīme: * - literatūras dati, . AS - gaismas summas izmaiņas paraugam, rel. vienības, C - parauga koncentrācija kivetē, g/l. Aprēķinātās vērtības ir ticamas p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Rēnija. Kopējais pārtverto radikāļu skaits noteikti nav vienāds ar kopējo antioksidantu daudzumu, jo pt koeficienti ne tikai nav vienādi ar vienību, bet arī būtiski atšķiras dažādiem antioksidantiem.

Vērtība n ir proporcionāla gaismas summu starpībai, kas noteiktā laikā izmērīta starp paraugu, kas satur antioksidantu, un kontroles paraugu, kas nesatur antioksidantus:

kur k ir koeficients, kas ir nemainīgs tādos pašos mērīšanas apstākļos.

Mēs izvēlējāmies nosacījumus augu izejvielu kopējās antioksidanta kapacitātes novērtēšanai, reģistrējot hemiluminiscences kinētiku sistēmā, kas sastāv no mārrutku peroksidāzes, ūdeņraža peroksīda un luminola (komponentu koncentrācijas - attiecīgi 4 nM, 100 µM un 40 µM; 20 mM fosfāts buferšķīdums, pH 7,4),

nodrošināja spēcīgu antioksidantu (askorbīnskābes) un vidēja stipruma antioksidantu (kvercetīna) oksidēšanos 10 minūtēs. Šāds mērījumu ilgums ir ērts un nodrošina nepieciešamo mērījumu kvalitāti.

Ķīmiluminiscences kinētikas analīze parādīja, ka pētītajos objektos (pīlādža augļu, mežrozīšu, vilkābeļu novārījumos un aveņu augļu uzlējumos) galvenie antioksidanti ir vidēja stipruma antioksidanti, tai skaitā flavonoīdi, un vājas stiprības (tokoferols u.c.). Pamatojoties uz hemiluminiscences gaismas summas samazināšanos, tika aprēķināta kopējā antioksidanta kapacitāte pētītajiem objektiem. Iegūto TAU vērtību salīdzinājums ar ķīmiskās analīzes rezultātiem parādīja, ka produkti, kas satur vienādu daudzumu antioksidantu ar dažādām attiecībām, var atšķirties pēc spējas efektīvi aizsargāt organismu no brīvo radikāļu kaitīgās ietekmes. Aprakstītais paņēmiens ir daudzsološs, lai pētītu augu objektus, kas satur dažādu antioksidantu maisījumu. Tajā pašā laikā to raksturo vienkāršība un zemas izpētes izmaksas. Ķīmiluminiscences kinētikas mērīšanas kombinācija ar reakciju matemātisko modelēšanu ne tikai automatizēs TAU noteikšanas procesu, bet arī noteiks atsevišķu antioksidantu grupu devumu indikatorā.

Literatūra

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu A. Brīvie radikāļi kā regulējošo un patoloģisko procesu dalībnieki. In: Grigoriev A.I., Vladimirov Yu.A., redaktori. Pamatzinātnes – medicīna. Biophys. medus. tehn. M.: MAX Press; 2015. sēj. 1. lpp. 38-71.

3. Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V. Antioksidantu izpētes metodes. Chem. rast. izejvielas. 2004. gads; (3): 63-75.

4. Vasiļjevs R. F., Kančeva V. D., Fedorova G. F., Butovska D. I., Trofimovs A. V. Halkonu antioksidanta aktivitāte. Reaģentu un starpproduktu reaktivitātes hemiluminiscences noteikšana un kvantu ķīmiskais aprēķins enerģiju un struktūru. Kinētika un katalīze. 2010. gads; 51 (4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimovs AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

radikāļu izraisīta hemiluminiscence: mehāniskā daudzveidība un antioksidantu testa pamati. Arkivoc. 2007. gads; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Antiradikālās kapacitātes novērtējums ar H2O2-hemīna izraisītu luminola hemiluminiscenci. J Agric Food Chem. 2003. gada 3. decembris; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu A., Proskurnina E. V. Brīvie radikāļi un šūnu ķīmiskā luminiscence. Uspekhi biol. chem. 2009. gads; 49: 341-88.

10. Vladimirov Yu., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Kinētiskā ķīmiskā luminiscence kā brīvo radikāļu reakciju izpētes metode. Biofizika. 2011. gads; 56 (6): 1081-90.

11. Izmailovs D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu A. Antioksidantu aktivitātes noteikšana, mērot hemiluminiscences kinētiku. Fotobioloģija un fotomedicīna. 2011. gads; 7 (2): 70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminola luminiscence, ko izraisa 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropāna) termolīze. Bezmaksas

Radic Res Commun. 1992. gads; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Par luminola luminiscences slāpēšanas izmantošanu SOD aktivitātes novērtēšanai. Bezmaksas Radic Biol Med. 1994. gada jūnijs; 16 (6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Kopējā antioksidantu potenciāla (TRAP) un kopējās antioksidantu reaktivitātes novērtējums no luminola pastiprinātas ķīmijluminiscences mērījumiem. Bezmaksas Radic Biol Med. 1995. gada februāris; 18 (2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Luminola luminiscējošās peroksidācijas mehānisma izpēte ar apturētas plūsmas metodēm. J Biol Chem. 1968. gada 25. septembris; 243 (18): 4706-14.

21. Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A. Antioksidantu noteikšana ar aktivētu hemiluminiscenci, izmantojot 2,2"-azo-bis(2-amidinopropanu). Vestn. MGU. Ser. 2. Chem 2012;53(3): 187-93.

24. PSRS Veselības ministrija PSRS Valsts farmakopeja XI izd. Vol. 2 “Vispārīgās analīzes metodes. Ārstniecības augu izejvielas." M.: Medicīna; 1987. lpp. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Mežrozīšu ekstrakcijas preparātu izpēte. Aptieka. 2012. gads; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Vilkābeļu augļu izpēte, izmantojot dažādas konservēšanas un ūdens ekstrakcijas metodes. Aptieka. 2010. gads; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya V. Augļu bioloģiski aktīvās vielas un parasto aveņu ūdens ekstrakti. Aptieka. 2014. gads; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Vilkābeļu augļu bioloģiski aktīvo vielu izpēte - izejvielas homeopātisko matricu tinktūru pagatavošanai. Sestdien zinātnisks tr. pamatojoties uz materiāliem no Maskavas XXIV. starptautiskā homeopāts. konf. “Homeopātiskās metodes attīstība mūsdienu medicīnā”; 2014. gada 24.-25. janvāris; Maskava. M.; 2014. lpp. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Dažādu konservēšanas metožu ārstniecības augu izejvielu bioloģiski aktīvo vielu sastāva izpēte. Sestdien tēzes, kuru pamatā ir XX Ross materiāli. valsts kongr. "Cilvēks un medicīna"; 2013. gada 15.-19. aprīlis; Maskava. M.: EKOOnis; 2013. lpp. 184-90.

30. Aleksandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Peroksidāzes aktivitātes izpēte mārrutku sakneņu un sakņu ekstraktos un tās stabilitāte pret dažādām ietekmēm. Vestn. Maskavas Valsts universitāte. Ser. 2. Chem. 2006. gads; 47 (5): 350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Svobodnye radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. In: Grigor"ev AI, Vladimirov YuA, editors. Fundamental"nye nauki - medicitsine. Biofizicheskie meditsinskie technologii. Maskava: MAKS Press; 2015. v. 1. lpp. 38-71. krievu valoda.

2. Chanda S, Dave R. In vitro modeļi antioksidantu aktivitātes novērtēšanai un daži ārstniecības augi, kam piemīt antioksidanta īpašības: pārskats. Afr J Microbiol Res. 2009. gada decembris; 3 (13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal"tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Himija Rastitel"nogo Syr"ja. 2004; (3): 63-75. Krievu val.

4. Vasil"ev RF, K""ncheva VD, Fedorova GF, B""tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" halkonovs. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Kinētika un katalīze. 2010. gads; 51 (4): 533-41. krievu valoda.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA u.c. Ar kurkumīnu saistīto savienojumu antioksidantu potenciāls pētīts ar hemiluminiscences kinētiku, ķēdes pārraušanas efektivitāti, attīrīšanas aktivitāti (ORAC) un DFT aprēķiniem. Beilstein J Org Chem. 2015. gada 11. augusts; 11: 1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-radical-mediated chemiluminescence: mechanistic diversity and basics for antioxidant assay. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil"ev RF. Vienkāršs ķīmiskās luminiscences tests augu lipīdu antioksidatīvajām īpašībām: pamati un ilustratīvi piemēri. Analyst. 2009 Oct; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Antiradikālās kapacitātes novērtējums ar H2O2-hemīna izraisītu luminolu

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Svobodnye radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009. gads; 49: 341-88. krievu valoda.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya kak metod izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. Biofizika. 2011. gads; 56 (6): 1081-90. krievu valoda.

11. Izmailovs Dju, Demins EM, Vladimirovs YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobioloģija un fotomedicīna. 2011. gads; 7 (2): 70-6. krievu valoda.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminola luminiscence, ko izraisa 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropāna) termolīze. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Par luminola luminiscences slāpēšanas izmantošanu SOD aktivitātes novērtēšanai. Bezmaksas Radic Biol Med. 1994. gada jūnijs; 16 (6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Redzama chemiluminescence, kas saistīta ar reakciju starp methemoglobīnu vai oksihemoglobīnu ar ūdeņraža peroksīdu. Photochem Photobiol. 1994. gada nov.; 60 (5): 405-11.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Kopējā antioksidantu potenciāla (TRAP) un kopējās antioksidantu reaktivitātes novērtējums no luminola pastiprinātas hemiluminiscences mērījumiem. Bezmaksas Radic Biol Med. 1995. gada februāris; 18 (2): 153-8.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV u.c. Liposomu flavonolu antioksidantu aktivitātes novērtējums in vitro ar HRP-H2O2-luminola sistēmu. J Mikrokapsula. 2011. gads; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Mehānisma izpēte

luminola luminiscējošā peroksidācija ar apturētas plūsmas metodēm. J Biol Chem. 1968. gada 25. septembris; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Fitoķīmiskās īpašības, brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitātes un piecu ārstniecības augu ekstraktu neiroaizsardzība. Evid Based Complement Alternatīvā Med. 2012. gads; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10. augusts.

19. Chang CL, Lin CS. Terminalia chebula Retzius ekstraktu fitoķīmiskais sastāvs, antioksidanta aktivitāte un neiroprotektīvā iedarbība. Evid Based Complement Alternatīvā Med. 2012. gads; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011, 5. jūlijs.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Dažādu flavonoīdu antioksidantu aktivitātes novērtējums ar hemiluminiscences metodi. AAPS PharmSci. 2003. gads; 5 (2): 111-5.

21. Aleksejevs AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Antioksidantu aktivizēšanas metode khemilyuminestsentsii spol "zovaniem 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Maskavas universitātes ķīmijas biļetens. 2012. gads; 53 (3): 187-93. krievu valoda.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Optimizētas hemiluminiscences testa pielietošana augu ekstraktu antioksidantu kapacitātes noteikšanai. Luminiscence. 2012. gada novembris–decembris; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Kopējais zemas molekulmasas antioksidantu daudzums kā kopsavilkuma parametrs, kas kvantitatīvi noteikts bioloģiskajos paraugos ar ķīmijluminiscences inhibīcijas testu. Nat Protoc. 2010. gada septembris; 5 (10): 1627-34.

24. Ministrstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11. izd. Iss. 2. "Obshchie metody analīze."

Lekarstvennoe rastitel "noe syr"e". Maskava: Medltsina; 1987. 147.-8.lpp. Krievu val.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatov shipovnika. Aptieka. 2012. gads; (2): 14-6. krievu valoda.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsija. 2010. gads; (5): 16-8. krievu valoda.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsija. 2014. gads; (1): 8-10. krievu valoda.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr"ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Proceedings of the 14th Moscow International Homeopathic Conference "Razvitie gomeopaticheskogo methoda v. 2 Jan 14. lpp 7. Krievu val .

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicalheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr"e razlichnykh sposobov konservatsii. Krievijas 20. nacionālā kongresa “Chelovek i lekarstvo” materiāli; 2013. gada 1519. aprīlis; Maskava. Maskava: EkOOnis; 2013. lpp. 184-90. krievu valoda.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktakh iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil"nosti k razlichnym vozdeistviyam. Moscow University Chemistry Bulletin. 2006; 47 (5): 350-2. Russian.

1 Milentjevs V.N. 2Saņņikovs D.P. 3Kazmins V.M. 2

1 Federālā valsts budžeta augstākās profesionālās izglītības iestāde "Oryol State Institute of Economics and Trade"

2 Federālā valsts budžeta iestāde “Ķīmiskās apstrādes un lauksaimniecības radioloģijas centrs “Orlovsky”

3 Federālā valsts budžeta augstākās profesionālās izglītības iestāde "Valsts universitāte — izglītības, pētniecības un ražošanas komplekss"

hemiluminiscence

antioksidanta aktivitāte

peroksīdi

barības vielas

1. Vasiļjevs R.F. Ķīmiskais spīdums // Ķīmija un ķīmiķi, 01.21.10. - URL: http://chemistry-chemists.com. (piekļuves datums: 22.08.13.).

2. Vladimirovs Yu.A. Brīvie radikāļi un antioksidanti // Vestn. RAMS. – 1998. – Nr.7. – 43.–51.lpp.

3. Kondrašova E.A. Ķīmiluminiscence kā jutīgākā enzīmu imūnanalīzes metode un tās pielietojums // Klīniskā laboratorijas diagnostika. – 1999. – Nr.9. – 32.lpp.

4. Ļubimovs, G.Ju. Ķīmiluminiscences analīze // Imunoloģija. – 1991. – Nr.1. – 40.–49.lpp.

5. Majanskis A.N., Ņevmjatuļins A.L., Čebotars I.V. Reaktīvā hemiluminiscence fagocitozes sistēmā // Mikrobioloģija. – 1987. – Nr.1. – P. 109–115.

6. Šerstņevs M.P. No kalcija atkarīgi un no kalcija neatkarīgi ceļi šūnu hemiluminiscences ģenerēšanai // Ķīmiluminiscences jautājumi. – 1991. – Nr.2. – P. 1–4.

Mūsdienās ķīmiluminiscence ir liela zinātnes joma, kas atrodas saskarsmē starp ķīmiju, fiziku un bioloģiju. Ar hemiluminiscenci notiek tieša ķīmiskās enerģijas pārvēršana elektromagnētisko vibrāciju enerģijā, t.i. pasaulē Izmantojot hemiluminiscenci, var uzzināt, kā notiek reakcija, kāds ir tās mehānisms, kas nepieciešams tehnoloģisko procesu efektīvai un produktīvai īstenošanai. Ja ķīmiskā produkta ražošanas tehnoloģisko procesu pavada hemiluminiscence, tad tās intensitāte var kalpot par procesa ātruma mērauklu: jo ātrāka reakcija, jo spilgtāks spīdums. Ķīmiluminiscences reakcijas laikā tiek iegūti enerģētiski bagāti produkti, kas pēc tam, izstarojot gaismu, atbrīvo enerģiju, t.i., ķīmiskā enerģija tiek pārvērsta elektromagnētiskā starojuma enerģijā.

Pētījuma mērķis ir izpētīt iespēju izmantot hemiluminiscenci, lai novērtētu barības vielu antioksidantu aktivitāti.

Pētījuma rezultāti un diskusija

Ļoti aktuāla ir barības vielu antioksidantu aktivitātes novērtēšanas problēma. Termina “antioksidanta aktivitāte” lietošana, lai parādītu konkrēta produkta lietderību, bieži tiek veikta bez jebkādas ķīmiskas vai bioķīmiskas argumentācijas. Kā likums, jebkuras vielas antioksidanta aktivitāte nozīmē peroksīda vērtības samazināšanas efektivitāti. Arī pati peroksīda vērtības koncepcija pilnībā neatklāj tā ķīmisko būtību, jo tā pilnībā neatbilst konkrēta pārtikas produkta metabolisma posmu kinētikai un termodinamikai. Turklāt šo vērtību izmanto, lai raksturotu lipīdus tauku veidā. Taču oksidēšanās un peroksīdu veidošanās procesi organismā notiek ne tikai uzņemot taukus, bet arī citus pārtikas produktus. Citiem vārdiem sakot, var teikt, ka peroksīda saturs konkrētā produktā ir “nosvērts” uz sava veida skalas, kur “atskaites svars” ir peroksīdu oksidētā jodīda jona koncentrācijas vienība skābā vidē. kā rezultātā veidojas molekulārais jods:

I- - e → I; (1)

I + I → I20. (2)

Titrējot molekulāro jodu ar nātrija tiosulfātu saturošu šķīdumu, tiek noteikta tā koncentrācija un līdz ar to tiek noteikts oksidējošo jodīda jonu daudzums, t.i. peroksīda savienojumi, ko patiesībā sauc par peroksīda skaitli. Peroksīda skaitļa noteikšana, izmantojot šāda veida “svēršanu”, balstās uz reakciju, kas parādīta attēlā. 1.

Rīsi. 1. Peroksīda vērtības noteikšana, izmantojot nātrija tiosulfātu

Tādējādi peroksīdu koncentrāciju nosaka pēc vienādojuma

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

kur ϒ ir korelācijas koeficients starp molekulārā joda koncentrāciju un peroksīdu koncentrāciju.

Mūsu piedāvātā metode peroksīdu noteikšanai produktos ir balstīta uz luminola (C[lm]) hemiluminiscenci sārmainā vidē, kuras intensitāte (Ichl) ir atkarīga no peroksīdu (C[-O-O-]) koncentrācijas hemiluminiscē. paraugs:

IHL = Ϧхл ω, (4)

kur Ϧhl ir hemiluminiscences kvantu iznākums; ω - reakcijas ātrums ar peroksīdiem:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

kur khl ir reakcijas ātruma konstante vai pie:

C[lm] khl Ϧkhl = K, (6)

IHL = K C[ -O-O-]. (7).

Peroksīdu daudzumu (-O-O-) nosaka gaismas summa (S):

S vērtība ir atkarīga no peroksīda pilnīga patēriņa pakāpes hemiluminiscences reakcijā.

Lai noteiktu konstanti K, tiek konstruēta kalibrēšanas līkne gaismas summas S atkarībai no peroksīda koncentrācijas, ko nosaka titrējot:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Ūdeņraža peroksīdu H2O2 izmanto kā peroksīdus.

Pēc tam tiek salīdzināti dati, kas iegūti no (3) un (9) vienādojuma. Pamatojoties uz ϒ un K salīdzinājumu, tiek izdarīts secinājums par reakcijas mehānismu sakritību, kas ir pamatā peroksīdu noteikšanai ar šīm metodēm. Tika atklāts, ka šajā peroksīda koncentrāciju diapazonā ϒ un K faktiski sakrīt viens ar otru un tāpēc tos var izmantot peroksīda skaita noteikšanai.

Ķīmiluminiscence tika novērota sārmainā vidē, kas satur luminolu (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindions, 3-aminoftalskābes hidrazīds, H2L). Tas tika ierakstīts, izmantojot hemiluminiscējošu iestatījumu, ieskaitot stikla vakuuma fotopavairotāju. Fotopavairotāju darbina augstsprieguma taisngriezis (7), kas savienots ar bloku (9), kas pastiprina fotopavairotāja signālu, kas tiek ierakstīts datora monitora displejā (5).

Rīsi. 2. Analizētā produkta hemiluminiscences reģistrēšana: 1 - dozēšanas sūknis; 2 - gaismas necaurlaidīga kamera; 3 - spogulis; 4 - kivete; 5 - datorsistēma; 6 - fotopavairotājs; 7 - augstsprieguma taisngriezis; 8 - ierīce, kas ļauj noteikt hemiluminiscējošā starojuma spektrālo apgabalu; 9 - bloks, kas pastiprina fotopavairotāja signālu

Dozēšanas sūknis (1) ir nepieciešams, lai analizēto paraugu ievadītu kivetē (4), kas satur hemiluminiscējošu luminola šķīdumu. Šis dozators darbojas kā maisītājs ievadītajam paraugam ar hemiluminiscējošu šķīdumu. Lai palielinātu reakcijas ātrumu un hemiluminiscences intensitāti, luminolam tika pievienots kālija dzelzs sulfīda šķīdums. Sajaukšanu veic ar gaisa burbuļiem, kas iegūti, sūknējot gaisu caur šķīduma šķidrumu. Spogulis (3), kas atrodas gaismas necaurlaidīgajā kamerā (2), kalpo labākai hemiluminiscējošā starojuma gaismas savākšanai, kas krīt uz fotopavairotāja (6) fotokatodu, kas uzstādīts gaismas necaurlaidīgajā kamerā. Dozators ļauj ievadīt nepieciešamos šķidros komponentus kivetē, eksperimentu laikā neatverot gaismas necaurlaidīgo kameru (2). Šajā gadījumā šie šķidrumi iekļūst kivetē (4) caur stikla vai plastmasas caurulēm. Datorsistēma ļauj reģistrēt spīduma intensitātes I atkarību no laika t, tas ir, hemiluminiscences kinētiku:

Datorsistēma atspoguļo pieauguma un krituma konstantes funkcijā I = f(t), kas ir saistītas ar to reakciju ātruma konstantēm, kas izraisa hemiluminiscenci, tas ir, ar to kinētiku. Ķīmiluminiscences kamerā ir iekļauta ierīce (8), kas ļauj noteikt hemiluminiscējošā starojuma spektrālo apgabalu, tas ir, atkarību:

I = f1(λ). (vienpadsmit)

Šis bloks ir diska formas kasete, kurā ir uzstādīti robežfiltri. Filtru maiņa tiek veikta, pagriežot diska kaseti attiecībā pret horizontālo asi, kas savieno filtru plaknes centrus un fotopavairotāja fotokatoda plakni.

Mērīšanas process tiek veikts šādi:

1. Tiek noteikta fotopavairotāja reakcija uz tā barošanas sprieguma izmaiņām un uz tā katoda krītošā atskaites gaismas avota intensitātes izmaiņām.

2. Kiveti piepilda ar luminola šķīdumu sārmainā vidē.

3. Dozatoru piepilda ar analizēto paraugu.

4. Reģistrēta hemiluminiscences intensitātes atkarība no laika t. Ķīmiluminiscences novērojumus veic līdz laikam t1, kurā I1 izmaiņas no laika t ir minimālas: I1 = f1(t).

5. Daļa analizētā šķīduma tiek piegādāta, izmantojot dozatoru.

6. Tiek novērota analizētā parauga hemiluminiscence, kuras kinētika ir I = f(t).

Attēlā 3. attēlā parādīts ar grafiku (I = f(t)) saistīto funkciju (I1 = f1(t)) atkarības grafiks pēc analizējamā risinājuma ieviešanas.

Kā redzams no att. 3, mainās luminola hemiluminiscences intensitāte: pēc analizētā parauga pievienošanas krasam luminiscences pieaugumam seko straujš luminiscences kritums.

Tā kā hemiluminiscences palielināšanās luminola oksidācijas laikā ir saistīta ar peroksīdu veidošanos, ķīmijluminiscences intensitātes samazināšanās pēc analizētā parauga ievadīšanas norāda uz to daudzuma samazināšanos. Līdz ar to var runāt par antioksidantu aktivitātes klātbūtni analizētajā paraugā iekļautajos savienojumos.

Jāpiebilst, ka analizētais paraugs bija pieneņu ekstrakts, kas iegūts sausā zemas temperatūras destilācijā, kas satur fenola savienojumus, kas pazīstami ar savu augsto antioksidanta aktivitāti.

Rīsi. 3. Funkcijas atkarības grafiks (I1 = f1(t)), kas savienots ar grafiku (I = f(t)), pēc analizējamā risinājuma ieviešanas

Turklāt eksperimentā tika noskaidrots, ka, izmantojot hemiluminiscenci, ir iespējams noteikt peroksīdu daudzumu ultraatšķaidītās sistēmās, kas ir svarīgi, lai novērtētu produktu oksidēšanās sākumu, piemēram, uzglabāšanas laikā.

Tādējādi pētījumos ir pierādīts, ka peroksīdu noteikšanas metode produktos, kas balstīta uz luminola hemiluminiscenci sārmainā vidē, ļauj novērtēt pārtikas vielu antioksidantu aktivitāti un var tikt izmantota dažādu pārtikas savienojumu antioksidantu īpašību noteikšanai. .

Recenzenti:

Ļitvinova E.V., tehnisko zinātņu doktore, Tehnoloģiju, organizācijas un pārtikas higiēnas katedras profesore, Federālā valsts budžeta profesionālās augstākās izglītības iestāde "OrelGIET", Orel;

Kovaleva O.A., bioloģijas zinātņu doktore, institūta direktore, Federālā valsts budžeta augstākās profesionālās izglītības iestāde "Oryol State Agrarian University", Orel.

Darbs redaktorā saņemts 2013. gada 8. novembrī.

Bibliogrāfiskā saite

Paņičkins A.V., Boļšakova L.S., Milentjevs V.N., Saņņikovs D.P., Kazmins V.M. ĶĪMIMISCES IZMANTOŠANA PĀRTIKAS VIELU ANTIOKSIDĀTO ĪPAŠĪBU NOVĒRTĒŠANAI // Fundamentālie pētījumi. – 2013. – Nr.10-11. – P. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (piekļuves datums: 17.12.2019.). Jūsu uzmanībai piedāvājam izdevniecības "Dabaszinātņu akadēmija" izdotos žurnālus

absolventu darbs

1.4. Antioksidantu izpētes metodes

antioksidanta aktivitāte tiek klasificēta: pēc AOA reģistrēšanas metodēm (volumetriskā, fotometriskā, hemiluminiscējošā, fluorescējošā, elektroķīmiskā); pēc oksidācijas avota veida; pēc oksidējamā savienojuma veida; ar oksidētā savienojuma mērīšanas metodi.

Tomēr vispazīstamākās metodes antioksidantu aktivitātes noteikšanai ir:

1 TEAC (troloksa ekvivalenta antioksidanta jauda): metodes pamatā ir šāda reakcija:

Metmioglobīns + H 2 O 2 > Ferilglobīns + ABTS > ABTS * + AO.

Trolox ekvivalentu metode (TEAC) ir balstīta uz antioksidantu spēju reducēt 2,2-azinobisa radikāļu katjonus (ABTS) un tādējādi kavēt absorbciju spektra garā viļņa garumā (600 nm). Būtisks metodes trūkums ir divpakāpju reakcija, lai radītu radikāli. Tas pagarina analīzes laiku un var palielināt rezultātu izkliedi, neskatoties uz to, ka analīzei tiek izmantots standartizēts reaģentu komplekts.

2 FRAP (dzelzs reducējošais antioksidanta spēks): metodes pamatā ir šāda reakcija:

Fe(III)-Tripiriditriazīns+AO>Fe(II)-Tripiridiltriazīns.

Dzelzs reducējošā/antioksidanta spēja (FRAP). Šeit izmantotā reakcija ir Fe(III)-tripiridiltriazīna reducēšana par Fe(II)-tripiridiltriazīnu. Tomēr šī metode nevar noteikt dažus antioksidantus, piemēram, glutationu. Šī metode ļauj tieši noteikt zemas molekulmasas antioksidantus. Pie zema pH Fe(III)-tripiridiltriazīna kompleksa reducēšanās līdz Fe(II) kompleksam tiek papildināta ar intensīvi zilas krāsas parādīšanos. Mērījumu pamatā ir antioksidantu spēja nomākt reakcijas maisījumā radušos reakcijas veidu oksidatīvo efektu. Šī metode ir vienkārša, ātra un lēta.

3 ORAC (skābekļa radikāļu absorbcijas spēja): metodes pamatā ir šāda reakcija:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Luminol.

Skābekļa radikāļu absorbcijas spējas (ORAC) noteikšana. Šajā metodē tiek reģistrēta substrāta (fikoeritrīna vai fluoresceīna) fluorescence, kas rodas tā mijiedarbības ar ROS rezultātā. Ja testa paraugs satur antioksidantus, tad salīdzinājumā ar kontroles paraugu tiek novērota fluorescences samazināšanās. Šo metodi sākotnēji izstrādāja Dr. Guohua Kao Nacionālajā novecošanas institūtā 1992. gadā. 1996. gadā Dr. Kao sadarbojās ar Dr. Ronaldu Pjēru apvienotā grupā USDA Novecošanās pētniecības centrā, kur tika izmantota pusautomātiskā metode. izveidots.

4 TRAP (kopējais radikāļu slazdošanas antioksidanta parametrs): metodes pamatā ir šāda reakcija:

AAPH+AO>AAPH*+PL (FE).

Šī metode izmanto antioksidantu spēju mijiedarboties ar peroksilradikāļu 2,2-azobis(2-amidinopropāna) dihidrohlorīdu (AAPH). TRAP modifikācijas ietver analītiskā signāla reģistrēšanas metodes. Visbiežāk analīzes beigu posmā peroksiradikālis AAPH mijiedarbojas ar luminiscējošu (luminolu), fluorescējošu (dihlorfluoresceīna diacetāts, DCFH-DA) vai citu optiski aktīvu substrātu.

Ūdenī šķīstošais E vitamīna atvasinājums Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhromān-2-karbonskābe) tiek izmantots kā standarts TEAC, ORAC un TRAP metodēm.

Pēdējā laikā ir pieaugusi interese par elektroķīmisko metožu izmantošanu, lai novērtētu antioksidantu aktivitāti. Šīm metodēm ir augsta jutība un ātra analīze.

Atsevišķu pārtikas produktu antioksidantu aktivitātes novērtējums tiek veikts ar potenciometrijas metodi, pamatojoties uz antioksidantu vielu īpašību izmantošanu piedalīties redoksreakcijās enola (-OH) un sulfhidril (-SH) grupu ietekmē.

Šķīdumu antioksidantu īpašību noteikšana balstās uz antioksidantu ķīmisko mijiedarbību ar mediatoru sistēmu, kas izraisa tā redokspotenciāla izmaiņas. Elektroķīmiskā šūna ir tvertne, kurā ir K-Na-fosfāta buferšķīdums, Fe(III)/Fe(II) mediatora sistēma un komplekss elektrods pirms redokspotenciāla mērīšanas. Antioksidantu aktivitāte tiek novērtēta g-ekv/l.

Amperometriskā metode antioksidanta aktivitātes noteikšanai ir balstīta uz elektriskās strāvas mērīšanu, kas rodas testējamās vielas oksidēšanās laikā uz darba elektroda virsmas, kas atrodas zem noteikta potenciāla. Amperometriskās metodes jutīgumu nosaka gan darba elektroda raksturs, gan tam pielietotais potenciāls. Polifenolu un flavonoīdu amperometriskā detektora noteikšanas robeža pie tik zemām koncentrācijām ir mazāka dažādu antioksidantu savstarpējās ietekmes iespējamība, kad tie atrodas kopā, jo īpaši sinerģijas fenomena izpausme; . Metodes trūkumi ietver tās specifiku: šajos apstākļos nevar analizēt antioksidantus, kas paši oksidējas vai reducējas skābekļa elektroreducēšanas potenciālu reģionā. Metodes priekšrocības ietver tās ātrumu, prostatu un jutīgumu.

Galvanostatiskās kulometrijas metode, izmantojot elektriski ģenerētus oksidētājus - metode ir pielietojama taukos šķīstošo antioksidantu analīzei.

Askorbīnskābes noteikšanai ir izstrādātas dažādas metodes:

amperometriskā metode, izmantojot alumīnija elektrodu, kas modificēts ar niķeļa (II) heksacianoferāta plēvi, vienkārši iegremdējot šķīdumā;

metode askorbīnskābes cietās fāzes spektrofotometriskai un vizuālai testa noteikšanai, izmantojot ar Vāvela reaģentu modificētu silīcijskābes kserogelu un kā indikatorpulveri varu (II);

askorbīnskābes hemiluminiscences noteikšanu var veikt ar plūsmas-injekcijas metodi, izmantojot rodamīna B hemiluminiscējošu reakciju ar cēriju (IV) sērskābes vidē.

askorbīnskābes noteikšana diapazonā no 10 -8 -10 -3 g/cm 3 ar anodisko voltammetriju ūdens un ūdens-organiskā vidē.

Visizplatītākā ir FRAP metode, jo tā ir ātra un ļoti jutīga. Pēdējo desmitgažu laikā ir izstrādāts liels skaits metožu veidu antioksidantu aktivitātes noteikšanai, izmantojot FRAP metodi (1. tabula).

1. tabula FRAP metodes izstrāde un pielietojums dažādu objektu antioksidantu aktivitātes noteikšanai

	Analīzes objekti	Piezīmes
	Asins plazma	t = 4 min. Tika pētīta reakcijas stehiometrija un aditivitāte.
	Tēja, vīns	AOA noteikšana polifenolu dēļ
		Tika salīdzinātas dažādu tējas šķirņu AOA vērtības
Pulido, Bravo, Saura-Kaliksto	Modeļu risinājumi	t=30 min. Tika atklāta neūdens šķīdinātāja ietekme
	Augi
	Asinis, audi	PIA metode. Pārbaudīta svešķermeņu ietekme.
Firuzi, Lacanna, Petrucci u.c.	Modeļu risinājumi	Tika pētīta dažādu AO noteikšanas jutība atkarībā no to struktūras un redokspotenciāla.
Kataliničs, Milošs,	Dažādi vīni
Temerdaševs, Cjupko un citi.	Modeļu maisījumi
Loginova, Konovalova	Zāles Zāles	Pārbaudes metode
Temerdaševs, Cjupko un citi.	Sausie sarkanvīni	AOA korelācija ar citiem vīna kvalitātes rādītājiem
1. tabulas turpinājums
	Modeļu maisījumi	Tika pētīta dažādu AO noteikšanas jutība
Veršinins, Vlasova, Ciupko	Modeļu maisījumi	Tika konstatēts, ka signāls nav piedevas, ja trūka oksidētāja
Aņisimovičs, Deineka un citi.	Modeļu risinājumi	Ir ierosināti kinētiskie parametri AOA novērtēšanai.

Piezīmes: parasti apzīmētas: FIA plūsmas injekcijas analīze, TPTZ-tripiridiltriazīns, DIP-2,2,-dipiridils, PHEN-o-fenantrolīns, DPA-piridīna dikarbonskābe, FZ-ferrozīns, AA-askorbīnskābe, CT-katehols, t -ekspozīcijas laiks, min.

Olbaltumvielu un polielektrolītu mijiedarbība ūdens šķīdumos

Proteīna-polielektrolītu kompleksu raksturošanai tiek izmantotas dažādas analītiskās metodes. Instrumentālās metodes sniedz informāciju par strukturālajām un optiskajām īpašībām, kā arī nosaka PEC saistīšanās dinamiku un raksturu...

D-metāla savienojumu ietekme uz ūdens molekulas disociācijas ātrumu bipolārā membrānā

Jaunu BPM sintezēšanas procesā liela uzmanība jāpievērš iegūto paraugu īpašību izpētei turpmākai sintēzes apstākļu izvēlei, kas nodrošina sintezējamo membrānu elektroķīmisko īpašību uzlabošanu...

Dizaineru narkotikas un sintētiskie kanabinoīdi

Sintētisko kanabinoīdu noteikšanu augu maisījumos var veikt ar dažādām fizikāli ķīmiskām metodēm, piemēram, hromatogrāfijas-masas spektrometriju, gāzu hromatogrāfiju, plānslāņa hromatogrāfiju un augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju...

Metodes izstrāde flavonoīdu noteikšanai ārstniecības augu materiālos

Hinolinonu sintēze un farmakoloģiskās īpašības-2

Pētījuma objekts: Hinolinons-2. Pētījuma metode: Izmantojot datorprogrammu “Marvin JS”, tika izveidota vielas struktūra. Pēc tam viņa tika nosūtīta uz vietni “http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php” turpmākai izpētei...

Termiskā spektrālā metode epoksīda polimēru iztvaikošanas produktu izpētei

Tehnoloģija augsti attīrīta hitozāna iegūšanai no vēžveidīgo čaumalām

Hitozāna molekulmasas noteikšana Hitozāna molekulmasu noteica viskozimetriski, izmantojot standarta metodi. Šķīdumus ar koncentrāciju 0,05 un 0,5 g/dl pagatavoja, izšķīdinot polimēra pulvera paraugu acetāta buferšķīdumā (0...

Dabas parka teritorijas fiziogrāfiskais raksturojums

Kopējās antioksidantu aktivitātes noteikšanas metode. Racionāls uzturs, pārtikas piedevas un biostimulanti Trap metode antioksidantu aktivitātes noteikšanai

Bibliogrāfiskā saite

anotācija zinātniskais raksts par ķīmijas zinātnēm, zinātniskā darba autors - Georgijs Konstantinovičs Vladimirovs, E. V. Sergunova, D. Ju., A. Vladimirovs

Saistītās tēmas zinātniskie darbi ķīmijas zinātnēs, zinātniskā darba autors - Georgijs Konstantinovičs Vladimirovs, E. V. Sergunova, D. Ju., A. Vladimirovs

Kopējās antioksidantu kapacitātes hemiluminescenta noteikšana ārstniecības augu materiālā

Zinātniskā darba teksts par tēmu “Ķīmiluminiscences metode kopējās antioksidanta kapacitātes noteikšanai ārstniecības augu materiālos”

Bibliogrāfiskā saite

1.4. Antioksidantu izpētes metodes

Ziņot par drukas kļūdu

Teksts, kas tiks nosūtīts mūsu redaktoriem:

Jūsu komentārs (pēc izvēles):