El significado de los números es 1 128 sífilis. Métodos básicos para diagnosticar la sífilis y decodificar indicadores.

La sífilis se considera una enfermedad venérea, cuyo principal culpable es el treponema pálido. Las bacterias especificadas pueden ingresar al cuerpo después de las relaciones sexuales o mediante el uso doméstico.

Las medidas de diagnóstico destinadas a identificar esta enfermedad son de naturaleza compleja. Los resultados de la prueba pueden verse afectados por varios antibióticos, el embarazo y otros factores que se describirán en el artículo.

Cuando se prescribe un análisis para la sífilis: indicaciones para el diagnóstico

Algunos pacientes, que acuden para ser examinados por un ginecólogo o un andrólogo, no brindan información objetiva sobre la calidad de su vida sexual.

Quizás la razón sea la vergüenza habitual, o quizás la razón sea la falta de información en el campo de las enfermedades de transmisión sexual.

El médico puede enviar para un examen incluso si la sífilis no se manifiesta de ninguna manera, y el paciente está 100% seguro de que no podría infectarse con esta dolencia. El caso es que la patología en cuestión se puede transmitir a través del contacto domiciliario, o estar asintomático.

Se prescriben pruebas para la sífilis si:

• Debe registrarse durante el embarazo.
• El paciente desea donar sangre como donante.
• Existe la posibilidad de asumir un determinado puesto (soldado, paramédico, cocinero, etc.), que requiere pasar una comisión médica especial.
• Una persona está en lugares de prisión.
• Hubo una relación sexual con un paciente con sífilis.
• La madre de un bebé recién nacido está enferma de sífilis.
• El paciente presentaba signos de la dolencia indicada. A menudo, se trata de erupciones en el área genital.
• El primer análisis confirmó la presencia de la enfermedad en cuestión.

Se realizan análisis de sangre con regularidad si hay sífilis. Esto es necesario para controlar la calidad del tratamiento.

Después de la terapia, también se extrae sangre del paciente para la investigación.

Cómo hacerse la prueba de sífilis correctamente -

Para manipulaciones de investigación, a menudo usan sangre de una vena... En determinadas situaciones, el asistente de laboratorio puede tomar la muestra deseada para el diagnóstico. del dedo o de la médula espinal.

El intervalo desde el momento de la entrega hasta la recepción de los resultados puede ser diferente: de un día a dos semanas... Todo vendrá determinado por el tipo de prueba.

Al prepararse para la entrega de un análisis de sangre para identificar la dolencia en cuestión, debe cumplir con las siguientes recomendaciones:

• Los alimentos grasos el día anterior a la prueba deben excluirse de la dieta. Provocará la opalescencia del suero sanguíneo, lo que distorsionará los resultados obtenidos.
• Debe abstenerse de comer durante al menos 8 horas. antes de la prueba de sífilis.
• El alcohol, la nicotina pueden interferir con la evaluación de la respuesta. Los expertos aconsejan no beber bebidas que contengan alcohol 24 horas antes de las pruebas, y debe esperar con los cigarrillos al menos una hora antes del examen.
• Si el paciente está tomando antibióticos., el análisis especificado debe realizarse al menos una semana después del final del tratamiento.

Métodos para enviar material para investigación y descifrar indicadores.

Hoy en día, ninguno de los métodos de diagnóstico de esta enfermedad puede garantizar la veracidad de la información recibida. En cualquier caso, hay errores y pueden llegar al 10%.

En este sentido, aplique un conjunto de métodos de investigación.

Análisis serológico: pruebas específicas y no específicas

Este tipo de diagnóstico está indicado con síntomas limitados de la enfermedad o en su completa ausencia.

El serodiagnóstico es de dos tipos:

1.Pruebas no específicas

Son relevantes cuando necesita realizar pruebas de sífilis a un grupo grande de personas, pero esta técnica no es adecuada cuando necesita confirmar el diagnóstico.

La prueba es sencilla, pero el médico debe realizar la evaluación final.

Estos tipos de diagnósticos incluyen las siguientes pruebas:

A) Microrreacción de precipitación (MP)

Un estudio similar es indicativo después de un mes después de la infección. La sangre de un dedo está sujeta a examen, pero a veces se puede usar líquido cefalorraquídeo.

Un resultado positivo de la prueba ( el título de anticuerpos varía de 1: 2 a 1: 320 ) no significa que el paciente esté enfermo de sífilis: es posible confirmar finalmente el diagnóstico pasando pruebas adicionales.

Una reacción negativa puede resultar de dos opciones:

• El paciente no tiene sífilis.
• La sífilis está presente, pero en la etapa inicial de desarrollo.

B) Reacción de Wasserman ( PB, RW)

El material de prueba utilizado aquí es el mismo que para el análisis anterior.

Este método de examen puede proporcionar información objetiva al menos 6 semanas después de la infección. Es posible hablar de la presencia de la patología venérea indicada si los títulos de anticuerpos son 1: 2 - 1: 800.

Los resultados de los análisis de RV se evalúan mediante los siguientes signos matemáticos:

• « — »No hay sífilis.
• « + "O" ++ ": se indica una reacción débilmente positiva.
• « +++ "- una reacción positiva.
• « ++++ "- el paciente tiene una reacción muy positiva a la sífilis.

2. Pruebas específicas

Hay muchos análisis diferentes de este tipo de examen que se dirigen a anticuerpos específicos. No aparecen en la sangre de inmediato, sino aproximadamente un mes después de la infección y pueden persistir allí durante varios años (si no se tratan).

El médico debe elegir razonablemente uno u otro tipo de análisis, conocer en detalle cada uno de ellos, guiarse por los resultados obtenidos y ser capaz de diferenciar el diagnóstico tras recibir una respuesta.

Los tipos más comunes de pruebas específicas son:

A) La reacción de inmunofluorescencia (RIF)

Es relevante en las primeras etapas de la sífilis, pero el período óptimo para la prueba es de 6 a 8 semanas después de la infección.

El estudio requiere sangre capilar / venosa.

• En el embarazo, los defectos del tejido conectivo pueden provocar una falsa reacción, que se evalúa con el signo " — «.
• Los resultados positivos se expresan mediante más (" + ") De uno a cuatro.

B) Reacción de aglutinación pasiva (RPHA)

En esta prueba, se extrae una pequeña cantidad de sangre del dedo / vena, que luego se mezcla con glóbulos rojos de carnero / gallo. Si el patógeno de esta enfermedad está presente en el torrente sanguíneo, los microobjetos se pegan, seguidos de su hundimiento.

Este tipo de prueba es muy sensible: puede confirmar una reacción positiva a la sífilis mucho después del tratamiento.

La mononucleosis y los errores en la estructura del tejido conectivo también pueden causar una reacción de falso positivo.

Se necesita un máximo de 1 hora para obtener una respuesta, y los pacientes pueden controlarse a sí mismos 4 semanas después de la infección: en etapas anteriores, los anticuerpos no se producirán en un volumen suficiente.

Puede juzgar cuánto tiempo está la infección en la sangre por los títulos:

• Si su valor no supera 1: 320, la infección ha ocurrido recientemente.
• Cuanto más altos sean los títulos, más tiempo estará el treponema en el cuerpo.

C) Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Uno de los métodos más confiables para diagnosticar esta dolencia, que comenzó a usarse a fines del siglo pasado.

Es muy indicativo ya 21 días después de la infección, y un resultado positivo del 98-99% indicará la presencia de sífilis.

El ELISA se usa a menudo después de pruebas inespecíficas o en combinación con algunas pruebas específicas.

Prueba ELISA mediante la detección de un grupo particular de anticuerpos en la sangre ( IgA, IgM, IgG) permite conocer el estadio de la enfermedad:

• Si la muestra de sangre contieneIgA pero ausenteIgM,IgG: desde el momento en que el treponema pálido entró en el cuerpo, no han pasado más de 14 días.
• Si está identificadoIgA,IgM, pero noIgG: la infección se produjo hace unos 28 días.
• La presencia de todos los anticuerpos enumerados anteriormente en la sangre indica que ha pasado más de un mes desde la infección..
• Si la reacción de la sangre a la presenciaLa IgA es negativa y enIgM,IgG positivo: ha pasado un gran período de tiempo desde el momento de la infección o el tratamiento de la enfermedad fue exitoso.

D) La reacción de inmovilización de treponemas pálidos (RIBT)

Uno de los métodos más populares para diagnosticar la sífilis.

No tiene sentido usarlo en las primeras etapas de la infección, sin embargo, después de la semana 12, los resultados de la prueba RIBT son 99% confiables.

Este método de diagnóstico se utiliza si existe sospecha de neurosífilis, sífilis de órganos internos o en combinación con análisis no específicos.

Cuando se toman antibióticos duraderos, el paciente debe esperar al menos 25 días después del final de la terapia. Los antibióticos solubles en agua tardan menos en eliminarse del cuerpo: 7-8 días.

La sangre se extrae de una vena, en ayunas, y los resultados se interpretan como un porcentaje de inmovilización:

• Si el nivel de inmovilización no supera el 20%, la prueba de sífilis se considera negativa.
• Si se supera el 50%, la reacción a la patología indicada es positiva.

En otros casos, se prescribe un nuevo examen.

E) inmunotransferencia

Uno de los métodos de investigación más nuevos que se utiliza cuando otras pruebas dan resultados cuestionables.

Con la manipulación diagnóstica indicada, es posible detectar incluso una cantidad mínima de anticuerpos en la sangre: tiene una precisión de casi el 100%.

No todas las clínicas realizan este tipo de pruebas: no son baratas.

Análisis de laboratorio

El precio de coste del análisis en cuestión es muy bajo y el resultado se puede encontrar en 30 minutos.

1.Para realizar tal estudio, se toma una muestra del paciente de defectos ulcerativos / erosivos. , que se encuentran en la zona genital. El examen microscópico de una muestra tomada a menudo se lleva a cabo en un laboratorio.

Las áreas afectadas se limpian inicialmente con solución salina. Esto ayudará a proteger el área dañada de la entrada de microorganismos dañinos.

2. Además, usando un bucle especial, irrita la superficie varios minutos hasta que aparezca un líquido blanco transparente. Debe tener más cuidado con esta manipulación: es imposible que las impurezas de la sangre entren en la muestra tomada.

3. El líquido extraído se transfiere a un vaso transparente. A veces se mezcla con solución salina.

Se puede hablar de una reacción positiva cuando se identifican los treponemas típicos, que tendrán al menos 8 rizos. Si el resultado es negativo, el procedimiento se repite (a veces varias veces).

La sífilis trna es una prueba específica destinada a detectar el antígeno IgG. Normalmente, se recurre a este estudio después de recibir un resultado positivo con RPR o para evaluar la efectividad del tratamiento seleccionado. Trna sífilis es una prueba muy sensible que puede mostrar un resultado positivo hasta 20 años después de una terapia exitosa y, en algunos casos, los rastros residuales de la enfermedad pueden persistir por el resto de su vida.

La prueba de la sífilis tpha (reacción de hemaglutinación pasiva) fue propuesta por T.Rathlev en 1965. La esencia del método consistió en la reacción de adhesión y precipitación de eritrocitos, cuya superficie, en la sífilis, contiene antígenos de treponema pallidum, que se observa solo si hay anticuerpos antitreponémicos en la sangre.

Se recomienda realizar el análisis de Trna un mes después de la fecha prevista de infección. Antes de la recolección en sí, debe abstenerse de comer durante al menos 8 horas. Si los resultados de la prueba de trna indican la ausencia de infección, pero el paciente tiene síntomas de los primeros síntomas de infección o en el pasado tuvo relaciones sexuales con una persona que se encontró infectada con espiroquetas, entonces se recomienda realizar otro control. estudio con un intervalo de 2 semanas. A diferencia de un resultado falso negativo para tpha, cuando se utiliza este método para detectar el antígeno IgG, que puede ser causado por una prueba demasiado temprana, se puede observar un resultado falso positivo para treponema pale en tres casos:

• Mononucleosis infecciosa;
• Enfermedad de Lepré;
• Lesiones sistémicas de tejidos conectivos.

En la actualidad, el estudio tpha se utiliza como la prueba serológica específica más eficaz para confirmar un resultado positivo de otras pruebas para la sífilis o, si es necesario, para evaluar la eficacia del tratamiento.

Los resultados de los estudios de la presencia de antígeno IgG no se limitan a solo dos marcas "negativas" o "positivas", los resultados del estudio también indican el título de anticuerpos, por lo que el médico tratante se guía durante el período del paciente. permanecer en el hospital para evaluar la eficacia del efecto terapéutico. Por el tamaño de los títulos, se puede concluir sobre el período actual de infección y el éxito de las medidas terapéuticas. Entonces, los títulos característicos de la primera etapa de la enfermedad varían de 1:80 a 1: 320. Con la transición de la enfermedad a la etapa secundaria, el análisis de la sífilis tpha mostrará un aumento notable en los títulos a 1: 5120, seguido de una disminución en el período de latencia a 1:80. Después de una terapia exitosa, los títulos pueden caer significativamente, pero permanecerán positivos durante muchos años después del alta.

A veces, con una prueba tpha positiva, los títulos son tan bajos que el diagnóstico de sífilis plantea serias dudas. En este caso, se anota la dudosidad de los datos obtenidos y se recomienda repetir la repetición en 1-2 semanas.

Por lo general, las pruebas para la sífilis trn se toman en las horas de la mañana por un período corto de tiempo, lo que se asocia con el requerimiento de un estudio, entre los cuales se indica la necesidad de entregar las muestras de sangre al laboratorio a más tardar 2 horas después de su recolección. . En este caso, las muestras deben transportarse a temperaturas de hasta + 8 ° С.

El suero sanguíneo donado por una persona con el estómago vacío se utiliza como material de prueba para la tpha. Si se cumplen todas las condiciones necesarias durante la toma de muestras de sangre y el análisis posterior, la precisión de los datos obtenidos será del 76%, con sifiloma primario, 100%, con una forma secundaria de la enfermedad y 94, en una etapa tardía del desarrollo. de la enfermedad. La detección de treponemas pálidos durante los períodos de curso asintomático de la enfermedad es de aproximadamente el 97%. Y el nivel de especificidad, que alcanza hasta el 99%, permite excluir casi por completo variantes de resultados falsos positivos, lo que facilita el diagnóstico diferencial de los pacientes.

Pruebas treponémicas para la sífilis. Descripción general.

Para diagnosticar de manera confiable la sífilis e identificar anticuerpos antisifilíticos en el cuerpo del paciente (en suero sanguíneo o líquido cefalorraquídeo), se utilizan tecnologías de laboratorio especiales, los llamados métodos serológicos.

Al realizar las pruebas de diagnóstico de la sífilis se utilizan diversas reacciones serológicas: aglutinación, precipitación, inmunofluorescencia, unión al complemento, inmunoensayo enzimático, etc. Todas estas reacciones serológicas se basan en la interacción de antígenos y anticuerpos.

Las pruebas serológicas específicas se denominan treponémico porque estas pruebas utilizan treponemas pálidos o sus antígenos, es decir, antígenos de origen treponémico. El propósito de las pruebas treponémicas es identificar anticuerpos específicos contra las estructuras antigénicas del agente causante de la sífilis, es decir, anticuerpos dirigidos específicamente contra las propias bacterias T. pallidum y no contra los tejidos corporales dañados por el treponema. Los anticuerpos antitreponémicos específicos de la clase IgM pueden detectarse al final de la segunda semana de la enfermedad.

7. Resultados falsos positivos y falsos negativos

Los resultados positivos de RV para la sífilis en personas que no padecen esta enfermedad se denominan falsos positivos. La frecuencia de resultados falsos positivos en individuos sanos es de 0,2-0,25%. Si el porcentaje de resultados de RV falsos positivos inespecíficos en personas sanas es muy pequeño, en algunas enfermedades puede ser alto.

Todos los resultados inespecíficos de reacciones serológicas se pueden dividir en los siguientes grupos principales:

1. Enfermedades causadas por la presencia de antígenos comunes en patógenos similares (espiroquetas): fiebre recurrente, frambesia, bejel, pinta, treponema de la cavidad oral, leptospira.

2. Reacciones positivas debido a cambios en el metabolismo de los lípidos y cambios en las globulinas séricas. Estos incluyen resultados positivos en mujeres embarazadas, pacientes con gota, trastornos lipídicos como resultado de intoxicación con plomo, fósforo, después de tomar salicilato de sodio, digital, etc. Estas reacciones deben incluir reacciones positivas en algunas enfermedades infecciosas (tifus, malaria, neumonía, lepra, endocarditis, colagenosis, infarto de miocardio, conmoción cerebral, enfermedades oncológicas, cirrosis hepática, etc.)

3. Errores técnicos de la conducta. Elección incorrecta de la dosis del complemento, incumplimiento de las condiciones y términos de almacenamiento de los reactivos, exclusión de las muestras de suero sanguíneo de control de la reacción, uso de tubos e instrumentos contaminados.

8. Modificación de la reacción de Wasserman

Hay modificaciones de la formulación de la reacción de Wasserman en versiones cualitativas y cuantitativas, en frío, con líquido cefalorraquídeo.

Modificación de RV en el frío resultó ser más sensible. Una característica del método para establecer la reacción de Wasserman en el frío es la naturaleza trifásica de los regímenes de temperatura a los que se produce la unión del complemento. Esta reacción también se presenta con cardiolipina y antígeno treponémico.

Además de la evaluación cualitativa de RT, existe un método para su entorno cuantitativo con varias diluciones de suero sanguíneo (1:10, 1:20, 1:80, 1: 160, 1: 320). El título de reaginas está determinado por la dilución máxima, que aún da un resultado muy positivo (4+). El contexto cuantitativo del RV es importante en el diagnóstico de algunas formas de sífilis y en el seguimiento de la eficacia del tratamiento.

9. Alcance

En Rusia, RSKt es parte del complejo de pruebas serológicas estándar para la sífilis (CSR).

La reacción de Wasserman con antígeno treponémico y cardiolipina (RSKt) se utiliza para

• diagnóstico de todas las formas de sífilis,
• monitorear la efectividad del tratamiento,
• exámenes de personas que han tenido contacto sexual con un paciente con sífilis,
• exámenes de personas con sospecha clínica y anamnésica de sífilis
• durante el examen profiláctico para la sífilis de pacientes en hospitales psiquiátricos y neurológicos, donantes y mujeres embarazadas, incluidos los enviados para la interrupción artificial del embarazo.

Actualmente, por orden del Ministerio de Salud de la Federación de Rusia, se recomienda reemplazar el RSKT con métodos treponémicos más sensibles (ELISA o RPGA).

En el extranjero, la reacción de Wasserman con antígeno treponémico no se ha utilizado durante mucho tiempo en la práctica de laboratorio clínico y no está incluida en la lista de pruebas estándar recomendadas por la Organización Mundial de la Salud.

Complejo de reacciones serológicas clásicas (RSE)

DAC- eso complejo de reacciones utilizado para el serodiagnóstico de la sífilis como método estándar. Este complejo de reacciones incluye la reacción de Wasserman con antígeno de cardiolipina (extracto de corazón bovino enriquecido con lecitina y colesterol) y antígeno treponémico (suspensión tratada con ultrasonido de treponemas pálidos cultivados apatogénicos), así como una microrreacción de precipitación (PMP) con suero o inactivado con antígeno de cardiolipina

Los CSR se vuelven positivos en la mitad del período primario (su división en seronegativo y seropositivo está determinada con precisión por CSR), en el período secundario, los CSR son positivos en el 98-100% de los pacientes, y en el período terciario, solo en 60-70 %. Es decir, a medida que aumenta la duración de la enfermedad, la positividad de DAC disminuye gradualmente.

Ventajas de DAC:

1) Barato, sencillez y rapidez de montaje. Esto es especialmente típico de la reacción de microprecipitación: el cáncer de vejiga es actualmente el principal método de detección (selección);

2) Las pruebas no treponémicas son útiles para controlar la curación de la sífilis.

Desventajas de DAC:

1) Evaluación subjetiva de los resultados de las reacciones ("visualmente");

2) Baja sensibilidad en formas tardías de sífilis;

3) Falta de especificidad en comparación con pruebas más modernas. Cuando se llevan a cabo, a menudo se notan reacciones falsas positivas (DM).

La LPR puede ser causada por reactividad cruzada entre la espiroqueta del pallidum y otros microbios, trastornos del metabolismo de lípidos y proteínas, inestabilidad de las membranas celulares y formación de autoanticuerpos. Las DM se observan en infecciones agudas (malaria, mononucleosis infecciosa, etc.) y crónicas (tuberculosis, lepra, hepatitis, borreliosis, etc.), infarto de miocardio, cirrosis hepática, colagenosis (especialmente con LES), oncopatología, vacunación, uso de fármacos, abuso de alcohol y alimentos grasos. Los DAC pueden ser falsos positivos en las últimas semanas del embarazo, después del parto y en algunas mujeres durante la menstruación. Los resultados falsos negativos de DAC pueden estar asociados con la infección por VIH.

RIT, RIBT: reacción de inmovilización del treponema pálido

La reacción de inmovilización del treponema pálido (RIBT; prueba de inmovilización de Treponema pallidum, TPI) es un método clásico que sirve para detectar anticuerpos treponémicos específicos. La reacción RIBT utiliza treponema pálido patógeno T. pallidum (cepa Nichols) cultivado en un testículo de conejo como antígeno. La RIBT se basa en la pérdida de movilidad de treponemas pallidus vivos después de la exposición a anticuerpos del suero sanguíneo y el complemento del paciente. Los resultados se evalúan mediante microscopía de campo oscuro. A pesar de que la prueba RIBT se introdujo en la práctica clínica como una prueba específica para la sífilis, es laboriosa, técnicamente difícil, requiere mucho tiempo y es cara de usar.

1. Historia del método RIBT

La prueba de inmovilización de treponema pallidum (RIBT) es en realidad la primera prueba específica para el diagnóstico de sífilis. Esta reacción fue presentada en 1949 por los investigadores estadounidenses R. W. Nelson y M. M. Mayer y discutida en detalle en trabajos científicos en las décadas siguientes. Antes se han realizado intentos fallidos de utilizar treponemas vivos en pruebas. Gracias al hecho de que Nelson pudo crear un entorno en el que los treponemas permanecieron viables hasta por 8 días, su investigación se vio coronada por el éxito.

2. Principio del método RIBT

El método se basa en el fenómeno de la pérdida de movilidad treponémica pálida en presencia de anticuerpos antitreponémicos inmovilizadores del suero sanguíneo estudiado y del complemento en condiciones anaeróbicas. Los treponemas pálidos patógenos vivos obtenidos de conejos infectados artificialmente con sífilis sirven como antígeno.

3. Declaración de la prueba RIBT

El suero de prueba, el complemento y el antígeno están involucrados en la reacción. El suero sanguíneo del sujeto se agrega a treponemas vivos obtenidos de los tejidos del testículo de conejo después de una infección artificial. En presencia de anticuerpos anti-treponémicos-inmovilizinas en el suero, los treponemas pálidos dejan de moverse (quedan inmovilizados). Los anticuerpos-inmovilisinas son anticuerpos antitreponémicos tardíos.

La reacción se prepara con sueros inactivados por calor o con muestras de suero secadas sobre papel encerado (gotas secas). La inactivación del suero por calentamiento se lleva a cabo durante 30 minutos a una temperatura de 56 ° C. Antes de extraer sangre, el examinado no debe recibir medicamentos, especialmente preparaciones de penicilina. La toma de drogas se cancela mientras dure su posible retraso en el cuerpo.

Como antígeno, se utilizan bacterias de la cepa Nichols obtenidas de orquitis sifilítica de conejo de 7-10 días (inflamación del testículo). El período desde el momento en que se establece la reacción hasta el registro de sus resultados es de 18 a 20 horas, por lo tanto, para mantener la viabilidad y buena movilidad de los microorganismos, se necesita un medio de supervivencia.

El complemento de cobaya se utiliza en RIBT. Para obtener el complemento, se debe extraer sangre en condiciones estériles de varios conejillos de indias.

En caso de contaminación bacteriana se descarta el complemento. El complemento enlatado no debe usarse en la reacción de inmovilización del treponema pálido, porque es tóxico para los microorganismos.

Se utiliza un exceso de complemento en la reacción de inmovilización. Su cantidad depende en gran medida del entorno de supervivencia del treponema pallidus.

RIBT se coloca en cajas estériles, pre-irradiadas con una lámpara de cuarzo bactericida durante 45-60 minutos. Cada suero sanguíneo se examina en dos tubos de ensayo: experimentado y control... El suero de prueba y el antígeno se agregan a ambos tubos de ensayo en las cantidades requeridas. El complemento activo se vierte en el tubo de ensayo y se agrega la misma cantidad de suero de sangre de cobaya inactivado al tubo de control. Después del llenado, el contenido de los tubos se mezcla con agitación suave.

RIBT procede en condiciones anaeróbicas. Los tubos con los ingredientes se colocan en un micro-anaerostato, del cual se succiona el aire atmosférico mediante una bomba de vacío y se inyecta una mezcla de gases desde un cilindro (95 partes de nitrógeno y 5 partes de dióxido de carbono). El microanaerostato con tubos de ensayo se coloca en un termostato (35 ° C) durante 18-20 horas.

La evaluación de los resultados de RIBT se lleva a cabo después de retirar los tubos del termostato y micro-anaerostato (es decir, después de 18-20 horas del experimento). Con una pipeta Pasteur, se aplica una gota del contenido del tubo de ensayo en un portaobjetos de vidrio, que se cubre con un cubreobjetos y se examina en el campo oscuro de un microscopio (objetivo 40, ocular 10X). Se examinan varios campos visuales en diferentes partes de la preparación, contando en cada uno el número de treponemas pálidos móviles e inmóviles. El recuento comienza con la preparación del control y luego del tubo de ensayo experimental.

En la estadificación de una reacción se utilizan 5 estudios de control: con suero sanguíneo obviamente positivo y negativo, con complemento activo e inactivado y un medio de supervivencia para treponema pálido. El suero sanguíneo de control negativo se usa para juzgar el grado de movilidad de los treponemas pálidos en este experimento. Control de suero sanguíneo positivo: para evaluar el grado de actividad inmovilizadora en las condiciones de este experimento. Se lleva a cabo el estudio del complemento activo e inactivado y del entorno para determinar su efecto sobre la movilidad de los treponemas pálidos.

Con una falta de complemento en el experimento, los anticuerpos inmovilizadores no muestran su actividad correctamente y los treponemas permanecen móviles. Por tanto, tras el experimento, se realiza la determinación del complemento residual con el fin de valorar si la movilidad de los treponemas pálidos en los tubos de ensayo se debió a la ausencia de complemento. Para ello, se utiliza un sistema hemolítico: una mezcla de una suspensión de eritrocitos de oveja y suero hemolítico diluido guardado en un termostato.

El complemento residual se determina agregando un sistema hemolítico a cada tubo en el volumen requerido. Los tubos se colocan en un termostato a 37 ° durante 45 minutos. En los tubos de ensayo debe ocurrir la hemólisis de los eritrocitos, en los tubos de control debe haber un retraso en la hemólisis. La ausencia de hemólisis en los tubos de ensayo indica una cantidad insuficiente de complemento, en estos casos se debe repetir el estudio. No se realiza un estudio repetido del suero sanguíneo solo si se observa una inmovilización del 100% de los treponemas pálidos.

4. Teniendo en cuenta los resultados de RIBT

El recuento de treponemas inmovilizados que han perdido movilidad se realiza al microscopio, utilizando el método de microscopía de campo oscuro. Se requiere del investigador la habilidad de evaluar el movimiento de los treponemas. Debe prestar atención a la intensidad de los movimientos realizados por treponema pálido. En esta bacteria, no siempre es posible observar contracciones onduladas y movimientos de flexión, a veces solo rotacionales. También debería poder distinguir los movimientos activos del treponema del movimiento con flujo de líquido.

Para evaluar los resultados de la reacción, se calcula el porcentaje de inmovilización de treponemas pálidos, es decir, la proporción de treponemas móviles e inmóviles en el experimento (con complemento activo) y control (con complemento inactivo) de acuerdo con la fórmula:

X = (M - C) × 100 / M

donde M es el número de treponemas móviles en el control; C - el número de treponemas móviles en el experimento; X -% de inmovilización. En el trabajo práctico, el porcentaje de inmovilización se determina de acuerdo con una tabla precompilada utilizando la fórmula anterior.

La reacción de inmovilización del treponema pálido se evalúa como

• positivo cuando está inmovilizado 51 - 100% treponem,
• débilmente positivo: 31 - 50% treponema inmóvil,
• dudoso: 21 - 30% treponema inmóvil,
• negativo: 0 - 20% treponema inmóvil.

La reacción de inmovilización del treponema pálido se vuelve positiva al final de la primaria, el comienzo del período secundario de la sífilis (de 7-8 semanas desde el momento de la infección y más). Al mismo tiempo, la RIBT es de poca utilidad para el diagnóstico de las primeras etapas de la sífilis, ya que los anticuerpos que inmovilizan los treponemas pálidos y se detectan en la reacción aparecen solo 3-6 semanas después de la infección. Los anticuerpos-inmovilisinas pertenecen a la clase de inmunoglobulinas IgG. Aparecen en la sangre más tarde que las reaginas (anticuerpos anticardiolipina), más tarde los anticuerpos fluoresceína (detectados por RIF y ELISA) y las precipitinas (detectadas por cáncer de vejiga).

En el futuro, RIBT sigue siendo positivo. Existe una alta sensibilidad de la reacción en las formas tardías de sífilis. Con sífilis secundaria, tardía, neurosífilis, sífilis congénita, se registra un resultado positivo de RIBT en el 95-100% de los casos. Con la sífilis terciaria, con lesiones específicas de los órganos internos, el sistema nervioso, cuando el RV suele ser negativo, la RIBT da resultados positivos en el 98-100% de los casos.

La RIBT ha sido reconocida durante mucho tiempo como la prueba más específica para la sífilis. Según la literatura, la especificidad de RIBT es del 99%, la sensibilidad oscila entre el 79 y el 94%. Según TsNIKVI, la sensibilidad de RIBT (en total, para todas las etapas de la sífilis) es del 87,7%.

7. Alcance del método

El ámbito de aplicación de RIBT se está reduciendo gradualmente debido a la duración de la instalación, el alto costo y la intensidad de la mano de obra. RIBT es un análisis bastante complejo y costoso que requiere personal altamente calificado y un vivero. En este sentido, el uso de este método ha disminuido significativamente en los últimos años. En los Estados Unidos, esta prueba actualmente solo se usa en laboratorios de investigación.

Debido a la complejidad y el alto costo de RIF y RIBT, tiene sentido usarlos para diagnosticar formas tardías y latentes de sífilis. RIBT conserva su posición como una "reacción de árbitro" en el diagnóstico diferencial de formas latentes tempranas de sífilis y resultados falsos positivos. Esta reacción puede ser útil en el diagnóstico de neurosífilis y cuando existen discrepancias en los resultados de otras pruebas serológicas.

RIBT se vuelve positivo mucho más tarde que RIF y RV. Por lo tanto, no se usa para diagnosticar formas infecciosas de sífilis.

La RIBT, como la RIF, se vuelve negativa muy lentamente en el proceso de la terapia antisifilítica. Como resultado, no es adecuado para controlar el curso de la terapia antisifilítica.

Los resultados falsos positivos (LPR) en RIBT son raros y se observan principalmente en una serie de treponematosis (pian, pinta, bejel), que no se encuentran en Rusia, así como en lepra, sarcoidosis, LES, tuberculosis, cirrosis del hígado. y algunas otras enfermedades raras de naturaleza no sifilítica. A medida que los pacientes envejecen, aumenta el número de resultados falsos positivos de RIBT.

El RIBT puede resultar falso positivo si el suero de prueba contiene sustancias treponemicidas (por ejemplo, penicilinas, tetraciclinas, eritromicina), que causan una inmovilización inespecífica de los treponemas pálidos. Esto puede ser una consecuencia de que el paciente esté tomando antibióticos treponemocidas, por lo tanto, el examen no se realiza durante el último mes en personas que hayan recibido antibióticos. La sangre para detectar RIBT no se puede analizar antes de 2 semanas después de finalizar la toma de antibióticos y otros medicamentos antisifilíticos.

9. Modificaciones de la reacción de inmovilización del treponema pálido.

Además de la técnica microanaerostatic, hay un ajuste RIBT melange según N.M. Ovchinnikov. Las condiciones anaeróbicas durante la formulación de la reacción se crean colocando la mezcla de reacción en un melanger (mezclador de leucocitos), ambos extremos del cual se cierran con un anillo de goma. La técnica de reacción de melange permite prescindir de una bomba de vacío, un cilindro con una mezcla de nitrógeno y dióxido de carbono y un microanerostato. En un estudio comparativo sobre un gran material clínico, los resultados obtenidos no son inferiores a la técnica anaerostática clásica.

10. Características, ventajas y desventajas de RIBT

RIBT es un método de diagnóstico técnicamente complejo y costoso. La tecnología requiere fondos importantes para criar conejos y realizar pruebas. Esta laboriosa prueba se utiliza actualmente principalmente con fines científicos. En la mayoría de los países extranjeros, durante casi 40 años, RIBT se ha utilizado prácticamente no con fines de diagnóstico, sino solo en trabajos de investigación.

Desventajas de la reacción:

• RIBT requiere trabajar con treponemas pálidos patógenos vivos de la cepa Nichols, que sigue siendo infecciosa para los humanos a pesar de la adaptación para los conejos
• configurar la reacción es difícil, requiere mucho tiempo y es costoso
• vivero requerido
• Se requiere personal altamente calificado para configurar la reacción, registrar los resultados y mantener el vivero.
• subjetividad en la evaluación de resultados
• falta de automatización
• no hay forma de estandarizar este método serológico.
• la reacción no es aplicable en el contexto de la terapia antisifilítica en curso
• incapacidad de usar para controlar la curación. La RIBT en pacientes con sífilis puede permanecer positiva durante muchos años (e incluso de por vida), a pesar del tratamiento completo recibido.
• la reacción puede dar resultados falsos positivos en pacientes con tumores malignos, diabetes, lepra, enfermedades autoinmunes, neumonía, patología cardiovascular grave.

Las ventajas de RIBT son:

1) Sensibilidad suficientemente alta;

2) Alta especificidad.

RIF (reacción de inmunofluorescencia)

La reacción de inmunofluorescencia (RIF) es un método de diagnóstico rápido para detectar antígenos de microbios o determinar anticuerpos. Las pruebas basadas en la detección de una señal fluorescente se consideran una de las mejores pruebas para la sífilis.

1. Historia del método

El anticuerpo treponémico fluorescente (FTA) fue desarrollado por primera vez en 1957 por Deacon et al. (Deacon, Falcone y Harris).

2. Principio del método

El método RIF se basa en el hecho de que los antígenos tisulares o microbios tratados con sueros inmunes con anticuerpos marcados con fluorocromos pueden brillar en los rayos UV de un microscopio fluorescente. Las bacterias en un frotis tratado con tal suero luminiscente brillan a lo largo de la periferia celular en forma de un borde verde.

Como antígeno en RIF se utiliza una suspensión de treponemas pálidos patógenos vivos de la cepa Nichols de orquitis de conejo, que se seca sobre un portaobjetos de vidrio y se fija con acetona. El suero sanguíneo del paciente se agrega a la acetona seca y fija al vaso de treponemas pálidos.

Después del lavado, la preparación se trata con suero que contiene anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas marcadas con fluoresceína. La muestra se vuelve a lavar y se observa con un microscopio fluorescente. Si el suero de prueba contiene anticuerpos anti-treponémicos-fluoresceínas, se notará un brillo amarillo verdoso de treponemas.

3. El método de realización de la investigación por el método RIF

El antígeno fijado en el portaobjetos (treponema pálido patógeno) se trata con el suero de prueba. Después del lavado, la preparación se trata con suero luminiscente marcado con fluorocromo contra inmunoglobulinas humanas. En este caso, el complejo fluorescente resultante (anti-globulina humana + tioisocianato de fluoresceína) se une a la globulina humana en la superficie de treponema pallidus, proporcionando la luminiscencia de treponema pallidum bajo un microscopio luminiscente.

Para detectar complejos antígeno-anticuerpo, se utiliza un suero luminiscente, que es una inmunoglobulina anti-especie (antihumana) conjugada con FITC. La presencia de anticuerpos contra los treponemas en el suero se determina por la luminiscencia de los treponemas cuando se examinan con un microscopio luminiscente. La prueba se lleva a cabo en versiones cualitativas y semicuantitativas.

4. Contabilización de los resultados

Los resultados de RIF se visualizan utilizando un microscopio fluorescente. Los resultados se evalúan por el grado de luminiscencia de los treponemas en la preparación. En presencia de anticuerpos, la luminiscencia de los treponemas es visible, pero si no hay anticuerpos antitreponémicos en el suero, los treponemas no son visibles. El grado de luminiscencia de los treponemas pálidos secos fijados al vidrio se indica en "más" (de "-" a "++++"). Resultado negativo - sin brillo ni nivel de fondo - 1+.

5. ¿En qué períodos de la enfermedad es mejor usar

La reacción de inmunofluorescencia (RIF) es bastante sensible en todas las etapas de la infección, desde el final del período de incubación hasta la sífilis tardía. El período primario de la sífilis en el curso clásico comienza 3-4 semanas después de la infección. El RIF se vuelve positivo en los primeros días del período primario o incluso al final del período de incubación, a partir de la tercera semana después de la infección. Los resultados del RIF siguen siendo positivos en todos los períodos, incluso en las últimas.

RIF se vuelve positivo un poco antes que RV. Según algunos informes, se produce un RIF positivo en el 80% de los pacientes con sífilis seronegativa primaria. En el período secundario, el RIF es positivo en casi el 100% de los casos. Siempre es positivo en la sífilis latente y da un 95-100% de resultados positivos en las formas tardías de la enfermedad y la sífilis congénita.

6. Sensibilidad y especificidad

La reacción de inmunofluorescencia (RIF) es un grupo de métodos con alta sensibilidad y especificidad. La RIF es sensible en todas las etapas de la infección, desde el período de incubación hasta la sífilis tardía. Según la OMS, la sensibilidad de RIF en la sífilis primaria es del 70-100%, en la sífilis secundaria y tardía - 96-100%, especificidad - 94-100%. Según TsNIKVI, la sensibilidad de RIF en todas las formas de sífilis es del 99,1%.

La especificidad de RIF se puede aumentar al pretratar el suero estudiado con un sorbente, un antígeno treponémico ultrasónico que se une a los anticuerpos del grupo (RIF-abs).

7. Alcance del método

Se utiliza RIF:

• como una reacción confirmatoria en la sífilis latente temprana
• al establecer un diagnóstico retrospectivo
• para diferenciar las formas latentes de sífilis y los resultados falsos positivos de las pruebas de sífilis.
• como prueba confirmatoria de neurosífilis.

El RIF se usa ampliamente como prueba de confirmación, pero no está diseñado para uso de rutina o detección porque es técnicamente difícil de configurar. Para realizar RIF es necesaria la presencia de un vivero o la adquisición de una suspensión de treponemas pálidos patógenos, lo que limita las posibilidades de reacción. Sin embargo, en los últimos años han comenzado a aparecer en el mercado nacional sistemas de ensayo que permiten realizar una reacción en ausencia de vivero y cepa propia de laboratorio de treponemas pálidos patógenos.

8. Fuentes y causas de errores de estadificación, resultados falsos positivos y falsos negativos

Los tomadores de decisiones en la estadificación de la RIF son raros (con colagenosis, borreliosis).

La RIF todavía se considera una de las mejores pruebas para la sífilis, el "estándar de oro" del serodiagnóstico. RIF en comparación con RIBT es más fácil de configurar,

A pesar del alto valor diagnóstico, la introducción generalizada de RIF en la práctica diaria se ve obstaculizada por la necesidad de utilizar T. pallidum vivo, el alto costo y la duración del estudio. La formulación de la reacción es laboriosa. Además, la evaluación de los resultados del RIF es subjetiva.

Las ventajas del RIF y RIBT son:

1) Alta sensibilidad (especialmente para RIF);

2) Alta especificidad (especialmente para RIBT).

Desventajas de RIF y RIBT:

1) Complejidad técnica, alto costo de métodos.

2) Evaluación subjetiva de resultados, falta de automatización;

3) RIF y RIBT en pacientes con sífilis pueden permanecer positivos durante muchos años (e incluso de por vida), a pesar del tratamiento completo recibido. Por lo tanto, estas reacciones no se pueden utilizar para controlar la curación.

10. Modificaciones del método

En la práctica, para el serodiagnóstico de la sífilis, se han utilizado y se han utilizado varias modificaciones de la reacción de inmunofluorescencia:

• RIF-abs- el método más sensible de serodiagnóstico de la sífilis, se vuelve positivo antes que otras reacciones (a partir de la tercera semana de la infección);
• RIF-200(el suero del paciente se diluye 200 veces durante la instalación): un método muy específico para el serodiagnóstico de la sífilis.
• RIF-10(Dilución 10 veces del suero analizado) es un método más sensible que el RIF-200.
• RIF-c realizado con líquido cefalorraquídeo.
• RIF-abs-IgM- detección precoz de anticuerpos antitreponémicos de la clase IgM.

1. La modificación más extendida es RIF-abs- la reacción de inmunofluorescencia con absorción. Antes de establecer la reacción, el suero del sujeto se agota con una mezcla de treponemas no patógenos para excluir reacciones cruzadas. Los anticuerpos del grupo se eliminan del suero estudiado utilizando treponemas culturales destruidos por ultrasonido, lo que aumenta significativamente la especificidad de la reacción. Dado que el suero de prueba se usa en una dilución 1: 5, RIF-abs es muy sensible.

Las principales indicaciones para el uso de RIF-abs en la práctica clínica son:

• diagnóstico de formas latentes y tardías de sífilis,
• identificación de resultados falsos positivos de CSW y cáncer de vejiga, especialmente en mujeres embarazadas y pacientes somáticos con sospecha de sífilis,
• para establecer un diagnóstico retrospectivo de la enfermedad.

RIF-abs no es muy informativo para evaluar los resultados del tratamiento: en el 85% de los pacientes que recibieron una terapia antisifilítica adecuada, los resultados positivos de RIF persisten durante muchos años.

Esta reacción se denomina el "estándar de oro" para el serodiagnóstico de la sífilis. Se usa para casos de arbitraje, pero para obtener un resultado confiable, se requiere una suspensión concentrada fresca de T. pallidum cepa Nichols de orquitis de siete días en un conejo, que no debe congelarse.

2.En la URSS, se instaló en dos modificaciones: RIF-10 y RIF-200, es decir, con una dilución del suero problema entre 10 y 200 veces. RIF-200: el suero de prueba se diluye 200 veces para reducir el número de resultados falsos positivos. Esto proporciona una alta especificidad de la reacción, pero su sensibilidad disminuye algo. RIF-10 es más sensible, pero con más frecuencia da resultados positivos inespecíficos que RIF-200, que es muy específico. RIF-10 es más sensible, RIF-200 y RIF-abs son más específicos.

La sensibilidad de RIF-200 y RIF-abs se estima en 84 a 99% y la especificidad, 97 a 99%.

3. RIF-c realizado con líquido cefalorraquídeo. La reacción se establece utilizando líquido cefalorraquídeo completo para identificar lesiones específicas del sistema nervioso central.

4. Reacción RIF-abs-IgM propuesto para la detección de anticuerpos antitreponémicos tempranos de la clase IgM. Esta reacción se puede utilizar para diagnosticar sífilis congénita, formas tempranas de sífilis y el diagnóstico diferencial de casos de reinfección y serorecurrencia.

Hay 2 modificaciones conocidas de esta reacción:

- FTA-ABS-IgM, basado en el uso en la segunda fase de la reacción de un conjugado anti-IgM (anticuerpos marcados con fluoresceína para IgM humana) en lugar de anti-globulina fluorescente humana;

- Versión rusa de RIF-abs-IgM, caracterizada porque se agrega al suero sanguíneo un sorbente que elimina los anticuerpos IgG, y se coloca RIF-abs con los anticuerpos IgM restantes.

Las principales indicaciones para el ajuste de RIF-abs-IgM son:

- serodiagnóstico de sífilis congénita en ausencia de manifestaciones manifiestas de sífilis congénita en el niño en la piel y las membranas mucosas;

- diagnóstico diferencial de reinfección y recurrencia clínico-serológica o serológica de la sífilis, en el que RIF-abs-IgM será negativo y RIF-abs - positivo;

- Evaluación de la eficacia de la terapia para la sífilis congénita o adquirida temprana: después de un tratamiento adecuado, RIF-abs-IgM se vuelve negativo en los próximos 3-6 meses.

Esta reacción se puede utilizar para detectar la sífilis congénita. Se sabe que las moléculas de IgM grandes no pueden atravesar una placenta sana. En consecuencia, los anticuerpos de clase M contra el treponema pálido pueden aparecer en el cuerpo del niño debido a una violación de la función de barrera de la placenta, o son producidos por el cuerpo de un niño con sífilis. Los anticuerpos de la clase IgM aparecen en la sangre de un paciente con sífilis en las primeras semanas de la enfermedad y los anticuerpos de la clase IgG aparecen más tarde. La determinación separada de anticuerpos de ambas clases resulta extremadamente útil para diagnosticar la sífilis congénita en niños, ya que la presencia de anticuerpos IgM en un niño en el primer mes de vida indicará que están formados por el cuerpo de un niño con sífilis. mientras que la detección de anticuerpos solo IgG hablará del origen materno de estos últimos.

Ajuste de reacción 19S (IgM) -RIF-abs asume la separación preliminar por filtración en gel de moléculas de IgM 19S más grandes de

fracciones de moléculas de IgG 7S más pequeñas. Estudio adicional en la reacción RIF-abs de suero sanguíneo que contiene solo la fracción 19S IgM,

elimina todas las posibles fuentes de error. Pero la técnica de escenificar esta reacción es compleja y laboriosa, y requiere equipo especial y entrenamiento de especialistas.

Reacción de adhesión inmunitaria (RIP, TPIA - Inmunoadherencia de Treponema pallida).

Esta reacción se basa en el uso del fenómeno descrito por Rieckenberg en 1912. El RIP se basa en el hecho de que los treponemas tisulares virulentos sensibilizados con el suero de un paciente con sífilis, en presencia de complemento y eritrocitos, se adhieren a la superficie de los eritrocitos y, durante la centrifugación, son arrastrados con ellos al sedimento, desapareciendo del líquido sobrenadante.

Para preparar la reacción, se utilizan los siguientes ingredientes: suero de prueba, antígeno, complemento, eritrocitos del donante, solución isotónica de cloruro de sodio. Como antígeno se utiliza una suspensión de treponemas pálidos de la cepa Nichols.

Esta prueba fue más estudiada por autores nacionales y extranjeros en los años 50-60 en relación con el serodiagnóstico de la sífilis. Los datos sobre el valor de RIP como prueba de diagnóstico han sido contradictorios. La reacción requirió la máxima precisión, ya que un vertido incorrecto de los ingredientes, con un exceso o falta del material de prueba en la preparación, se obtuvieron resultados poco confiables.

En Rusia, L.V. Sazonov, quien obtuvo resultados similares en RIP y RIT usando una suspensión recién preparada de treponemas pálidos patógenos de la cepa Nichols. Sin embargo, el uso de un antígeno calentado o conservado por fenol distorsionó drásticamente los resultados de la reacción e hizo que el antígeno fuera inestable. Recomiende esta prueba para reemplazar RIT L.V. A Sazonova le resultó imposible.

G.P. Avdeeva, utilizando otros regímenes de temperatura y tiempo en la fabricación del antígeno, obtuvo otros resultados al estudiar el RIP. Según sus datos, la sensibilidad de esta reacción es mayor que la sensibilidad de KCP y RIT, pero algo inferior a RIF, y la especificidad de RIP, RIT y RIF es cercana.

Sin embargo, la falta de una liberación comercial de antígeno para RIP no permitió un estudio más amplio de esta prueba y su implementación en la práctica.

Reacción RPHA de hemaglutinación pasiva

Reacción de hemaglutinación pasiva (RPHA) es una prueba serológica común bien establecida en la práctica de laboratorio. tiene un nivel bastante alto de eficiencia en la investigación.

1. Historia del método RPGA

Por primera vez, G. Blumental y W. Bachman (1932) informaron sobre el uso de RPHA para el diagnóstico de la sífilis. En 1965, para el diagnóstico de la sífilis, se propuso una reacción de hemaglutinación indirecta o pasiva. T. Ratlev informó de la modificación de la reacción con el uso de varios antígenos en 1965-1967. La micromodificación del RPHA fue propuesta por R.M. Sokh. y coautores en 1969. El primer sistema de prueba comercial fue desarrollado por los científicos japoneses Tomisava et. Alabama. en 1969

2. El principio del método RPGA

De la suspensión homogénea preparada de eritrocitos, "cargada" con antígenos, cuando se agrega el suero de prueba que contiene anticuerpos, cae un precipitado en forma de escamas. El sedimento resultante consiste en eritrocitos, "pegados" por anticuerpos, y se llama "Hemaglutinato"... Se prepara una suspensión de eritrocitos por adelantado y se suministra como parte de los sistemas de pruebas de diagnóstico.

El proceso de adhesión de los glóbulos rojos, en cuya superficie están presentes los antígenos, se denomina "hemaglutinación". La unión se produce bajo la acción de anticuerpos específicos (aglutininas). La reacción se llama "Pasivo" ya que Los propios antígenos de los eritrocitos no reaccionan y los propios eritrocitos realizan exclusivamente una función indicadora auxiliar.

La reacción de hemaglutinación pasiva (indirecta) es un tipo de reacción de aglutinación en la que los eritrocitos (del griego háima - sangre) se utilizan como portadores de antígenos y no otras partículas. En el caso general, en la reacción de aglutinación bajo la acción de anticuerpos, se produce la adhesión y precipitación de microbios u otras células, no necesariamente eritrocitos, pero, por ejemplo, partículas de látex, bacterias u otras partículas corpusculares portadoras de antígenos.

En la reacción de hemaglutinación pasiva para el diagnóstico de sífilis, los eritrocitos de una oveja o aves, cubiertos con antígenos de treponemas pálidos, se utilizan como antígeno. Cuando se agrega suero que contiene anticuerpos específicos, los eritrocitos se pegan (aglutinación).

La reacción de RPHA se clasifica como un método inmunológico, porque se basa en la interacción específica del antígeno patógeno de treponema pallidum con un anticuerpo. Según la "teoría de la red", la aglutinación es el resultado de la "unión" de moléculas de antígeno de superficie con moléculas de anticuerpos (inmunoglobulinas).

3. Configuración de la reacción de hemaglutinación pasiva

El RPHA se coloca en placas de plástico o en tubos de ensayo con diluciones del suero sanguíneo del paciente, al que se agrega eritrocitos de diagnóstico.

El proceso de combinación de antígeno con eritrocitos se denomina sensibilización y el antígeno corpuscular artificial obtenido de esta forma se denomina eritrocitos sensibilizados. Los diagnósticos de eritrocitos son eritrocitos sensibilizados con un antígeno.

Para la preparación del diagnóstico, se utilizan los eritrocitos de carnero o aves (generalmente pollo), tratados primero con formalina, luego con tanino, que se sensibilizan con un antígeno ultrasonido de treponema pálido patógeno (cepa Nichols) o proteínas recombinantes. de treponema pálido (TpN15, TpN17, TpN47). Además, pueden usarse eritrocitos de un carnero sensibilizados con un antígeno ultrasónico de treponemas pálidos cultivados.

Solo se analiza el suero (no use plasma sanguíneo). Las muestras hemolizadas y turbias no son adecuadas. Los eritrocitos no sensibilizados (para excluir la presencia de anticuerpos anti-eritrocitos) sirven como control negativo. Se utilizan controles positivos y negativos para cada conjunto de pruebas.

Las muestras del suero sanguíneo estudiado y los eritrocitos de prueba se introducen en los pocillos (células) de la placa inmunológica. Si el suero sanguíneo del paciente contiene anticuerpos antitreponémicos específicos, cuando el suero de prueba se agrega al pocillo con el antígeno, se produce la formación de complejos antígeno-anticuerpo asociados con la superficie de los portadores (eritrocitos). Visualmente, esto se manifiesta por la adhesión de eritrocitos, es decir, hemaglutinación, que es visible a simple vista. Los inmunocomplejos "anticuerpo-antígeno-eritrocito", que descienden gradualmente bajo la influencia de la gravedad, se distribuyen por toda la superficie del fondo del agujero y forman una imagen característica de un "paraguas invertido".

Dependiendo de la cantidad de anticuerpos contenidos en la muestra de prueba, la imagen del "paraguas invertido" varía desde el máximo, que ocupa toda la superficie del fondo del pozo, hasta una pequeña área en la parte central y más baja del mismo ( con iluminación en el centro y la formación de un anillo más intenso de eritrocitos asentados a lo largo de la periferia).

No se forman complejos inmunes si no hay anticuerpos específicos en la muestra o cuando se agregan eritrocitos de control (intactos) a la reacción. En este caso, los eritrocitos se recogen gradualmente en el punto más bajo del fondo del agujero, formando una figura en forma de mancha compacta o "botón", a veces con una ligera iluminación en el centro.

Si el suero sanguíneo de una persona contiene anticuerpos anti-eritrocitos, entonces se formará un "paraguas" en cualquier caso, tanto en reacción con los eritrocitos de prueba como con los eritrocitos de control. En este caso, se recomiendan otras tecnologías médicas para detectar anticuerpos antitreponémicos específicos.

Posible fenómeno de prozona (imposibilidad de reacción por exceso de anticuerpos), eliminado por dilución del suero.

4. Teniendo en cuenta los resultados de la reacción de hemaglutinación pasiva

Los resultados de RPHA se tienen en cuenta visualmente después de 60-120 minutos al configurar el micrométodo y después de 2-4 horas o al día siguiente cuando se configura la macrovariante. Cuando se utilizan eritrocitos de aves más grandes (nucleados), se obtiene una imagen más clara, los resultados se registran en una fecha anterior.

Es posible determinar el título (título alto de RPHA ≥ 1: 2 560).

Los resultados del estudio se evalúan según el sistema 4+ (de "-" a "++++") según el tamaño de la película formada. Cuando aparece la aglutinación, los eritrocitos se ubican en la superficie del orificio en forma de "paraguas", y si el resultado es negativo, los eritrocitos se deslizan libremente hacia abajo y se acumulan en la parte inferior del centro del orificio en forma de un "botón".

La evaluación generalmente aceptada de los resultados de la RPHA:

4+ - RPGA positivo. Los eritrocitos aglutinados en forma de "paraguas" recubren uniformemente toda la superficie del agujero;

3+ - RPGA positivo. Los eritrocitos recubren toda la superficie del orificio, pero algunos de ellos se "deslizan" hacia el centro. En este caso, se forma un anillo notable a lo largo de la periferia del sedimento;

2+ es un RPHA débilmente positivo. Los eritrocitos forman una película en una pequeña área de la parte inferior del pozo, formando un denso anillo de sedimento de eritrocitos con una notable iluminación en el centro;

1+ - RPHA indefinido, los eritrocitos forman un sedimento suelto en el fondo del pozo con bordes indistintos y una pequeña brecha en el centro;

(-) - RPHA negativo, todos los eritrocitos se encuentran en el fondo del pozo en forma de sedimento compacto (“botones” o anillo) contra un fondo circundante limpio (sin sedimentación granular circundante).

En la práctica extranjera, los resultados de RPHA también se evalúan como reactivos (en el caso de formación de aglutinados), débilmente reactivos (si las formaciones son insignificantes) y no reactivos (si no se observa aglutinación).

Los resultados de la reacción se pueden tener en cuenta automáticamente utilizando analizadores especiales. Además de la investigación cualitativa, todos los sistemas de prueba incluyen análisis cuantitativos con determinación de títulos.

5. ¿En qué períodos de la enfermedad es mejor usar RPHA?

La RPHA se vuelve positiva en la mitad del período primario (7-8 semanas desde el momento de la infección, 3-4 semanas después de la aparición de un chancro duro) y después del tratamiento permanece positiva durante años.

Con un nivel muy alto de anticuerpos contra el treponema en el suero estudiado (que es el más típico de la sífilis secundaria), es posible un resultado falso negativo de RPHA (el llamado fenómeno "prozona").

Los anticuerpos específicos contra las aglutininas se detectan en la sangre de personas que han tenido sífilis durante mucho tiempo, por lo que no se puede recomendar la RPHA para el diagnóstico diferencial de reinfección o la determinación de la gravedad del proceso infeccioso.

RPHA no se utiliza para controlar la curación, porque puede permanecer positivo muchos años después de la recuperación. Al mismo tiempo, puede usarse como un método adicional (al cáncer de vejiga o RPR) para monitorear la efectividad del tratamiento, examinando la dinámica de la disminución en los títulos de anticuerpos. Un requisito previo para esto es el uso del mismo sistema de prueba RPHA que durante el primer examen (antes del tratamiento) del paciente, así como la realización del estudio en el mismo laboratorio.

6. Sensibilidad y especificidad de RPHA

RPHA se considera una prueba muy sensible y específica. Esta reacción es una prueba de diagnóstico valiosa en todas las formas de sífilis, pero es especialmente sensible en las formas posteriores de la enfermedad. Dependiendo de la etapa de la enfermedad, la sensibilidad de la RPHA varía. En la sífilis primaria, la sensibilidad de la RPHA es del 76% (y más), en la sífilis secundaria, hasta el 100%. Con latente temprano - 97%, con sífilis tardía - 94%, con una especificidad del 98-100%. La menor sensibilidad en las formas frescas de la enfermedad se explica por la formación posterior de aglutininas.

Según la institución estatal TsNIKVI Roszdrav, la sensibilidad de RPHA en el diagnóstico de diversas formas de sífilis fue del 99,4%. La mayoría de los investigadores notan una especificidad del 98-99% de RPHA.

En términos de sensibilidad y especificidad, RPHA no es inferior, y en formas tardías y sífilis congénita, incluso supera a RIF y RIBT.

7. Alcance del método RPGA

La RPHA se puede utilizar como prueba de detección y prueba de confirmación; se puede utilizar de forma semicuantitativa con el cálculo del título de anticuerpos. Se ha desarrollado un método cuantitativo para fijar RPHA, un micrométodo, así como una reacción de microhemaglutinación automatizada.

8. Características, ventajas y desventajas de RPGA

Según la literatura, RPHA ha ocupado una posición de liderazgo en la práctica clínica en la mayoría de los países del mundo. RPHA es la prueba más utilizada en clínicas de ITS en el extranjero.

La técnica RPHA es fácil de realizar, no requiere equipo especial: para su fraguado solo se necesita una placa para hemaglutinación. La investigación no lleva mucho tiempo; la reacción es muy sensible y específica. La aprobación del método en la práctica clínica ha demostrado que es extremadamente simple, económico y sensible. Al igual que IFA, RPGA es simple de implementar, no requiere personal altamente calificado y equipos especiales, y su automatización es posible.

Ventajas de la prueba RPGA:

• simple en la puesta en escena e interpretación,
• no requiere equipo especial,
• tiempo para obtener el resultado - 45 minutos,
• Adecuado para cribado masivo (solo se requieren 25 μl de suero a una dilución 1:20),
• alto grado de estandarización,
• la presencia de controles internos,
• larga vida útil,
• precio aceptable
• la capacidad de automatizar la contabilidad.

También cabe señalar las desventajas del RPGA:

• la posibilidad de reacciones inespecíficas en presencia de anticuerpos anti-eritrocitos,
• falta de correlación entre el título y el estadio de la sífilis,
• reacción positiva posterior en las primeras etapas de la sífilis,
• la posibilidad de reacciones falsas positivas en personas que han ingerido alcohol, drogadictos,
• Sensibilidad a la vibración y temperatura en el laboratorio.

Las ventajas de RPGA en comparación con RIBT y RIF son:

• uso de sistemas de prueba industriales,
• la capacidad de automatizar la reacción,
• no es necesario trabajar con treponema pálido vivo,
• no hay necesidad de un vivero.

9. Fuentes y causas de errores en la configuración de RPGA, resultados falsos positivos y falsos negativos

La reacción de hemaglutinación pasiva es un estudio relativamente sencillo; al realizarlo, es necesario seguir todas las recomendaciones de los fabricantes del diagnóstico y las reglas de trabajo en el laboratorio de diagnóstico clínico. Los errores cometidos pueden dar lugar a la aparición y el registro de resultados de reacciones tanto falsos negativos como falsos positivos. Los resultados falsos positivos de la RPHA pueden deberse a la influencia del factor humano y factores de naturaleza biológica.

Se pueden obtener resultados falsos positivos

• en el estudio de sueros sanguíneos de pacientes con treponematosis no venérea,
• debido al factor reumatoide
• debido a anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con el antígeno treponémico, que se forman durante diversos trastornos metabólicos sistémicos o inducidos por fármacos,
• debido a niveles anormales de inmunoglobulinas;
• en recién nacidos: debido a la formación de anticuerpos IgM contra la IgG de la madre en el cuerpo del feto o el niño, lo que complica la interpretación de los resultados y el diagnóstico de sífilis congénita.

Errores provocados por la influencia del factor de participación humana en la investigación:

• microplacas contaminadas
• pipeteo incorrecto
• vibración en el laboratorio
• la temperatura del aire en el laboratorio está fuera del rango de temperatura: 18-25 grados

Los errores técnicos más típicos en la formulación del RPGA, que dan lugar a resultados poco fiables, incluyen:

• dilución inexacta de ingredientes,
• violación del régimen de temperatura,
• violación del tiempo de incubación de los reactivos,
• violación de los términos para la aplicación de reactivos a la placa,
• inconsistencia del pH de las soluciones con el requerido,
• contaminación del material de vidrio de laboratorio.

Los siguientes puntos técnicos también pueden ser fuente de errores en la formulación del RPGA:

• exclusión del suero sanguíneo de control del entorno de reacción;
• concentración desigual de eritrocitos en el diagnóstico debido a una mezcla insuficiente antes de su uso;
• violación de los términos y condiciones de almacenamiento de eritrocitos de control y diagnóstico; uso de kits caducados;
• uso de tubos de ensayo contaminados, puntas de pipeta, pipetas, placas inmunológicas, soluciones al preparar reacciones;
• inexactitudes en la dilución primaria de una muestra de suero sanguíneo;
• minuciosidad insuficiente de la realización de sucesivas diluciones dobles;
• incumplimiento del régimen de temperatura y tiempo de incubación;
• la presencia de vibraciones extrañas y sacudidas de la placa inmunológica durante la incubación;
• Violación de la metodología para el establecimiento de la RPHA, expresada en la negativa a realizar el estudio con eritrocitos de control.

El uso de plasma sanguíneo que contenga anticoagulantes capaces de causar aglutinación eritrocitaria inespecífica (RPHA) puede dar lugar a resultados que no se pueden interpretar.

El número de resultados falsos positivos y falsos negativos es menor que con otras pruebas serológicas. Los LPR al estadificar RPHA son raros y posibles con treponematosis (pian, bejel, pinta). Asimismo, se registraron resultados falsos positivos (menos del 1% en total) en drogodependientes, en pacientes con mononucleosis infecciosa, borreliosis, lepra, en colagenosis, cirrosis hepática, linfosarcoma, así como en mujeres embarazadas.

Los resultados de reacciones negativas falsas pueden deberse a la competencia entre los anticuerpos IgM e IgG. Además, es posible que se obtengan resultados falsos negativos en pacientes infectados por el VIH.

10. Modificaciones del método RPGA

Existe una micro y macromodificación de la formulación RPGA, la primera se usa con más frecuencia debido a la economía, la velocidad de configuración y registro de los resultados.

Además, se ha desarrollado un complejo de diagnóstico automático para el análisis de imágenes, que permitió realizar una valoración automática cuantitativa de los resultados y excluir la subjetividad en la interpretación de los datos obtenidos. El complejo hardware-software reconoce la imagen, procesa los datos y da la respuesta en unidades relativas.

También se utilizan lectores y analizadores automáticos para automatizar el registro de resultados RPGA.

TPPA (aglutinación de partículas de Treponema pallidum): una reacción de aglutinación de partículas artificiales para la detección de anticuerpos contra Treponema pallidum

Resumen de la prueba TPPA

Actualmente, para el diagnóstico de sífilis, también se utiliza una modificación del método de hemaglutinación pasiva - TPPA (aglutinación de partículas de Treponema pallidum), en el que el antígeno de treponema pallidum se fija en partículas de gelatina. Dado que las partículas de polímero artificial no tienen sus propios antígenos que determinen la actividad biológica, los kits para el serodiagnóstico de la sífilis basados ​​en ellas tienen motivos para considerarse más perfectos. El uso de partículas artificiales biológicamente inertes minimiza la aglutinación inespecífica que se observa comúnmente con otros vehículos.

El TPPA se utiliza para el diagnóstico serológico de anticuerpos contra varios tipos y subespecies de treponemas patógenos. Esta prueba se puede utilizar para detectar anticuerpos contra los agentes causantes de la sífilis, pinta, bejel y frambesia.

El procedimiento de investigación es muy simple y no requiere equipo especial: se utilizan microplacas estándar en forma de "U". La prueba se basa en la aglutinación de partículas gelatinosas sensibilizadas con antígenos de T. pallidum, anticuerpos contenidos en el suero sanguíneo del paciente.

TPPA es una prueba treponémica confirmatoria que es útil tanto para recuentos de muestras pequeñas como para detección masiva. El TPPA se utiliza en el extranjero como prueba de confirmación y para reemplazar la prueba de microhemaglutinación MHA-TP (ensayo de microhemaglutinación para anticuerpos de T. pallidum).

La prueba TPPA tiene una sensibilidad del 85% al ​​100% y una especificidad del 98% al 100%. La sensibilidad al TPPA para la sífilis primaria es del 88%, para la sífilis latente secundaria y tardía del 98% al 100%.

Si se usa TPPA para diagnosticar la sífilis, los anticuerpos contra otros tipos de treponema (como T. pallidum endemicum, pertenue o carateum) pueden producir resultados falsos positivos. Hay varios métodos disponibles para eliminar estos anticuerpos de las muestras de suero antes de comenzar la prueba.

Principio de prueba TPPA

TPPA es un método para la aglutinación pasiva de partículas gelatinosas en suero o plasma humanos. El suero que contiene anticuerpos contra treponema patógeno reacciona con partículas gelatinosas sensibilizadas con el antígeno de treponema pallidum de la cepa Nichols, expuestas a ultrasonido. Como resultado de la reacción, se forma una película suave de partículas gelatinosas aglutinadas en el pocillo de la placa de microvaloración.

Si los anticuerpos están ausentes, las partículas se depositan en el fondo del pocillo de la placa, formando un "botón" compacto de partículas no aglutinadas. Los pocillos de control con partículas gelatinosas no sensibilizadas también deben mostrar un "botón" compacto para cada suero, es decir, sin aglutinación.

Aplicación de la prueba TPPA

La TPRA es una prueba universal que puede utilizarse con el mismo éxito tanto para el examen profiláctico obligatorio de grupos de población para la sífilis (detección) como en instituciones dermatovenerológicas especializadas. La ventaja de la prueba TPPA es su alta sensibilidad, que no es inferior a las pruebas clásicas, que hasta hace poco eran el "estándar de oro" para el serodiagnóstico de la sífilis. Otras ventajas de la prueba incluyen una alta reproducibilidad, así como la simplicidad y velocidad de preparación de la reacción.

La prueba TPPA se utiliza para confirmar los resultados positivos de las pruebas de detección no treponémicas para la sífilis, como la prueba VDRL, y para evaluar a los pacientes con pruebas no treponémicas negativas pero que presentan signos o síntomas que sugieren sífilis tardía. No se recomienda el uso de TPPA como única prueba de detección de la sífilis.

Además, la prueba de aglutinación de TPPA se puede utilizar para examinar muestras de líquido cefalorraquídeo en el diagnóstico de neurosífilis. Al mismo tiempo, como en relación con otras pruebas serológicas, la interpretación de los resultados debe llevarse a cabo con una combinación obligatoria con otros indicadores y síntomas de la enfermedad.

Resultados de la prueba TPPA

El resultado se evalúa según el sistema "más", de (-) a (2+). Los resultados de la prueba son visibles a simple vista y se interpretan de la siguiente manera:

Grado de aglutinación	Resultado de la prueba	Interpretación
Las partículas aglutinadas recubren uniformemente el fondo de la placa.	2+	Positivo
Anillo grande confiable con márgenes exteriores irregulares y aglutinación periférica	1+	Positivo
Las partículas forman un anillo compacto con un lumen en el centro y liso liso fronteras externas	±	Débilmente positivo
Las partículas forman un anillo compacto en el centro del agujero con un pequeño espacio en el centro y un borde exterior liso.	–	Negativo
Las partículas forman un "botón" en el centro del agujero con un borde exterior liso.	–	Negativo

Se lleva a cabo un análisis de rentabilidad para determinar el cumplimiento de la descripción anterior. Las muestras que muestren un resultado indeterminado (±) deben volver a analizarse. Si en varias pruebas TPPA la muestra arroja un resultado indeterminado, se recomienda estudiar utilizando otros métodos.

Los resultados del análisis no deben verse de forma aislada. Por ejemplo, en una etapa temprana de la infección, la cantidad de anticuerpos aún es demasiado pequeña, por lo que el TPPA y muchos otros métodos carecen de sensibilidad. Por lo tanto, si se sospecha de sífilis, incluso si los resultados de la prueba son negativos, las muestras deben examinarse nuevamente. Para realizar un diagnóstico, es necesario tener en cuenta los síntomas clínicos del paciente, la historia clínica y otros datos.

Al igual que con la reacción de RPHA, se puede observar el fenómeno de la prozona y un resultado falso negativo para TPPA si la muestra de suero contiene un título de anticuerpos demasiado alto.

ELISA - Inmunoensayo

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es uno de los muchos métodos de diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) en el serodiagnóstico de la sífilis es una prueba de anticuerpos de las clases M, G y A (IgM, IgG, IgA) contra los antígenos de Treponema pallidum. Posible formulación de ELISA con líquido cefalorraquídeo.

La introducción en la práctica del ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en lugar de la reacción de Wasserman y otras pruebas de cardiolipina ha mejorado significativamente la calidad del diagnóstico de laboratorio de la sífilis. Una ventaja significativa de este método es la capacidad de automatizar el proceso de investigación, lo que permite reducir la influencia del factor humano.

1. Historia del método ELISA

Los principios básicos del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en la superficie de un portador en fase sólida fueron desarrollados por E. Engvar et al. (1971), B. Van Weeman y A. Schuurs (1971). El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas desarrollado por ellos fue propuesto por primera vez para el diagnóstico de sífilis en 1975 por J. Veldkamp y A. Visser, quienes evaluaron el potencial de esta prueba automatizada. ELISA comenzó a usarse ampliamente en el diagnóstico de la sífilis en la década de 1980, cuando se desarrollaron y certificaron las pruebas de diagnóstico y se estandarizaron los métodos de prueba. En la URSS, V.N.Bednova, A.V. Babiy y A.V. Kotrovsky (1982, 1983) desarrollaron una técnica para establecer ELISA para el diagnóstico de sífilis.

2. Principio del método ELISA

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) por el mecanismo de reacción es cercano al RIF (se detectan los mismos anticuerpos). La reacción del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se refiere a reacciones inmunológicas basadas en la interacción altamente específica de los antígenos de treponema pallidum con los anticuerpos de un paciente con sífilis.

En la práctica sifilidológica, se utiliza principalmente la versión indirecta de ELISA. El principio de la variante de reacción indirecta más utilizada es el siguiente. En la superficie de los pocillos de la placa de poliestireno, se fijan complejos inmunes, que se forman cuando los anticuerpos de un paciente con sífilis interactúan con los antígenos de treponema pallidum. Después de eso, se identifican en una reacción de color utilizando conjugados específicos y aditivos cromogénicos de sustrato apropiados.

El orden de la prueba es el siguiente: el suero del paciente se coloca en un portador en fase sólida con un antígeno adherido. Si contiene anticuerpos, se forma un complejo antígeno-anticuerpo en la superficie del portador. Para la "manifestación" de los resultados de la reacción, se utilizan anticuerpos anti-especies de Ig humana, conjugados con marcadores enzimáticos. En el caso de una reacción positiva, la enzima, que se ha unido al complejo antígeno-anticuerpo, descompone el sustrato agregado al sistema, como resultado de lo cual se desarrolla una tinción de color de diferentes intensidades.

En la reacción, la determinación del complejo de AG y AT absorbidos en la fase sólida se realiza mediante anticuerpos antiglobulina marcados con una enzima, según la reacción de color de la enzima con el sustrato.

En la reacción, la determinación del complejo de antígenos y anticuerpos absorbidos en la fase sólida se realiza mediante anticuerpos antiglobulina marcados con una enzima.

ELISA proporciona la capacidad de detectar Ig en suero de diferentes clases. Existen sistemas en el mercado que permiten la determinación de IgM e IgG y anticuerpos totales por separado.

Los antígenos específicos utilizados para ELISA pueden tener diferentes orígenes:

ultrasónico- se obtienen como resultado de la destrucción de la célula bacteriana T. pallidum por ultrasonido u otro método;

recombinante- se obtienen mediante tecnologías de ingeniería genética introduciendo en el genoma de una célula bacteriana (por ejemplo, E. coli E. coli) un gen responsable de la síntesis de un antígeno específico de T. pallidum, seguido de un aumento de la masa bacteriana de un microorganismo productor, destrucción de estas células, aislamiento y purificación del antígeno;

péptido- se obtienen como resultado de la síntesis química secuencial de epítopos antigénicos de proteínas de T. pallidum.

El cuerpo puede formar anticuerpos contra casi cualquier parte de la molécula de antígeno. Por lo general, esto no sucede con una respuesta inmunitaria normal. Uno o más péptidos inmunogénicos aislados de un antígeno proteico tienen una antigenicidad especial y la mayoría de los anticuerpos se forman contra ellos. Sobre ellos se desarrolla la respuesta inmunitaria más intensa. Las regiones inmunodominantes de las proteínas de Treponema pallidum con pesos moleculares de 15 kD, 17 kD y 47 kD mostraron el valor más informativo en ELISA. Se utilizó como antígeno un extracto detergente o sonicado de treponemas patógenos de la cepa Nichols.

3. El método de realización de la investigación por el método

El principio del método es identificar un complejo antígeno-anticuerpo específico absorbido en la fase sólida (la superficie de los pocillos de una placa de plástico) con anticuerpos antiglobulina marcados con una enzima (peroxidasa), utilizando una reacción de color con un sustrato, cuantitativamente tomado en cuenta espectrofotométricamente.

Los antígenos utilizados para sensibilizar los pocillos de una placa de poliestireno pueden ser:

• lisado- obtenido como resultado de la destrucción del treponema pálido por ultrasonido;
• péptido- obtenido como resultado de la síntesis química de fragmentos de proteínas de treponema pálido y que tienen una reactividad antigénica similar a las proteínas originales del patógeno;
• recombinante- obtenido mediante métodos de ingeniería genética, portadores de determinantes antigénicos idénticos a treponema pallidum.

En la práctica sifilidológica, se suele utilizar una versión indirecta de ELISA.

4. Contabilización de los resultados

En ELISA, la reacción de una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante) con un sustrato se utiliza para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo, que cambia de color. La intensidad del color determina la positividad de la reacción (de "-" a "++++"). Los resultados de ELISA se pueden evaluar visualmente utilizando un sistema de 4 puntos o instrumentalmente en forma de lecturas digitales de densidad óptica obtenidas en lectores especiales (como Multiscan) a una longitud de onda de 492 nm. Porque la evaluación de los resultados se realiza espectrofotométricamente, esto excluye la interpretación subjetiva.

5. ¿En qué períodos de la enfermedad es mejor usar

El momento del ELISA positivo es a partir de la cuarta semana desde la infección. Los resultados de ELISA (como RIF) se vuelven positivos en los primeros días del período primario o al final de la incubación y permanecen positivos en todos los períodos. ELISA es especialmente valioso en el diagnóstico precoz de la sífilis; ya se pueden obtener resultados positivos para la detección de anticuerpos al final del período de incubación de la enfermedad (es decir, 4-6 semanas después de la infección).

6. Sensibilidad y especificidad

ELISA es una prueba muy sensible y específica, que es su ventaja. ELISA en términos de mecanismo de reacción, sensibilidad y especificidad está cerca de RIF, porque los mismos anticuerpos están involucrados en ambas reacciones. La mayoría de los investigadores notan una alta especificidad y sensibilidad en todas las etapas de la enfermedad. La sensibilidad de varias variantes de ELISA, según GA Dmitriev, alcanza el 98-100% y la especificidad es del 96-100%. Según TsNIKVI, la sensibilidad de ELISA para la sífilis es del 99,1% (número de pedido 87 M3 RF).

La variante del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es una de las reacciones serológicas más sensibles, permitiendo la detección de anticuerpos de 0,0005 μg / ml y antígenos de 0,000005 μg / ml.

7. Alcance del método

Se recomienda el uso del método al examinar a mujeres embarazadas, personas de contacto, donantes y representantes de grupos de riesgo. ELISA se puede utilizar tanto como prueba de detección como prueba de confirmación. En un tiempo relativamente corto de su historia, ELISA ha evolucionado de una prueba indicativa a una confirmatoria. En el diagnóstico de sífilis, la prueba también se utiliza como confirmación para muestras que muestran resultados positivos utilizando varias pruebas no treponémicas y RPHA.

El método ELISA se puede utilizar en una versión cuantitativa con el cálculo del índice de positividad o reactividad, lo que le permite evaluar el nivel de anticuerpos en la muestra.

Actualmente en Rusia, el uso del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para el diagnóstico de sífilis está regulado por la Orden del Ministerio de Salud de la Federación de Rusia No. 87 del 26 de marzo de 2001 "Sobre la mejora del diagnóstico serológico de la sífilis" (Apéndice No. 1 "Establecimiento de pruebas de detección y diagnóstico de la sífilis"). La orden planea reemplazar el RSK en el complejo de serorreacción (CSR) con ELISA y RPGA.

8. Fuentes y causas de errores de estadificación, resultados falsos positivos y falsos negativos

El inmunoensayo enzimático es un estudio complejo de varias etapas, en el que es necesario seguir estrictamente todas las recomendaciones de los fabricantes de kits de diagnóstico, las reglas para ajustar y ajustar el equipo utilizado en el estudio.

Los siguientes puntos pueden ser la fuente de errores al configurar ELISA:

Investigación en la reacción de suero sanguíneo hiperlipidémico, hemolizado o muestras con signos de crecimiento bacteriano;

No practique dos o más congelaciones de una muestra de material biológico; si es necesario, use suero de un tubo de ensayo duplicado si es necesario volver a realizar la prueba;

Violación de los términos y condiciones de almacenamiento del inmunoabsorbente y la solución de lavado; uso de kits de prueba vencidos;

Aplicación de componentes de reacción de otros kits de diagnóstico;

Violación del tiempo de las etapas de la reacción;

Secado de los pocillos de la placa inmunológica en las etapas de la reacción;

Reutilización de platos de plástico (bandejas de plástico) para preparar una mezcla de cromógeno y sustrato;

Incumplimiento de la frecuencia de control metrológico de los parámetros operativos de los dispositivos utilizados (lavadora y espectrofotómetro);

Uso de material de vidrio de laboratorio contaminado al configurar reacciones: matraces, probetas graduadas, tubos de ensayo, pipetas, puntas de pipeta;

Falta de minuciosidad en la realización de diluciones de muestras de material biológico;

Errores al introducir una muestra de material biológico en el pocillo correspondiente de la placa;

Errores al transferir los resultados del estudio al libro de registro, protocolo del estudio o formulario de respuesta.

La implementación cuidadosa de las recomendaciones de las instrucciones para el uso de kits de prueba de diagnóstico, la verificación regular de la precisión de los dispensadores de pipetas y dispositivos automáticos, el uso de controles internos positivos y negativos permiten obtener resultados de ELISA con alta reproducibilidad.

9. Características, ventajas y desventajas

ELISA se refiere a métodos modernos y prometedores de serodiagnóstico de la sífilis debido a su simplicidad, reproducibilidad y disponibilidad. La determinación de anticuerpos por ELISA es un método de diagnóstico ideal para el examen simultáneo de un gran número de muestras. Debido a sus ventajas, ha ganado popularidad en todos los países.

La tecnología ELISA garantiza el cumplimiento de todas las recomendaciones de los fabricantes de kits de pruebas de diagnóstico comerciales y el rigor del procedimiento de investigación. Para realizar estudios en IFA, es necesario adquirir equipo especial adicional. La técnica de fraguado lleva más tiempo en comparación con RMP, RPR y RPHA.

La presencia de automatización de una serie de etapas o de todo el proceso en su conjunto permite examinar simultáneamente una gran cantidad de muestras de material biológico con un alto grado de estandarización de la investigación, minimizando el elemento subjetivo en la evaluación de los resultados, la posibilidad de almacenar investigación fija. protocolos, lo que le permite archivar datos de investigación y consultarlos nuevamente para un análisis retrospectivo.

Ventajas:

• Permite la determinación diferenciada y total de anticuerpos IgM e IgG contra el agente causante de la sífilis.
• alta sensibilidad y especificidad, acercándose al 100%,
• reproducibilidad
• capacidades de automatización

Las ventajas de ELISA incluyen una alta especificidad (96-100%) y sensibilidad (98-100%), señaladas por la mayoría de los investigadores.

La presencia de automatización de una serie de etapas o de todo el proceso en su conjunto permite estudiar simultáneamente el flujo con una gran cantidad de muestras de material biológico con un alto grado de estandarización de la investigación, minimización del elemento subjetivo en la evaluación de los resultados, la posibilidad de almacenar protocolos de investigación fijos que le permiten archivar los datos de la investigación y consultarlos nuevamente para un análisis retrospectivo ...

Las desventajas significativas de las técnicas manuales, incluida la determinación de anticuerpos contra los antígenos de T. pallidum mediante ELISA, son:

~ posibles errores del personal durante la investigación (descuido, negligencia, violación de la tecnología);

~ imposibilidad de estandarización completa del proceso de investigación con una versión manual de ELISA;

~ mayor riesgo de infección del personal.

10. Modificaciones del método

Junto con el clásico ELISA indirecto, el método también se conoce trampa ELISA... Fue propuesto en 1989 por O. E. Ijsselmudien et al. para detectar anticuerpos IgM contra antígenos Tr. pallidum. El método es muy específico y sensible.

En la superficie de los pocillos de la placa, se absorben los anticuerpos purificados contra las inmunoglobulinas humanas de clase M y, después de la incubación del suero de prueba, todas las IgM se unen al portador. La presencia entre los antígenos IgM asociados específicos Tr. pallidum se detecta utilizando antígenos Tr. pallidum conjugado con una enzima.

Este método permite detectar anticuerpos no solo de la clase IgM, sino también de las clases IgG, IgA. Para ello, los pocillos de las placas se sensibilizan con anticuerpos purificados por afinidad de una determinada clase contra inmunoglobulinas humanas. En este caso, los anticuerpos de esta clase se capturan del suero y la detección de anticuerpos treponémicos se lleva a cabo mediante su conexión con un conjugado que representa la conexión de un antígeno treponémico con una enzima.

El uso de una versión trampa del inmunoensayo enzimático reduce el riesgo de reacciones falsas positivas mediadas por factor sanguíneo reumatoide, reacciones cruzadas entre inmunoglobulinas de las clases M y G. Al examinar a los recién nacidos, en este caso, los resultados falsos positivos del análisis asociado con la También se excluye la detección de IgM dirigida contra IgG antitreponémica materna.

Se utilizan ampliamente como opciones de ELISA en el extranjero. ensayo inmunológico enzimático (EIA) y el sistema Sífilis ICE... En este último, una mezcla de anticuerpos de IgM e IgG, así como tres proteínas recombinantes de T. pallidum, se absorbe en los pocillos de la placa. Los resultados positivos se prueban en el mismo sistema de prueba en dos repeticiones para obtener el resultado final.

En Rusia, se han desarrollado varios sistemas de prueba para el serodiagnóstico de la sífilis mediante ELISA con reactivos domésticos. Estos sistemas son muy específicos y sensibles.

Además de lo anterior, también existen otras opciones de ELISA, entre ellas las que permiten la detección directa del patógeno en sangre (ELISA directo), dot-ELISA con reacción en tiras de nitrocelulosa, ELISA con sangre capilar, así como inmunotransferencia, o Western Blot, con detección simultánea de AT a varios componentes del patógeno.

Una modificación moderna mejorada de ELISA es la inmunotransferencia.

ICA (ensayo de inmunoquimioluminiscencia), ICL (inmunoquimioluminiscencia)

Con el desarrollo de diagnósticos de laboratorio en el contexto de la modernización de la atención médica en la Federación de Rusia, la automatización de la investigación de laboratorio ha entrado en la práctica de los laboratorios, lo que permite estandarizar las etapas analíticas de la investigación. Esto mejora la calidad de los diagnósticos. Con la introducción de la automatización, comenzaron a utilizarse nuevos métodos de alta tecnología con alta sensibilidad y especificidad, como el inmunoensayo por quimioluminiscencia (CLIA)

La quimioluminiscencia es el proceso de emisión de fotones durante la transición de productos excitados electrónicamente de reacciones químicas oxidativas a su estado de energía inicial. Durante la reacción de quimioluminiscencia, se libera una cantidad significativa de energía y el rendimiento cuántico de la luz emitida es bastante alto. De todos los métodos no isotópicos, la quimioluminiscencia proporciona la mayor sensibilidad. Para los métodos inmunométricos, la sensibilidad de la quimioluminiscencia es órdenes de magnitud mayor que la sensibilidad del radioinmunoensayo.

El método de inmunoquimioluminiscencia (ICL) ha encontrado ahora su aplicación en el diagnóstico de marcadores de tumores, enfermedades autoinmunes, diabetes, cardiomarcadores, hormonas (glándula tiroides, glándulas suprarrenales, hormonas sexuales femeninas y masculinas), infecciones por antorcha, hepatitis viral, grupo del herpes. virus.

Sobre la base del método de inmunoquimioluminiscencia, se han desarrollado una serie de sistemas de prueba altamente sensibles y específicos (98-100%) para el diagnóstico de la sífilis, que se utilizan principalmente en el extranjero.

El método utiliza lipoproteínas recombinantes manipuladas genéticamente como antígenos, que son análogos completos de los antígenos de T. pallidum.

Según los resultados de un estudio clínico, el método ICA ha recibido reconocimiento y se recomienda su uso en el diagnóstico de laboratorio de la sífilis en la Federación de Rusia como prueba de detección y confirmación si los laboratorios cuentan con el equipo adecuado. En 2012, la ACI se incluyó como prueba de detección y confirmación para el diagnóstico de sífilis en las Guías clínicas para el manejo de pacientes con infecciones de transmisión sexual e infecciones urogenitales.

Por lo tanto, el uso de ICA de alta tecnología, que ha entrado en la práctica de los diagnósticos de laboratorio nacionales y mundiales con la introducción de la automatización, ofrece las siguientes ventajas:

• exclusión de la influencia de factores subjetivos en la etapa analítica del estudio
• seguridad del personal al realizar investigaciones sobre material biológico potencialmente infeccioso
• aumentando la velocidad de obtención de resultados por parte del paciente
• estandarización de la investigación y control de calidad de la investigación
• Entrega de resultados confiables y confiables a los pacientes.
• investigación de laboratorio clínico de alta calidad.

En términos de sensibilidad, el método ICA es comparable al método de radioinmunoensayo, y en términos de simplicidad de ejecución, seguridad para el personal y muchos otros parámetros, lo supera.

El método ICA, que tiene una alta sensibilidad y especificidad (98-100%), permite determinar cuantitativamente el nivel de anticuerpos contra el agente causante de la sífilis y puede usarse para confirmar la infección y el cribado sifilíticos. Limitaciones de uso: no se puede utilizar para controlar la eficacia de la terapia, puede dar un resultado falso positivo.

Inmunocromatografía (IHG).

Los métodos para detectar anticuerpos específicos de treponema basados ​​en los métodos de inmunocromatografía (IHG) son relativamente nuevos para su uso en la Federación de Rusia. Como en el método ICA, las lipoproteínas recombinantes obtenidas por métodos modificados genéticamente (por ejemplo: antígenos Tp15, Tp17, Tp47) y el péptido biosintético TmpA se utilizan como antígenos. Los antígenos enumerados también se utilizan en varias combinaciones en la composición de inmunoabsorbentes en ELISA e inmunotransferencia.

El método IHG le permite determinar rápidamente el contenido de anticuerpos específicos de treponema contra el agente causante de la sífilis en muestras de suero y sangre total sin el uso de equipo de laboratorio especial y se usa en la provisión de atención primaria de salud, incluso para indicaciones epidemiológicas.

Limitaciones de uso: no se puede utilizar para controlar la eficacia de la terapia, puede dar un resultado falso positivo.

PBT (pruebas sencillas y rápidas a pie de cama)

Relativamente recientemente, en el serodiagnóstico de la sífilis, comenzó a desarrollarse una dirección en el desarrollo de las llamadas pruebas rápidas simples (PBT), o pruebas a la cabecera del paciente (Point-of-care - POC). Las pruebas sencillas y rápidas a pie de cama, o las pruebas inmunocromatográficas, permiten la determinación rápida del contenido de anticuerpos treponemoespecíficos contra el agente causante de la sífilis en muestras de suero y sangre total sin el uso de equipo de laboratorio especial y se pueden utilizar en la prestación de atención primaria de salud, incluyendo para indicaciones epidemiológicas. Limitaciones de uso: no se pueden utilizar para controlar la eficacia de la terapia, pueden dar un resultado falso positivo.

Estas pruebas se basan en la determinación inmunocromatográfica de anticuerpos frente a antígenos treponémicos de treponema pallidum I se realizan en tiras; se puede utilizar tanto sangre completa como suero (Herring A., Ballard R. et al, 2006). El formato de prueba le permite realizar investigaciones en ausencia de equipos especiales y sin el uso de electricidad. Sin embargo, debido a la sensibilidad y especificidad relativamente bajas, estas pruebas aún no se utilizan ampliamente en la práctica.

Inmunotransferencia (Western Blot)

En los últimos años han surgido métodos de investigación destinados a detectar y analizar el contenido de anticuerpos. a cada antígeno treponema pálido por separado. Uno de estos métodos es el método de inmunotransferencia (o transferencia, inmunotransferencia, transferencia de Western), que se utiliza para determinar anticuerpos IgG o IgM contra treponema pallidum. El método de inmunotransferencia es una modificación del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, una variante de ELISA.

La inmunotransferencia es uno de los métodos más modernos de serodiagnóstico de la sífilis y se utiliza activamente en el extranjero. Recibió su nombre ("Western blotting") como una respuesta humorística a los nombres de las técnicas para determinar el ADN ("Southern Blotting") y ARN ("Northern Blotting").

1. Historia del método

La inmunotransferencia (Western blot) se utiliza para determinar los anticuerpos IgG o IgM contra los antígenos de treponema pallidum (Herremans M. et al., 2007).

2. Inmunotransferencia clásica

Inmunotransferencia clásica(Western Blot Analysis) combina el inmunoensayo enzimático y el método electroforético. Las proteínas-antígenos del agente causante de la sífilis se separan preliminarmente mediante electroforesis y se transfieren a un portador: una membrana de nitrocelulosa (tira). Esta transferencia se llama transferencia. Luego, este portador con puntos divididos (blots), se trata con el suero de prueba y anticuerpos de IgG o IgM, marcado con enzimas o sustancias radiactivas. El método implica el uso de proteínas treponema naturales o recombinantes.

Electroforesis es la separación de compuestos cargados en función de su movilidad en un campo electroforético. Cuando se aplica una diferencia de potencial en algún medio, las moléculas cargadas positivamente se mueven a un electrodo cargado negativamente y las cargadas negativamente se mueven a un electrodo positivo.

La mayoría de las proteínas globulares se ensamblan de tal manera que la mayoría de los grupos cargados, a saber, los hidrófilos, se encuentran en la superficie de la proteína, mientras que los residuos hidrófobos no cargados se sumergen dentro del glóbulo. En un campo eléctrico, de acuerdo con su carga, las proteínas migran hacia el electrodo de carga opuesta.

La separación electroforética de proteínas se realiza en un medio de gel sintético a base de poliacrilamida. Para separar las proteínas de acuerdo con su peso molecular, antes del inicio de la electroforesis, la mezcla de proteínas se preincubó en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS).

Estudios detallados de científicos extranjeros Weber y Osborn (1969) mostraron que después de tal tratamiento, el único factor que puede afectar la movilidad de las proteínas en el gel de poliacrilamida (PAGE) es el tamaño de la proteína, o más bien su peso molecular. Esto hizo posible aplicar el método de electroforesis en PAGE en presencia de SDS para una determinación suficientemente precisa del peso molecular de proteínas y péptidos. En la literatura extranjera, este método se denominó SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio).

Perfil de reactividad en la prueba clásica de WB con antígenos naturales (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio). (1) - resultado positivo de control, (2) - resultado negativo de control, (3-6) - muestras clínicas.

En las pruebas de sífilis que utilizan este método, el treponema pálido, previamente purificado y destruido en sus componentes constituyentes, se somete a electroforesis en poliacrilamida o gel de agarosa. En este caso, los antígenos incluidos en su composición se separan por peso molecular.

Luego, mediante electroforesis vertical, los antígenos se transfieren a una tira de nitrocelulosa, que en adelante contiene un espectro de bandas antigénicas invisibles a la vista, características del treponema pálido.

Durante el análisis, el material de prueba (suero, plasma sanguíneo del paciente, etc.) se aplica a una tira de nitrocelulosa (tira). Si la muestra contiene anticuerpos específicos, durante la incubación se unen firmemente a las bandas antigénicas estrictamente correspondientes (complementarias) y forman un complejo antígeno-anticuerpo.

Después de la eliminación de las inmunoglobulinas no unidas durante el lavado de la tira, sigue la incubación con anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas marcados con enzima (anticuerpos contra IgG o IgM humana), durante la cual los anticuerpos marcados con enzima se unen a los complejos antígeno-anticuerpo existentes en la superficie de la membrana.

Después de la eliminación del conjugado no unido durante la incubación con la solución de sustrato, la enzima interactúa con el sustrato, lo que da como resultado una reacción de color: tinción de las secciones de la membrana (en forma de rayas) donde se encuentran los antígenos individuales de Treponema pallidum, cuyos anticuerpos estaban en el suero de prueba. La intensidad de la tinción depende de la cantidad de anticuerpos unidos al suero. El resultado de la reacción se evalúa visualmente.

La presencia de bandas en ciertas áreas de la placa de nitrocelulosa confirma la presencia de anticuerpos contra antígenos estrictamente definidos de treponema pallidum en el suero estudiado.

Los inmunodeterminantes 15, 5, 17, 44,5, 47 kD determinados mediante este método tienen valor diagnóstico en la sífilis. La inmunotransferencia de Ig G es similar en sensibilidad y especificidad a RIF con absorción (RIF abs). La inmunotransferencia de Ig M puede servir como prueba de diagnóstico para la sífilis congénita.

3. Inmunoblot en formato de análisis inmunológico lineal

El inmunoensayo lineal (LIA) permite la determinación simultánea de anticuerpos contra los antígenos de Treponema pallidum en suero o plasma humanos. Los antígenos están preimpresos en tiras reactivas (tiras), que se suministran como parte de los kits de diagnóstico comerciales.

Las tiras están hechas de membrana de nitrocelulosa, membrana de poliamida con respaldo de plástico o membrana de nailon con respaldo de plástico. Durante la fabricación, se colocan varios antígenos discretos en la tira de prueba como líneas antigénicas separadas. Además de estos antígenos de la sífilis, se aplican cuatro líneas de control más a cada carril: estreptavidina y muestras de control (línea de corte 3 +, 1 + y ±).

Para las tiras, se utilizan antígenos artificiales obtenidos mediante métodos de ingeniería genética: proteínas recombinantes o construcciones polipeptídicas sintéticas. Estos son análogos de los antígenos de superficie del treponema pálido: TpN15, TpN17, TpN47 y TmpA con pesos moleculares de 15, 17, 47 kDa y 44,5 (TmpA), donde kDa = kiloDaltons. Con su ayuda, se determinan los anticuerpos séricos contra varios componentes inmunodominantes del patógeno.

La incubación de la muestra de prueba se realiza en una cubeta donde también se coloca la tira reactiva. Los anticuerpos contra T. pallidum se determinan uniéndose a los antígenos que recubren las tiras reactivas. Si la muestra contiene anticuerpos específicos para T. pallidum, forman enlaces con líneas de antígenos individuales. Cuando los anticuerpos contenidos en el suero de prueba interactúan con antígenos discretos de T. pallidum colocados en la tira reactiva, se forma un complejo antígeno-anticuerpo en forma de franjas coloreadas detectables visualmente.

Teniendo en cuenta los resultados de la inmunotransferencia, la reactividad del suero a cada uno de los antígenos se evalúa por separado. Se emite una respuesta positiva general cuando se obtiene un resultado simultáneamente con dos o tres de los antígenos presentados.

Los procedimientos de investigación se realizan de forma manual o en un analizador especial, con la interpretación de los resultados mediante un programa informático especializado en enfermedades infecciosas.

Debido al alto grado de purificación de los antígenos recombinantes y la detección simultánea de anticuerpos contra los determinantes más inmunogénicos del agente causante de la sífilis, el método tiene una alta sensibilidad y especificidad.

4. Contabilización de los resultados

Para leer la intensidad de la tinción de las bandas antigénicas en las tiras, se han desarrollado fotómetros, cuyo funcionamiento se basa en la reflexión de la señal, lo que excluye la evaluación subjetiva y proporciona el potencial de automatización.

5. ¿En qué períodos de la enfermedad es mejor usar

Las pruebas que utilizan el método de transferencia Western pueden detectar anticuerpos específicos contra los antígenos de Treponema pallidum en una etapa muy temprana de la enfermedad. Los más significativos en el diagnóstico de la sífilis son los anticuerpos contra los antígenos TpN15, TpN17, TmpA y TpN47 de treponema pálido. Estos antígenos son proteínas de membrana con pesos moleculares de 15, 17, 44,5 y 47 kDa, respectivamente.

Cuando el treponema pálido se introduce en el cuerpo humano, los anticuerpos antisifilíticos aparecen en este orden: primero, se desarrolla una respuesta inmune a los antígenos TpN17, luego a TpN47, después a TpN15 y luego a todo TmpA. Al tener en cuenta los resultados de la prueba, la reactividad del suero a cada uno de ellos se evalúa por separado. Por ejemplo, cuando en una transferencia lineal hay reactividad solo con la línea antigénica TpN17 y TpN47, esto significa que la enfermedad se encuentra en su etapa inicial. Cuanto más reactivas se vuelven las líneas antigénicas, más se desarrolla la infección. Al tratar la sífilis, el patrón de reactividad en esta prueba cambia.

La determinación de IgM a proteínas con un peso molecular de 15,17, 41, 47 kDa permite identificar el 29,2% de los pacientes con sífilis secundaria, el 12,5% - con sífilis latente precoz y el 8,0% - con serorresistencia. La búsqueda de IgG a las mismas moléculas se caracteriza por una sensibilidad del 61,6% para la serorresistencia y del 100% para la sífilis latente secundaria y precoz.

6. Sensibilidad y especificidad

Según los datos de la literatura, la sensibilidad y la especificidad de la prueba son muy altas: 99,6-100 y 99,3-99,5%, respectivamente. En el método clásico, esto se consigue mediante la separación electroforética de proteínas, glicoproteínas y lipoproteínas y la máxima especificidad de detección de sueros inmunes o anticuerpos monoclonales. En condiciones de trabajo óptimas, la inmunotransferencia puede detectar antígenos en cantidades inferiores a 1 ng en el volumen de prueba.

La sensibilidad de la transferencia lineal también es del 99,6% y la especificidad oscila entre el 99,3% y el 99,5%.

Según los expertos, la inmunotransferencia con antígenos altamente específicos recombinantes es similar en sensibilidad y especificidad a RIF-abs.

Según los datos de la literatura extranjera y los resultados de un estudio en TsNIKVI, el método de inmunotransferencia en el diagnóstico de la sífilis tiene una alta sensibilidad (98,8-100%) y especificidad (97,1-100%).

7. Alcance del método

La inmunotransferencia (inmunotransferencia) es un método de referencia muy específico y muy sensible. La alta sensibilidad y especificidad permiten considerar este método como una prueba de confirmación de la sífilis. El método se puede utilizar para confirmar el diagnóstico, así como si otras pruebas treponémicas dan resultados cuestionables y contradictorios. Con la ayuda de la inmunotransferencia, es posible confirmar el diagnóstico en pacientes con resultados de prueba positivos o inciertos obtenidos, incluso con la ayuda de RPHA o ELISA.

8. Fuentes y causas de errores de estadificación, resultados falsos positivos y falsos negativos

Los resultados falsos positivos son muy raros. Los resultados falsos negativos también son bastante raros y se observan en pacientes con inmunodeficiencias, más a menudo en pacientes infectados por el VIH y con el efecto de una "ventana" de diagnóstico debido a un retraso en la síntesis de anticuerpos, así como en caso de errores en la etapa de ajuste.

El uso de sistemas de prueba modernos dicta el cumplimiento exacto de todos los requisitos tanto para el material como para el rendimiento de la reacción. Básicamente, la fuente de errores es una violación del orden y la tecnología del estudio (especialmente para el Western blot clásico), el incumplimiento de las recomendaciones de los fabricantes de kits de prueba. ... También se pueden cometer errores en la recolección, entrega, almacenamiento de muestras de suero y en la ejecución de pruebas. Además de las muestras dañadas, otras posibles causas incluyen el uso de kits de prueba vencidos y errores en el análisis de los resultados de las pruebas.

9. Características, ventajas y desventajas

La singularidad de la inmunotransferencia radica en su alto contenido de información y la fiabilidad de los resultados.

La prueba no requiere antígenos altamente purificados, sueros de referencia y de control. La identificación de un objetivo de anticuerpo se basa en el peso molecular de la proteína con la que reaccionan los anticuerpos del suero del paciente. En una sola reacción, se puede detectar la unión de anticuerpos a varios antígenos, cada uno de los cuales se puede caracterizar con precisión. Debido a esto, la inmunotransferencia tiene una serie de ventajas sobre otros métodos para detectar anticuerpos, cuyos resultados dependen de la estandarización, sensibilidad, calidad del sustrato, inestabilidad o insolubilidad de ciertos antígenos.

El método es fácilmente reproducible, relativamente simple en la ejecución e interpretación de los resultados, permite determinar el espectro de anticuerpos contra varios antígenos de T. pallidum a la vez y evaluar la contribución de anticuerpos de diferente especificidad a la reacción general.

El uso de antígenos peptídicos y recombinantes altamente purificados minimiza la reactividad inespecífica de los sueros. El uso del método permite abandonar los métodos subjetivos y laboriosos que suponen un peligro para el investigador (inoculación de cepas de G. pallidum, trabajo con T. pallidum patógeno al realizar una reacción). Esto determina la preferencia del método de inmunotransferencia sobre otras pruebas treponémicas (RIF y especialmente RIBT) para el diagnóstico de sífilis.

10. Modificaciones del método

Hay varios sistemas de prueba comerciales basados ​​en este método. Algunos de ellos están hechos en el formato mancha occidental, consisten en tiras sobre las que se transfieren los componentes proteicos de T. pallidum, previamente separados por electroforesis en gel de poliacrilamida.

Otros están en el formato mancha lineal, consisten en tiras en las que polipéptidos recombinantes y sintéticos, análogos de antígenos de superficie de T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 y TmpA, se absorben en forma de líneas discretas.

Los resultados de la transferencia Western son más difíciles de interpretar ya que se detecta una amplia variedad de anticuerpos en las tiras, muchos de los cuales son específicos de grupo. Por el contrario, la interpretación de los resultados de la transferencia lineal es sencilla; Además, las líneas de control adicionales aplicadas a la tira permiten una evaluación semicuantitativa del nivel de anticuerpos contra los cuatro antígenos de T. pallidum.

tecnología xMAP

хMAP es una tecnología moderna que permite estudios de múltiples parámetros mediante la detección simultánea de múltiples analitos en una muestra biológica. Las microesferas coloreadas recubiertas con reactivos de captura (oligonucleótidos, anticuerpos, antígenos) se utilizan como fase sólida.

La muestra de prueba se agrega a la solución que contiene las microesferas. Los analitos detectados en la muestra se unen a la microesfera correspondiente, después de lo cual se agrega a la solución un agente de detección (anticuerpos detectores, marcador fluorescente). Para la detección del analito a determinar se utiliza un sistema de dos láseres, que permite tanto una valoración cualitativa de la presencia de un analito en una muestra (para ello se utiliza un láser rojo, que clasifica las microesferas por color), y una evaluación cuantitativa del contenido de analito en una muestra (para esto, se utiliza un láser verde).

El estudio se realiza en modo automático en analizadores como Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) equipados con software.

El rendimiento de la tecnología xMAP supera significativamente el rendimiento del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) clásico con un volumen de biomaterial significativamente menor.

La tecnología xMAP, que tiene una alta sensibilidad analítica, se utiliza actualmente para resolver una amplia gama de problemas clínicos. Con su ayuda, en una muestra de material biológico, se lleva a cabo la detección simultánea de marcadores tumorales conocidos, cardiomarcadores, marcadores de la fase aguda y diabetes mellitus, una amplia gama de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento. La detección simultánea de varios analitos en una muestra biológica puede reducir significativamente el tiempo de examen del paciente. Hasta la fecha, se han desarrollado varios sistemas de prueba para detectar anticuerpos contra patógenos de ITS, en particular infección sifilítica, utilizando el método xMAP.

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La sífilis es una enfermedad infecciosa que se puede contraer por contacto sexual. El agente causante de la enfermedad es una bacteria como el treponema pálido (espiroqueta), que afecta los órganos internos, las membranas mucosas y la piel.

Para identificar la enfermedad, se utilizan análisis de sangre y, en algunos casos, líquido cefalorraquídeo. Los resultados se indican mediante más o se utilizan cruces de 1 a 4.

La sífilis cuatro cruces se considera la etapa más peligrosa para los humanos. La interpretación de los análisis y el diagnóstico está determinada exclusivamente por el médico.

Cuatro etapas de la enfermedad y sus características.

La determinación de una enfermedad de transmisión sexual se lleva a cabo mediante el estudio de la sangre para detectar la presencia de treponema.

Este método para reconocer la sífilis mediante una prueba serológica es la más común de muchas pruebas.

El inmunólogo ha creado un sistema especial para caracterizar la enfermedad, en el que los cruces indican la cantidad de anticuerpos. Es importante saber que la enfermedad en sí no los contiene, pero sí treponemas, úlceras y una erupción sifilítica.

Un aumento en el título de anticuerpos indica la reproducción activa del patógeno, y los cruces están contenidos en cualquier análisis con una evaluación positiva de la presencia de anticuerpos. Considere las etapas de la enfermedad y sus características.

Sífilis una cruz

Si hay cruces, la sífilis es positiva, sin embargo, existen dudas incluso al observar anticuerpos en la sangre para combatir la enfermedad.

Por lo tanto, los médicos consideran que el resultado de esta prueba es dudoso. A menudo, el resultado de una prueba puede indicar otra afección médica.

Un resultado de 1+ significa que ha pasado poco tiempo desde la etapa de infección. El plus puede estar presente después del tratamiento completo, cuando se han conservado los anticuerpos.

Sífilis dos cruces

Dos cruces significan un resultado positivo, lo que indica la presencia de treponema en la sangre.

Un aumento en el título indica una concentración baja en la sangre. Por lo tanto, debe examinar la bacteria para aprobar la conclusión de 2 más antes de comenzar la terapia.

Sífilis tres cruces

Un análisis de sangre con una puntuación de tres cruces indica un resultado positivo y no se puede refutar. Un estudio repetido de la sangre solo confirma el diagnóstico de la tercera cruz, que es característica de la enfermedad en la etapa II de desarrollo.

Sífilis cuatro cruces

La conclusión más desfavorable es el resultado de la cuarta cruz. Pero esto no significa en absoluto que la enfermedad no se pueda curar.

Esta etapa se caracteriza por una erupción notable, pérdida de cabello y un aumento de la temperatura corporal. El número de anticuerpos es elevado, por lo que la conclusión está fuera de toda duda.

¿Cómo se realiza el examen?

El reconocimiento de la sífilis se lleva a cabo en dos etapas, comenzando con el examen del paciente y terminando con el estudio de la sangre en busca de anticuerpos.

El médico examina al paciente, mientras ya determina la probabilidad de la presencia de la enfermedad:

• detección de úlceras en los genitales o en la cavidad bucal;
• erupciones dermatológicas, induraciones;
• calvicie en el área de la cabeza.

El médico aclara la información del paciente, basándose en preguntas sobre la presencia de relaciones sexuales sospechosas o el tratamiento de una enfermedad venérea.

Exámenes de laboratorio

Hoy en día, un estudio para identificar la enfermedad de la sífilis 4 de la cruz se puede transmitir de muchas formas, las más famosas se presentan a continuación:

• RPR: una prueba que detecta anticuerpos en la sangre contra los fosfolípidos de la membrana citoplasmática;
• RIF (reacción de inmunofluorescencia) es una reacción más sensible, ya que muestra un resultado con una evaluación positiva ya en la primera etapa en el 80% de los pacientes;
• RW (el método del inmunólogo alemán Wasserman) es un método de investigación rápido y confiable que le permite realizar un examen y prescribir productos farmacéuticos efectivos;
• inmunoensayo enzimático de sangre;
• la reacción se basa en el fenómeno de inmovilización de bacterias por anticuerpos como las inmovilizinas;
• La hemaglutinación pasiva muestra la presencia y cantidad de anticuerpos.

Hoy en día, la sífilis se puede tratar en cualquier etapa. Pero es mucho más fácil tolerar el tratamiento en las primeras manifestaciones de la enfermedad, cuando la infección no ha afectado a todo el cuerpo.

La duración del tratamiento y los medicamentos son recetados por un venereólogo según las características individuales del cuerpo humano y la etapa de la lesión.

No olvide que la mejor prevención de la sífilis es una relación cercana con una pareja a largo plazo en cuya salud está completamente seguro.

El análisis RPGA es una técnica que es una de las más importantes entre otros análisis de sangre. Con su ayuda, puede determinar el desarrollo de enfermedades desagradables de naturaleza infecciosa intestinal. Pero a menudo el análisis se usa para detectar la sífilis. El estudio es sumamente preciso y confiable.

RPHA significa reacción de hemaglutinación pasiva.

RPHA se basa en el fenómeno de aglutinación de eritrocitos, en el que los antígenos - reactivos RPHA se adsorben en la superficie, cuando se les agrega el suero sanguíneo de un paciente con sífilis.

Después de combinar el suero de un infectado con sífilis con el reactivo RPHA, se produce la aglutinación (unión o adherencia) de los eritrocitos y se produce su precipitación. El grado de adhesión depende directamente de la acumulación y densidad de anticuerpos en el suero sanguíneo, por esta razón, la RPHA ayuda no solo a detectar la presencia de anticuerpos, sino también a identificar su cantidad.

El resultado se divide en infección primaria y secundaria, que se expresa en la manifestación de varios anticuerpos. Con el primario, se activan IgM, con el secundario - IgG. La precisión del estudio de la segunda fase se vuelve aún más específica. Si en la primera fase es aproximadamente del 96%, en la segunda puede subir hasta el 99%.

El análisis es bueno como estudio independiente, pero es mejor utilizarlo como método de confirmación después de un estudio inespecífico positivo.

Debido a su alta precisión, este análisis se utiliza cada vez más para confirmar o refutar la aparición de un paciente con sífilis.

Además, para una mayor fiabilidad, después de la RPHA, se puede realizar otra prueba de confirmación, por ejemplo, el inmunoensayo enzimático "treponémico".

En general, el diagnóstico siempre se realiza de manera integral, no usando solo un tipo de examen, sino combinando varios métodos que se complementan entre sí.

Haga su pregunta al médico de diagnóstico de laboratorio clínico.

Anna Ponyaeva. Graduado de la Academia Médica de Nizhny Novgorod (2007-2014) y de la Residencia en Diagnóstico Clínico y de Laboratorio (2014-2016).

Una pequeña desventaja, o más bien una característica del análisis, es su sensibilidad incluso después de que se haya curado la enfermedad. El resultado se mantiene positivo durante toda la vida de una persona que ha tenido sífilis. Por esta razón, la RPHA no se usa para diagnosticar una enfermedad temprana o tardía. También es imposible con la ayuda de este análisis revelar la efectividad del tratamiento.

Con cualquier resultado positivo, existe la sospecha de infección. Pero periódicamente, puede ocurrir una manifestación de una reacción falsa positiva. Es cierto que su presencia cuantitativa no suele superar el 3% y se debe a una serie de razones no infecciosas.