Semnificația numerelor 1 128 este sifilis. Metode de bază pentru diagnosticarea sifilisului și decodarea indicatorilor

Sifilisul este clasificat ca o boală cu transmitere sexuală, principalul „vinovat” al căruia este treponemul palid. Această bacterie poate pătrunde în organism după contact sexual sau prin mijloace casnice.

Măsurile de diagnosticare care vizează identificarea acestei boli sunt complexe. Rezultatele testelor pot fi afectate de diferite antibiotice, sarcină și alți factori care vor fi descriși în articol.

Când se prescrie o analiză pentru sifilis - indicații pentru diagnostic

Unii pacienți, când vin pentru examinare la un ginecolog sau androlog, nu oferă informații obiective despre calitatea vieții lor sexuale.

Poate că motivul este jena obișnuită, sau poate că motivul este lipsa de informații în domeniul bolilor cu transmitere sexuală.

Medicul poate trimite la examinare chiar dacă sifilisul nu se manifestă în niciun fel, iar pacientul este 100% sigur că nu s-ar putea infecta cu această boală. Faptul este că patologia considerată poate fi transmis prin contactul zilnic sau fii asimptomatic.

Testarea pentru sifilis este ordonată dacă:

• Trebuie să fii înregistrată în timpul sarcinii.
• Pacientul dorește să doneze sânge în calitate de donator.
• Există perspectiva de a ocupa un anumit post (soldat, lucrător sanitar, bucătar etc.), ceea ce necesită trecerea unei comisii medicale speciale.
• Persoana este în închisoare.
• A avut loc un contact sexual cu un pacient cu sifilis.
• Mama unui nou-născut are sifilis.
• Pacientul a prezentat semne ale acestei boli. Adesea, acestea sunt erupții cutanate în zona genitală.
• Prima analiză a confirmat prezența bolii în cauză.

Se fac teste de sânge regulate în prezența sifilisului. Acest lucru este necesar pentru a controla calitatea măsurilor terapeutice.

După terapie, pacientul ia și sânge pentru cercetare.

Cum să fii testat pentru sifilis

Pentru cercetare se folosesc adesea manipulări sânge dintr-o venă. În anumite situații, asistentul de laborator poate preleva proba potrivită pentru diagnostic din deget sau din măduva spinării.

Intervalul de la momentul livrării până la primirea rezultatelor poate fi diferit: de la o zi la două săptămâni. Totul va fi determinat de tipul de testare.

În pregătirea pentru efectuarea unui test de sânge pentru a identifica boala în cauză, trebuie urmate următoarele recomandări:

• Alimentele grase cu o zi înainte de test ar trebui excluse din dietă. Va provoca opalescența serului sanguin, ceea ce va distorsiona rezultatele obținute.
• Evitați mâncarea timp de cel puțin 8 oreînainte de testarea pentru sifilis.
• Alcoolul, nicotina pot interfera cu evaluarea reacției. Experții vă sfătuiesc să nu beți băuturi care conțin alcool cu ​​24 de ore înainte de test și ar trebui să așteptați cu țigări cu cel puțin o oră înainte de test.
• Dacă pacientul ia antibiotice, analiza specificată trebuie efectuată la cel puțin o săptămână după terminarea tratamentului.

Metode de transmitere a materialului pentru cercetare și decodare a indicatorilor

Astăzi, niciuna dintre metodele de diagnosticare a acestei boli nu este capabilă să garanteze acuratețea informațiilor obținute. În orice caz, există erori și pot ajunge la 10%.

În acest sens, aplicați complex de metode de cercetare.

Analize serologice - teste nespecifice și specifice

Acest tip de diagnostic este indicat pentru simptomele limitate ale bolii sau absența completă a acesteia.

Există două tipuri de serodiagnostic:

1.Teste nespecifice

Ele sunt relevante atunci când trebuie să testați un grup mare de oameni pentru sifilis, dar această tehnică nu este potrivită atunci când trebuie să confirmați diagnosticul.

Testarea nu este dificilă, dar evaluarea finală trebuie făcută de medic.

Aceste tipuri de diagnosticare includ următoarele teste:

A) Microreacția de precipitare (MR)

Un studiu similar este indicativ după o lună de la infecție. Sângele de la un deget este supus examinării, dar uneori poate fi utilizat lichidul cefalorahidian.

Rezultat pozitiv al testului ( anticorpii din titru variază de la 1:2 la 1:320 ) nu înseamnă încă că pacientul are sifilis: este posibil să se confirme în final diagnosticul prin trecerea unor teste suplimentare.

O reacție negativă poate fi rezultatul a două opțiuni:

• Pacientul nu are sifilis.
• Sifilisul este, dar - în stadiul inițial de dezvoltare.

B) Reacția Wasserman ( P.B. RW)

Materialul pentru testare aici este același ca în analiza de mai sus.

Această metodă de examinare este capabilă să ofere informații obiective la cel puțin 6 săptămâni de la infectare. Se poate vorbi despre prezența patologiei venerice indicate dacă titrurile de anticorpi sunt 1:2 - 1:800.

Rezultatele analizelor în RV sunt evaluate prin următoarele semne matematice:

• « — » Fără sifilis.
• « + „sau” ++ „- este afirmată o reacție slab pozitivă.
• « +++ ' este o reacție pozitivă.
• « ++++ » - pacientul are o reacție puternic pozitivă la sifilis.

2. Teste specifice

Există multe teste diferite pentru acest tip de examinare care vizează anticorpi specifici. Ele nu apar imediat în sânge, ci la aproximativ o lună de la infectare și pot rămâne acolo câțiva ani (dacă nu sunt tratate).

Medicul trebuie să aleagă în mod rezonabil unul sau altul tip de analiză, să cunoască fiecare dintre ele în detaliu, să navigheze în rezultatele obținute și să poată diferenția diagnosticul după primirea răspunsului.

Cele mai comune tipuri de teste specifice sunt:

A) Reacția de imunofluorescență (RIF)

Este relevantă în stadiile foarte incipiente ale sifilisului, dar perioada optimă pentru testare este de 6-8 săptămâni după infectare.

Pentru studiu este necesar sânge capilar/venos.

• Sarcina, defectele țesutului conjunctiv pot provoca o reacție falsă, care este evaluată prin semnul " — «.
• Rezultatele pozitive sunt exprimate ca plusuri (" + ") de la unu la patru.

B) Reacția de aglutinare pasivă (RPHA)

În timpul acestui test, o cantitate mică de sânge este prelevată dintr-un deget/venă, care este apoi amestecată cu globule roșii de berbec/cocoș. În prezența agentului cauzal al acestei boli în fluxul sanguin, microcorpii se lipesc împreună, urmat de subsidența lor.

Acest tip de testare este foarte sensibil: poate confirma o reacție pozitivă la sifilis pentru o lungă perioadă de timp după tratament.

Mononucleoza și erorile în structura țesutului conjunctiv pot fi, de asemenea, cauza unei reacții fals pozitive.

Este nevoie de maxim 1 oră pentru a obține un răspuns, iar pacienții se pot verifica singuri la 4 săptămâni de la infecție: în perioade mai devreme, anticorpii nu vor fi produși în volum suficient.

Puteți aprecia cât timp a fost infecția în sânge după titruri:

• Dacă valoarea lor nu depășește 1:320, atunci infecția a avut loc recent.
• Cu cât titrurile sunt mai mari, cu atât treponemul este mai lung în organism.

C) Imunotestul enzimatic (ELISA)

Una dintre cele mai fiabile metode de diagnosticare a acestei boli, care a început să fie folosită la sfârșitul secolului trecut.

Este foarte indicativ deja la 21 de zile după infecție, iar un rezultat pozitiv cu 98-99% va indica prezența sifilisului.

ELISA este adesea folosit după teste nespecifice sau în combinație cu unele teste specifice.

Testul ELISA prin detectarea unuia sau altui grup de anticorpi în sânge ( IgA, IgM, IgG) face posibilă determinarea stadiului bolii:

• Dacă proba de sânge conțineIgA dar absentIgM,IgG: nu au trecut mai mult de 14 zile din momentul in care treponemul palid a intrat in organism.
• Dacă este identificatIgA,IgM, dar nuIgG: infecția a avut loc acum aproximativ 28 de zile.
• Prezența în sânge a tuturor anticorpilor de mai sus indică faptul că a trecut mai mult de o lună de la infecție.
• Dacă reacția sângelui la prezențăIgA este negativă șiIgM,IgG pozitiv: a trecut o perioadă uriașă de timp de la momentul infecției sau tratamentul bolii a avut succes.

D) Reacția de imobilizare a Treponema pallidum (RIBT)

Una dintre cele mai populare metode de diagnosticare a sifilisului.

Nu are sens să-l folosești în stadiile incipiente ale infecției, dar după a 12-a săptămână, rezultatele testului RIBT sunt de încredere în proporție de 99%.

Această metodă de diagnosticare este utilizată pentru neurosifilis suspectat, sifilis al organelor interne sau în combinație cu teste nespecifice.

Atunci când ia antibiotice, pacientul trebuie să aștepte cel puțin 25 de zile după terminarea terapiei. Antibioticele solubile în apă necesită mai puțin timp pentru a fi excretate din organism: 7-8 zile.

Sângele este prelevat dintr-o venă, pe stomacul gol, iar rezultatele sunt interpretate ca procent de imobilizare:

• Dacă nivelul de imobilizare nu depășește 20%, testul pentru sifilis este considerat negativ.
• Când se depășește 50%, reacția la patologia indicată este pozitivă.

În alte cazuri, este prescris un studiu repetat.

D) Imunoblotting

Una dintre cele mai noi metode de cercetare, la care se apelează atunci când alte teste dau un rezultat îndoielnic.

Cu această manipulare de diagnosticare, este posibil să se detecteze chiar și cantitatea minimă de anticorpi din sânge: are o precizie de aproape 100%.

Nu toate clinicile efectuează astfel de teste: nu este ieftin.

Analize de laborator

Costul analizei luate în considerare este foarte mic și puteți afla despre rezultat în 30 de minute.

1. Pentru a efectua un astfel de studiu, se prelevează o probă de la un pacient din defecte ulcerative/erozive situat în zona genitală. Examinarea microscopică a probei prelevate este adesea efectuată în laborator.

Zonele afectate sunt șterse inițial cu ser fiziologic. Acest lucru va ajuta la protejarea zonei deteriorate de pătrunderea microorganismelor dăunătoare.

2. Apoi, folosind o buclă specială, iritați suprafața câteva minute până când apare un lichid alb limpede. Ar trebui să aveți grijă cu această manipulare: este imposibil ca impuritățile de sânge să intre în proba prelevată.

3. Lichidul extras este transferat într-un pahar transparent. Uneori se amestecă cu soluție salină.

O reacție pozitivă se poate spune atunci când sunt detectate treponeame tipice, care vor avea cel puțin 8 bucle. Dacă rezultatul este negativ, procedura se repetă (uneori de mai multe ori).

Syphilis trna este un test specific pentru detectarea antigenului IgG. De obicei, acest studiu este utilizat după un rezultat pozitiv în RPR sau pentru a evalua eficacitatea tratamentului selectat. Sifilisul trna este un test extrem de sensibil care poate arăta un rezultat pozitiv până la 20 de ani după o terapie de succes și, în unele cazuri, urmele reziduale ale bolii pot persista pentru tot restul vieții.

Testul pentru sifilis tpha (reacție de hemaglutinare pasivă) a fost propus de T. Rathlev în 1965. Esența metodei a fost reacția de lipire și precipitare a eritrocitelor, a căror suprafață în sifilis conține antigene pentru treponemul palid, care se observă numai dacă există anticorpi antitreponemici în sânge.

Analiza Trna se recomandă să fie efectuată la o lună după data estimată a infecției. Înainte de colectare în sine, ar trebui să vă abțineți de la mâncare timp de cel puțin 8 ore. Dacă rezultatele testului trans indică absența infecției, dar pacientul are simptome, simptome precoce de infecție sau a avut relații sexuale cu o persoană care a fost descoperită a fi infectată cu spirochete în trecut, atunci se recomandă să se efectueze o altă infecție. studiu de control cu ​​un interval de 2 săptămâni. Spre deosebire de un rezultat fals-negativ tpha, atunci când se utilizează această metodă de detectare a antigenului IgG, care poate fi cauzată de un studiu prea devreme, un rezultat fals pozitiv pentru treponemul palid poate fi observat în trei cazuri:

• Mononucleoza infectioasa;
• boala lepre;
• Leziuni sistemice ale țesuturilor conjunctive.

Până în prezent, testul tpha a fost folosit ca cel mai eficient test serologic specific pentru a confirma rezultatul pozitiv al altor teste pentru sifilis sau, dacă este necesar, pentru a evalua eficacitatea tratamentului.

Rezultatele studiilor privind prezența antigenului IgG nu se limitează la doar două semne „negative” sau „pozitive”, rezultatele studiului indică și titrul de anticorpi, pe care medicul curant se concentrează în timpul șederii pacientului în spital. pentru a evalua eficacitatea efectului terapeutic. Prin valoarea titrurilor se poate trage o concluzie despre perioada actuală de infecție și succesul măsurilor terapeutice. Astfel, titrurile caracteristice primei etape a bolii variază de la 1:80 la 1:320. Odată cu trecerea bolii la stadiul secundar, analiza pentru sifilis tpha va arăta o creștere vizibilă a titrurilor la 1:5120, urmată de o scădere a perioadei de latentă la 1:80. După o terapie de succes, titrurile pot scădea semnificativ, dar vor rămâne pozitive mulți ani după externare.

Uneori, cu un studiu pozitiv al tpha, titrurile sunt atât de nesemnificative încât diagnosticul de sifilis ridică îndoieli serioase. În acest caz, se notează dubiul datelor obținute și se recomandă o reluare în 1-2 săptămâni.

De obicei, testele pentru sifilis trna sunt efectuate dimineața pentru o perioadă scurtă de timp, ceea ce este asociat cu cerințele pentru studiu, printre care este indicată necesitatea de a livra probe de sânge la laborator nu mai târziu de 2 ore de la recoltarea acestuia. În acest caz, probele trebuie transportate la temperaturi de până la +8°C.

Materialul de testat pentru tpha este serul de sânge donat de o persoană pe stomacul gol. Dacă toate condițiile necesare sunt îndeplinite în timpul prelevării de sânge și al analizei ulterioare, atunci acuratețea datelor obținute va fi de 76% pentru sifilom primar, 100% pentru forma secundară a bolii și 94 pentru stadiul târziu al bolii. Detectarea treponemului palid în perioadele de evoluție asimptomatică a bolii este de aproximativ 97%. Iar nivelul de specificitate, ajungând până la 99%, face posibilă excluderea aproape completă a variantelor de rezultate fals pozitive, facilitând diagnosticul diferențial al pacienților.

Teste treponemale pentru sifilis. Descriere generala.

Pentru a diagnostica în mod fiabil sifilisul și a identifica anticorpii anti-sifilitici în corpul pacientului (în serul de sânge sau lichidul cefalorahidian), sunt utilizate tehnologii speciale de cercetare de laborator - așa-numitele metode serologice.

La efectuarea testelor de diagnostic pentru sifilis se folosesc diverse reacții serologice: aglutinare, precipitare, imunofluorescență, fixare a complementului, imunotest enzimatic etc. Toate aceste reacții serologice se bazează pe interacțiunea antigenelor și anticorpilor.

Se numesc teste serologice specifice treponemală deoarece aceste teste folosesc treponema pallidum sau antigenele acestuia, adică antigene de origine treponemă. Scopul testelor treponemale este de a identifica anticorpi specifici la structurile antigenice ale agentului cauzal al sifilisului, adică anticorpi direcționați în mod specific împotriva bacteriilor T. Pallidum înseși și nu împotriva țesuturilor corpului afectate de treponem. Anticorpii antitreponemici specifici din clasa IgM pot fi detectați încă de la sfârșitul celei de-a doua săptămâni de boală.

7. Rezultate fals pozitive și fals negative

Un test PB pozitiv pentru sifilis la persoanele care nu au boala se numește fals pozitiv. Frecvența rezultatelor fals pozitive la indivizii sănătoși este de 0,2-0,25%. Dacă procentul de rezultate fals pozitive nespecifice ale RV la persoanele sănătoase este foarte scăzut, atunci în unele boli poate fi ridicat.

Toate rezultatele nespecifice ale reacțiilor serologice pot fi împărțite în următoarele grupuri principale:

1. Boli cauzate de prezența antigenelor obișnuite la agenți patogeni similari (spirochete): febră recidivă, iacă, bejel, pint, treponem oral, leptospira.

2. Reacții pozitive datorate modificărilor metabolismului lipidic și modificărilor globulinelor serice. Acestea includ rezultate pozitive la femeile însărcinate cu gută, afectarea compoziției lipidelor ca urmare a otrăvirii cu plumb, fosfor, după administrarea de salicilat de sodiu, digitalică etc. Aceste reacții ar trebui să includă și reacții pozitive în anumite boli infecțioase (tifus, malarie, pneumonie, lepra, endocardita, colagenoza, infarctul miocardic, comotia, cancerul, ciroza hepatica etc.)

3. Erori tehnice de conduită. Alegerea incorectă a dozei de complement, nerespectarea condițiilor și termenilor de păstrare a reactivilor, excluderea probelor martor de ser de sânge din reacție, utilizarea eprubetelor și instrumentelor contaminate.

8. Modificarea reacţiei Wassermann

Există modificări ale reacției Wasserman în versiuni calitative și cantitative, la rece, cu lichid cefalorahidian.

Modificarea RV la frig părea a fi mai sensibil. O caracteristică a metodei de setare a reacției Wasserman la rece este regimurile de temperatură în trei faze la care se realizează legarea complementului. Această reacție se pune și cu cardiolipină și antigen treponemal.

Pe lângă evaluarea calitativă a RW, există o metodă pentru aceasta stabilirea cantitativă cu diferite diluții de ser sanguin (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titrul de reagină este determinat de diluția maximă, care dă totuși un rezultat puternic pozitiv (4+). Formularea cantitativă a RV este importantă în diagnosticul unor forme de sifilis și în monitorizarea eficacității terapiei.

9. Domeniul de aplicare

În Rusia, RSKt face parte din complexul de teste serologice standard pentru sifilis (SSR).

Reacția Wasserman cu antigen treponemic și cardiolipin (RSKt) este folosită pentru

• diagnosticul tuturor formelor de sifilis,
• controlul asupra eficacității tratamentului,
• examinări ale persoanelor care au avut contact sexual cu un pacient cu sifilis,
• examinări ale persoanelor cu suspiciune clinică și anamnestică de sifilis
• în timpul examinării preventive pentru sifilis a pacienților din spitalele psihiatrice și neurologice, donatorilor și femeilor însărcinate, inclusiv a persoanelor îndrumate pentru întreruperea artificială a sarcinii.

În prezent, prin ordin al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, se recomandă înlocuirea RSKT cu metode treponemale mai sensibile (ELISA sau RPHA).

În străinătate, reacția Wasserman cu antigenul treponemal nu a fost folosită în practica clinică de laborator de mult timp și nu este inclusă în lista de teste standard recomandate de Organizația Mondială a Sănătății.

Complex de reacții serologice clasice (CSR)

DAC- aceasta complex de reacție utilizată pentru serodiagnosticul sifilisului ca metodă standard. Acest complex de reacții include reacția Wasserman cu antigenul cardiolipin (un extract din inima taurului îmbogățit cu lecitină și colesterol) și antigenul treponemal (o suspensie de treponeame palide culturale apatogene tratate cu ultrasunete), precum și o reacție de microprecipitare (RMP). ) cu plasmă sau ser inactivat, care se plasează cu antigen cardiolipin

CSR devine pozitivă la mijlocul perioadei primare (diviziunea sa în seronegativ și seropozitiv este determinată precis de CSR), în perioada secundară CSR este pozitivă la 98-100% dintre pacienți, iar în perioada terțiară - doar la 60-70 %. Adică, pe măsură ce durata bolii crește, pozitivitatea CSR scade treptat.

Avantajele KSR:

1) Ieftin, simplitate și viteza de setare. Acest lucru este valabil mai ales pentru reacția de microprecipitare: RMP este în prezent principala metodă de screening (screening);

2) Testele non-treponemale sunt convenabile de utilizat pentru a monitoriza vindecarea sifilisului.

Dezavantajele CSR:

1) Subiectivitatea evaluării rezultatelor reacțiilor („prin ochi”);

2) Sensibilitate scăzută în formele tardive de sifilis;

3) Lipsa de specificitate în comparație cu testele mai moderne. Când sunt efectuate, sunt adesea observate reacții fals pozitive (LPR).

LPR se poate datora reactivității încrucișate între spirochete palide și alți microbi, tulburări ale metabolismului lipidic și proteic, instabilitate a membranei celulare și formarea de autoanticorpi. LPR se remarcă în infecții acute (malaria, mononucleoză infecțioasă etc.) și cronice (tuberculoză, lepră, hepatită, borelioză etc.), infarctul miocardic, ciroza hepatică, colagenoze (în special în LES), oncopatologie, vaccinare, consum de droguri, abuzul de alcool și alimente grase. Fals-pozitiv poate fi CSR în ultimele săptămâni de sarcină, după naștere și la unele femei în timpul menstruației. Rezultatele CSR fals negative pot fi asociate cu infecția cu HIV.

RIT, RIBT - Reacția de imobilizare a treponemului palid

Testul de imobilizare Treponema pallidum (TPI; Testul de imobilizare Treponema pallidum, TPI) este o metodă clasică care servește la depistarea anticorpilor specifici treponemici. Reacția RIBT folosește treponema pallidum patogen T. pallidum (tulpina Nichols) crescută în testiculele de iepure ca antigen. RIBT se bazează pe pierderea mobilității treponeamelor palide vii după expunerea la anticorpi din serul sanguin și complementul pacientului. Rezultatele sunt evaluate prin microscopie în câmp întunecat. În ciuda faptului că testul RIBT a fost introdus în practica clinică ca un test specific pentru sifilis, este laborios, complex din punct de vedere tehnic, consumator de timp și costisitor de utilizat.

1. Istoricul metodei RIBT

Testul de imobilizare Treponema pallidum (TPRT) este de fapt primul test specific pentru diagnosticul de sifilis. Această reacție a fost prezentată în 1949 de cercetătorii americani Nelson și Mayer (R. W. Nelson și M. M. Mayer) și discutată în detaliu în lucrări științifice din deceniile următoare. Au mai fost făcute încercări nereușite de a utiliza treponeme vii în teste. Datorită faptului că Nelson a reușit să creeze un mediu în care treponemele au rămas viabile până la 8 zile, cercetările sale au fost încununate de succes.

2. Principiul metodei RIBT

Metoda se bazează pe fenomenul de pierdere a mobilității prin treponeame palide în prezența anticorpilor antitreponemici imobilizatori ai serului sanguin și al complementului studiat în condiții anaerobe. Antigenul este treponemul pal patogen viu, obținut de la iepuri infectați artificial cu sifilis.

3. Configurarea testului RIBT

Serul de testat, complementul și antigenul participă la reacție. Serul sanguin al subiectului este adăugat la treponeme vii obținute din țesuturile testiculelor de iepure după infecție artificială. În prezența anticorpilor anti-treponemici-imobilizine în ser, treponeamele palide încetează să se miște (imobilizate). Anticorpii imobilizini sunt anticorpi antitreponemici tardivi.

Reacția se realizează cu seruri inactivate la căldură sau cu probe de ser uscate pe hârtie cerată (picături uscate). Inactivarea serului prin încălzire se efectuează timp de 30 de minute la o temperatură de 56°C. Înainte de a lua sânge, subiectul nu trebuie să primească medicamente, în special preparate cu penicilină. Recepția medicamentelor este anulată pe perioada posibilei lor întârzieri în organism.

Ca antigen, se folosesc bacterii din tulpina Nichols, obținute dintr-o orhită sifilitică de iepure de 7-10 zile (inflamație testiculară). Perioada de la momentul inițierii reacției și până la înregistrarea rezultatelor acesteia durează 18-20 de ore, prin urmare, este necesar un mediu de supraviețuire pentru a menține viabilitatea și buna mobilitate a microorganismelor.

RIBT folosește complement de cobai. Pentru a obține complement, sângele trebuie luat în condiții sterile de la mai mulți cobai.

În caz de contaminare bacteriană, complementul este aruncat. Nu poate fi utilizat în reacția de imobilizare a treponemului palid al complementului conservat, tk. este toxic pentru microorganisme.

În reacția de imobilizare se folosește un exces de complement. Cantitatea sa depinde în mare măsură de mediul de supraviețuire pentru treponemul palid.

RIBT se pune în cutii sterile, iradiate în prealabil cu o lampă bactericidă de cuarț timp de 45-60 de minute. Fiecare ser de sânge este examinat în două eprubete: cu experientași Control. În ambele eprubete se adaugă serul de testat și antigenul în cantitățile necesare. Complementul activ este turnat în eprubetă și aceeași cantitate de ser de sânge inactivat de cobai este turnată în tubul de control. După umplere, conținutul tuburilor este amestecat prin agitare ușoară.

RIBT se desfășoară în condiții anaerobe. Eprubete cu ingrediente sunt plasate într-un microanaerostat, din care aerul atmosferic este aspirat de o pompă de vid și un amestec de gaz este injectat dintr-un cilindru (95 părți azot și 5 părți dioxid de carbon). Microanaerostatul cu eprubete se pune într-un termostat (35°C) timp de 18-20 ore.

Evaluarea rezultatelor RIBT se efectuează după îndepărtarea eprubetelor din termostat și microanaerostat (adică după 18-20 de ore de experiență). Cu o pipetă Pasteur, o picătură din conținutul eprubetei este aplicată pe o lamă de sticlă, care este acoperită cu o lamă și examinată în câmpul întunecat al unui microscop (obiectiv 40, ocular 10X). Mai multe câmpuri vizuale sunt examinate în diferite părți ale preparatului, numărând numărul de treponeme palide mobile și imobile din fiecare. Numărarea începe cu medicamentul de la control și apoi din eprubetă.

La stabilirea reacției se folosesc 5 studii de control: cu seruri sanguine evident pozitive și negative, cu complement activ și inactivat și mediu de supraviețuire pentru treponemul palid. Serul sanguin de control negativ este utilizat pentru a evalua gradul de mobilitate al treponemului palid în acest experiment. Ser de sânge de control pozitiv - pentru a evalua gradul de activitate imobilizantă în condițiile acestui experiment. Studiul complementului activ și inactivat și al mediului este efectuat pentru a determina efectul acestora asupra mobilității treponemului palid.

Cu o lipsă de complement în experiment, anticorpii de imobilizare nu își arată activitatea în mod corespunzător și treponeamele rămân mobile. Prin urmare, după experiment, se efectuează determinarea complementului rezidual pentru a evalua dacă mobilitatea treponemelor palide în eprubete s-a datorat lipsei de complement. Pentru aceasta, se folosește un sistem hemolitic - un amestec dintr-o suspensie de eritrocite de berbec și ser hemolitic diluat păstrat într-un termostat.

Complementul rezidual se determină prin adăugarea sistemului hemolitic în volumul necesar în fiecare tub. Tuburile sunt plasate într-un termostat la 37° timp de 45 de minute. În eprubetele experimentale ar trebui să apară hemoliza eritrocitelor, în eprubetele de control ar trebui să existe o întârziere a hemolizei. Absența hemolizei în eprubete indică o cantitate insuficientă de complement, în aceste cazuri studiul trebuie repetat. Examinarea repetată a serului sanguin nu se efectuează numai dacă se constată imobilizarea 100% a treponeamelor palide.

4. Contabilitatea rezultatelor RIBT

Treponemele imobilizate sunt numărate la microscop folosind microscopie în câmp întunecat. Cercetătorului i se cere să aibă abilitățile de a evalua mișcarea treponemelor. Ar trebui să fie atent la intensitatea mișcărilor făcute de treponemul palid. La această bacterie, nu este întotdeauna posibil să se observe contracții în formă de undă și mișcări de flexie, uneori doar de rotație. De asemenea, ar trebui să puteți distinge mișcările active ale treponemelor de mișcarea cu flux de fluid.

Pentru a evalua rezultatele reacției, se calculează procentul de imobilizare a treponeamelor palide, adică raportul dintre treponeamele mobile și imobile din experiment (cu complement activ) și control (cu complement inactiv) conform formulei:

X \u003d (M - C) × 100 / M

unde M este numărul de treponeme mobile din martor; C - numărul de treponeme mobile din experiment; X - % imobilizare. În munca practică, procentul de imobilizare se determină conform unui tabel prealcătuit folosind formula de mai sus.

Reacția de imobilizare a treponemului palid este estimată ca

• pozitivîn timpul imobilizării 51 - 100% treponem,
• slab pozitiv: 31 - 50% treponeame imobile,
• îndoielnic: 21 - 30% treponeame imobile,
• negativ: 0 - 20% treponeame imobile.

Reacția de imobilizare a treponemului palid devine pozitivă la sfârșitul primarului - începutul perioadei secundare de sifilis (din săptămâna 7-8 din momentul infecției și nu numai). În același timp, RIBT este de puțin folos pentru diagnosticarea stadiilor incipiente ale sifilisului, deoarece anticorpii care imobilizează treponemul palid și sunt determinați în reacție apar la numai 3-6 săptămâni de la infecție. Anticorpii-imobilizinele aparțin clasei de imunoglobuline IgG. Ele apar în sânge mai târziu decât reaginele (anticorpi anticardiolipin), mai târziu decât anticorpii fluoresceină (se detectează RIF și ELISA) și precipitinele (se detectează RMP).

În viitor, RIBT rămâne pozitiv. Există o sensibilitate ridicată a reacției în formele târzii de sifilis. Cu sifilis secundar, tardiv, neurosifilis, sifilis congenital, un rezultat pozitiv RIBT este înregistrat în 95-100% din cazuri. Cu sifilisul terțiar, cu leziuni specifice organelor interne, sistemul nervos, când RV este adesea negativ, RIBT dă rezultate pozitive în 98-100% din cazuri.

RIBT a fost mult timp recunoscut ca cel mai specific test pentru sifilis. Conform literaturii de specialitate, specificitatea RIBT este de 99%, sensibilitatea variază de la 79 la 94%. Potrivit TsNIKVI, sensibilitatea RIBT (în total, pentru toate stadiile de sifilis) este de 87,7%.

7. Domeniul de aplicare al metodei

Domeniul de aplicare al RIBT se restrânge treptat din cauza duratei de stabilire, a costurilor ridicate și a intensității forței de muncă. RIBT este o analiză destul de complexă și costisitoare care necesită personal înalt calificat și prezența unui vivarium. În acest sens, utilizarea acestei metode în ultimii ani a fost semnificativ redusă. În SUA, acest test este utilizat în prezent doar în laboratoarele de cercetare.

Pe baza complexității și a costului ridicat al RIF și RIBT, este logic să le folosiți pentru diagnosticarea formelor tardive și latente de sifilis. RIBT își păstrează poziția de „arbitru de reacție” în diagnosticul diferențial al formelor latente precoce de sifilis și a rezultatelor fals pozitive. Această reacție poate fi utilă în diagnosticarea neurosifilisului și atunci când alte teste serologice sunt inconsistente.

RIBT devine pozitiv mult mai târziu decât RIF și RV. Prin urmare, nu este utilizat pentru a diagnostica formele infecțioase de sifilis.

RIBT, ca și RIF, este foarte lent negativ în procesul de terapie antisifilitică. Ca urmare, este nepotrivit pentru monitorizarea progresului terapiei antisifilitice.

Rezultatele fals-pozitive (FPR) în RIBT sunt rare și au fost observate în principal într-un număr de treponematoze (yaw, pinta, bejel), care nu se găsesc în Rusia, precum și în lepră, sarcoidoză, LES, tuberculoză, ciroză de ficatul și câteva alte boli rare de natură non-sifilitică. Odată cu vârsta pacienților, numărul de rezultate fals pozitive ale RIBT crește.

RIBT se poate dovedi a fi fals pozitiv dacă serul de testat conține substanțe treponemicide (de exemplu, peniciline, tetracicline, eritromicină) care provoacă imobilizarea nespecifică a treponemului palid.Acest lucru se poate datora pacientului care ia antibiotice treponemocide, prin urmare, examinarea nu este efectuate la persoanele care au primit antibiotice în ultima lună. Sângele pentru RIBT poate fi examinat nu mai devreme de 2 săptămâni după terminarea antibioticelor și a altor medicamente antisifilitice.

9. Modificări ale reacţiei de imobilizare a treponeamelor palide

Pe lângă tehnica microanaerostatică, există o setare de amestec a RIBT conform N.M. Ovchinnikov. Condițiile anaerobe în timpul formulării reacției sunt create prin plasarea amestecului de reacție într-un melanger (mixer de leucocite), ambele capete sunt închise cu un inel de cauciuc. Tehnica de reacție melange face posibilă renunțarea la o pompă de vid, un cilindru cu un amestec de azot și dioxid de carbon și un microanaerostat. Într-un studiu comparativ pe un material clinic mare, s-au obținut rezultate care nu sunt inferioare tehnicii anaerostatice clasice.

10. Caracteristici, avantaje și dezavantaje ale RIBT

RIBT este o metodă de diagnosticare complexă și costisitoare din punct de vedere tehnic. Tehnologia necesită fonduri semnificative pentru întreținerea iepurilor și testare. Acest test consumator de timp este utilizat în prezent în principal în scopuri științifice. În majoritatea țărilor străine, de aproape 40 de ani, RIBT a fost utilizat practic nu în scopuri de diagnostic, ci doar în activități de cercetare.

Dezavantaje ale reacției:

• RIBT necesită lucru cu treponema pallidum patogen viu din tulpina Nichols, care rămâne infecțioasă pentru oameni, în ciuda adaptării la iepuri
• reacția este complexă, consumatoare de timp și costisitoare
• este necesar un vivarium
• este necesar personal cu înaltă calificare pentru a stabili reacția, a înregistra rezultatele și a menține vivariumul
• subiectivitatea evaluării rezultatelor
• lipsa automatizării
• nu există nicio modalitate de a standardiza această metodă serologică.
• reacția nu este aplicabilă pe fondul terapiei antisifilitice în curs
• incapacitatea de a utiliza pentru a controla vindecarea. RIBT la pacienții cu sifilis poate rămâne pozitiv pentru mulți ani (și chiar pentru viață), în ciuda tratamentului complet primit.
• reacția poate da rezultate fals pozitive la pacienții cu tumori maligne, diabet, lepră, boli autoimune, pneumonie, patologie cardiovasculară severă.

Avantajele RIBT sunt:

1) Sensibilitate suficient de mare;

2) Specificitate ridicată.

RIF (reacție de imunofluorescență)

Reacția de imunofluorescență (RIF) este o metodă de diagnosticare expresă pentru detectarea antigenelor microbiene sau detectarea anticorpilor. Testele bazate pe detectarea unui semnal fluorescent sunt considerate printre cele mai bune teste pentru sifilis.

1. Istoricul metodei

Anticorpul treponemal fluorescent (FTA) a fost dezvoltat pentru prima dată în 1957 de Deacon și colab.(Deacon, Falcone și Harris).

2. Principiul metodei

Metoda RIF se bazează pe faptul că antigenele tisulare sau microbii tratați cu ser imun cu anticorpi marcați cu fluorocromi pot străluci în razele UV ale unui microscop fluorescent. Bacteriile într-un frotiu, tratate cu un astfel de ser luminiscent, strălucesc de-a lungul periferiei celulei sub forma unui chenar verde

Ca antigen în RIF, se folosește o suspensie de treponeme palide patogene vii ale tulpinii Nichols din orhită de iepure, care se usucă pe o lamă de sticlă și se fixează cu acetonă. Serul sanguin al pacientului se adaugă la treponeamele palide uscate și fixate cu acetonă pe sticlă.

După spălare, preparatul este tratat cu ser care conține anticorpi împotriva imunoglobulinelor umane marcate cu fluoresceină. Din nou, preparatul este spălat și privit la microscop fluorescent. Dacă serul de testat conține anticorpi anti-fluoresceină treponemică, se va observa o strălucire galben-verde a treponemelor.

3. Metoda de realizare a cercetării prin metoda RIF

Antigenul fixat pe lama de sticlă (treponema pallidum patogen) este procesat de serul de testat. După spălare, preparatul este tratat cu ser fluorescent anti-imunoglobulină umană marcat cu fluorocrom. În acest caz, complexul fluorescent rezultat (globulină anti-umană + tioizocianat de fluoresceină) se leagă de globulina umană de pe suprafața treponemului palid, oferind o strălucire a treponemului pal la microscop fluorescent.

Pentru detectarea complexelor antigen-anticorp se utilizează ser luminescent, reprezentând imunoglobuline anti-specie (anti-umane) conjugate cu FITC. Prezența anticorpilor la treponeame în ser este determinată de strălucirea treponemelor atunci când sunt examinate la microscop fluorescent. Testul se efectuează în versiuni calitative și semi-cantitative.

4. Contabilitatea rezultatelor

Vizualizarea rezultatelor RIF se realizează folosind un microscop fluorescent. Rezultatele sunt evaluate prin gradul de luminescență al treponemelor din preparat. În prezența anticorpilor, strălucirea treponemelor este vizibilă, dar dacă nu au existat anticorpi antitreponemici în ser, atunci treponeamele nu sunt vizibile. Gradul de luminescență al treponemului pal uscat fixat pe sticlă este indicat în „plusuri” (de la „–” la „++++”). Rezultat negativ - fără strălucire sau nivel de fundal - 1+.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să se folosească

Reacția de imunofluorescență (RIF) este destul de sensibilă în toate etapele infecției, de la sfârșitul perioadei de incubație până la sifilisul târziu. Perioada primară de sifilis în cursul clasic începe la 3-4 săptămâni după infecție. RIF devine pozitiv în primele zile ale perioadei primare sau chiar la sfârşitul perioadei de incubaţie, din a 3-a săptămână după infectare. Rezultatele RIF rămân pozitive în toate perioadele, inclusiv în formele tardive.

RIF devine pozitiv ceva mai devreme decât RW. Potrivit unor rapoarte, RIF pozitiv apare la 80% dintre pacienții cu sifilis seronegativ primar. În perioada secundară, RIF este pozitiv în aproape 100% din cazuri. Este întotdeauna pozitiv în sifilisul latent și dă rezultate pozitive de 95-100% în formele tardive ale bolii și sifilisul congenital.

6. Sensibilitate și specificitate

Reacția de imunofluorescență (RIF) este un grup de metode cu sensibilitate și specificitate ridicate. RIF este sensibil în toate etapele infecției, de la perioada de incubație până la sifilisul târziu. Potrivit OMS, sensibilitatea RIF în sifilisul primar este de 70-100%, în sifilisul secundar și tardiv - 96-100%, specificitatea - 94-100%. Potrivit TsNIKVI, sensibilitatea RIF în toate formele de sifilis este de 99,1%.

Specificitatea RIF poate fi crescută prin pretratarea serului de testat cu un sorbent - antigen treponemic ultrasonizat care leagă anticorpii de grup (RIF-abs).

7. Domeniul de aplicare al metodei

RIF se aplică:

• ca reacție de confirmare în sifilisul precoce, latent
• pentru diagnostic retrospectiv
• pentru diferențierea formelor latente de sifilis și rezultatele fals-pozitive ale cercetărilor asupra sifilisului.
• ca test de confirmare pentru neurosifilis.

RIF este utilizat pe scară largă ca test de confirmare, dar nu este destinat utilizării de rutină sau screening-ului, deoarece este dificil de configurat din punct de vedere tehnic. Pentru a efectua RIF, este necesar să aveți un vivarium sau să cumpărați o suspensie de treponeame palide patogene, ceea ce limitează posibilitatea unei reacții. Cu toate acestea, în ultimii ani, pe piața internă au început să apară sisteme de testare, permițând efectuarea reacției în absența unui vivarium și a propriei tulpini de laborator de treponema pallidum patogen.

8. Surse și cauze ale erorilor de punere în scenă, fals pozitive și fals negative

LPR la setarea RIF sunt rare (cu colagenoze, borrelioza).

RIF este încă considerat unul dintre cele mai bune teste pentru sifilis, „standardul de aur” al serodiagnosticului. RIF în comparație cu RIBT este mai ușor de configurat,

În ciuda valorii diagnostice ridicate, necesitatea utilizării T. pallidum viu, costul ridicat și durata studiului împiedică introducerea pe scară largă a RIF în practica de zi cu zi. Configurarea reacției este laborioasă. În plus, evaluarea rezultatelor RIF este subiectivă.

Avantajele RIFși RIBT sunt:

1) Sensibilitate ridicată (în special pentru RIF);

2) Specificitate ridicată (în special pentru RIBT).

Dezavantajele RIFși RIBT:

1) Complexitate tehnică, cost ridicat al metodelor.

2) Evaluarea subiectivă a rezultatelor, lipsa automatizării;

3) RIF și RIBT la pacienții cu sifilis pot rămâne pozitive mulți ani (și chiar pe viață), în ciuda tratamentului complet primit. Prin urmare, aceste reacții nu pot fi folosite pentru a controla vindecarea.

10. Modificări de metodă

În practică, pentru serodiagnosticul sifilisului, sunt utilizate și au fost utilizate câteva modificări ale reacției de imunofluorescență:

• RIF-abs- cea mai sensibilă metodă de serodiagnostic a sifilisului, devine pozitivă mai devreme decât alte reacții (din a 3-a săptămână de la infectare);
• RIF-200(serul pacientului se diluează de 200 de ori la prezentare) este o metodă foarte specifică pentru serodiagnosticul sifilisului.
• RIF-10(diluția de 10 ori a serului de testat) - o metodă mai sensibilă decât RIF-200.
• RIF-ts efectuat cu lichior.
• RIF-abs-IgM- depistarea precoce a anticorpilor antitreponemici din clasa IgM.

1. Cea mai răspândită modificare RIF-abs- reacție de imunofluorescență cu absorbție. Înainte de a stabili reacția, serul subiectului este epuizat cu un amestec de treponeame nepatogene pentru a exclude reacțiile încrucișate. Anticorpii de grup sunt îndepărtați din serul studiat folosind treponeame culturale distruse de ultrasunete, ceea ce crește semnificativ specificitatea reacției. Deoarece serul de testare este utilizat într-o diluție de 1:5, RIF-abs este foarte sensibil.

Principalele indicații pentru utilizarea RIF-abs în practica clinică sunt:

• diagnosticul formelor latente și tardive de sifilis,
• detectarea rezultatelor fals pozitive ale CSR și RMP, în special la pacientele gravide și somatice cu suspiciune de sifilis;
• pentru a stabili un diagnostic retrospectiv al bolii.

RIF-abs nu este foarte informativ în evaluarea rezultatelor tratamentului: la 85% dintre pacienții care au primit terapie antisifilitică adecvată, rezultatele pozitive ale RIF persistă mulți ani.

Această reacție este numită „standardul de aur” pentru serodiagnosticul sifilisului. Este folosit pentru cazuri de arbitraj, dar este necesară o suspensie concentrată proaspătă de tulpina Nichols de T. pallidum din orhită de 7 zile la un iepure pentru un rezultat fiabil, care nu trebuie înghețat.

2. În URSS a fost instalat în două versiuni - RIF-10și RIF-200, adică cu o diluție a serului de testat de 10 și 200 de ori. RIF-200 - serul de testat este diluat de 200 de ori pentru a reduce numărul de rezultate fals pozitive. Acest lucru oferă o specificitate ridicată a reacției, dar sensibilitatea acesteia scade oarecum. RIF-10 este mai sensibil, dar mai des dă rezultate pozitive nespecifice, decât RIF-200, care se caracterizează printr-o specificitate ridicată. RIF-10 este mai sensibil, RIF-200 și RIF-abs sunt mai specifice.

Sensibilitatea RIF-200 și RIF-abs este estimată la 84–99%, iar specificitatea este de 97–99%.

3. RIF-ts efectuat cu lichior. Reacția este setată folosind lichidul cefalorahidian întreg pentru a identifica leziuni specifice ale SNC.

4. Reacție RIF-abs-IgM propus pentru detectarea precoce a anticorpilor antitreponemici din clasa IgM. Această reacție poate fi utilizată pentru a diagnostica sifilisul congenital, formele precoce de sifilis și pentru a diferenția între cazurile de reinfecție și serorelapse.

Sunt cunoscute două modificări ale acestei reacții:

– FTA-ABS-IgM, bazat pe utilizarea unui conjugat anti-IgM (anticorpi marcați cu fluoresceină împotriva IgM umană) în faza a doua a reacției în locul globulinei fluorescente anti-umane;

- versiunea rusă a RIF-abs-IgM, caracterizată prin aceea că se adaugă un sorbent în serul sanguin de testat, eliminând anticorpii IgG, iar RIF-abs este plasat cu anticorpii IgM rămași.

Principalele indicații la formularea RIF-abs-IgM sunt:

- serodiagnosticul sifilisului congenital în absența manifestărilor manifeste ale sifilisului congenital pe piele și mucoase la copil;

- diagnostic diferențial de reinfecție și recidivă clinico-serologică sau serologică a sifilisului, în care RIF-abs-IgM va fi negativ, iar RIF-abs - pozitiv;

- evaluarea eficacității terapiei pentru sifilisul dobândit precoce sau congenital: după un tratament adecvat, RIF-abs-IgM devine negativ în următoarele 3-6 luni.

Această reacție poate fi utilizată pentru a detecta sifilisul congenital. Se știe că moleculele mari de IgM nu pot trece printr-o placentă sănătoasă. Prin urmare, anticorpii de clasa M împotriva treponemului pallidum pot apărea în corpul copilului fie din cauza unei încălcări a funcției de barieră a placentei, fie sunt produși de corpul unui copil cu sifilis. Anticorpii din clasa IgM apar în sângele unui pacient cu sifilis deja în primele săptămâni de boală, iar anticorpii din clasa IgG apar mai târziu. Determinarea separată a anticorpilor ambelor clase este extrem de utilă în diagnosticul sifilisului congenital la copii, deoarece prezența anticorpilor din clasa IgM la un copil în prima lună de viață va indica faptul că aceștia sunt formați de corpul unui copil cu sifilis, în timp ce detectarea numai a anticorpilor IgG va indica maternă originea acestora din urmă.

Declarația reacției 19S(IgM)-RIF-abs implică separarea preliminară prin filtrare pe gel a moleculelor mai mari de IgM 19S din

fracțiuni de molecule mai mici de IgG 7S. Studiu suplimentar în reacția RIF-abs a serului sanguin care conține doar fracția IgM 19S,

elimină toate sursele posibile de erori. Dar tehnica de stabilire a acestei reacții este complexă și consumatoare de timp, necesită echipamente speciale și pregătire a specialiștilor.

Reacție de adeziune imună (RIP, TPIA - imunoaderență Treponema pallida).

Această reacție se bazează pe utilizarea unui fenomen descris de Rieckenberg în 1912. RIP se bazează pe faptul că treponeamele tisulare virulente, sensibilizate de serul unui pacient cu sifilis, aderă la suprafața eritrocitelor în prezența complementului și a eritrocitelor și, în timpul centrifugării, sunt transportate cu ele în sediment, dispărând din supernatantul.

Pentru stabilirea reacției se folosesc următoarele ingrediente: ser de testare, antigen, complement, eritrocite donatoare, soluție izotonică de clorură de sodiu. Ca antigen, se folosește o suspensie de treponem pal al tulpinii Nichols.

Cel mai larg în legătură cu serodiagnosticul sifilisului, acest test a fost studiat de autori interni și străini în anii 50-60. Datele despre valoarea RIP ca test de diagnosticare au fost contradictorii. Reacția a necesitat acuratețe maximă, deoarece cu turnarea incorectă a ingredientelor, cu un exces sau o deficiență a materialului de testat în preparat, s-au obținut rezultate nesigure.

În Rusia, cercetări ample au fost efectuate de L.V. Sazonova, care a obținut rezultate similare în RIP și RIT folosind o suspensie proaspăt preparată de treponeme palide patogenice ale tulpinii Nichols. Cu toate acestea, utilizarea unui antigen încălzit sau conservat cu fenol a distorsionat brusc rezultatele reacției și a făcut antigenul instabil. Recomandați acest test pentru a înlocui RIT L.V. Sazonova a considerat că era imposibil.

G.P. Avdeeva, folosind alte regimuri de temperatură și timp în prepararea antigenului, a obținut rezultate diferite în studiul RIP. Potrivit ei, sensibilitatea acestei reacții este mai mare decât sensibilitatea KCP și RIT, dar oarecum inferioară RIF, iar specificitatea RIP, RIT și RIF este apropiată.

Cu toate acestea, lipsa eliberării de producție a antigenului pentru RIP nu a permis un studiu mai larg al acestui test și introducerea lui în practică.

Reacția RPHA de hemaglutinare pasivă

Reacția de hemaglutinare pasivă (RPHA) este un test serologic comun care este ferm înrădăcinat în practica de laborator. are un nivel destul de ridicat de eficiență în studiu.

1. Istoricul metodei RPHA

Pentru prima dată, G.Blumental și W.Bachman (1932) au raportat despre utilizarea RPHA pentru diagnosticarea sifilisului. În 1965, a fost propusă o reacție de hemaglutinare indirectă sau pasivă pentru diagnosticul de sifilis. Modificarea reacției folosind diferite antigene a fost raportată de T. Ratlev în 1965 - 1967. Micromodificarea RPGA a fost propusă de Sokh R.M. și co-autori în 1969. Primul sistem de testare comercial a fost dezvoltat de oamenii de știință japonezi Tomisava et. al. în 1969

2. Principiul metodei RPGA

Dintr-o suspensie omogenă preparată de eritrocite „încărcate” cu antigene, când se adaugă serul de testare care conține anticorpi, precipită un precipitat sub formă de fulgi. Precipitatul rezultat este format din eritrocite „lipite” de anticorpi, și se numește "hemaglutinat". O suspensie de eritrocite este pregătită în prealabil și furnizată ca parte a sistemelor de testare de diagnosticare.

Procesul de lipire a globulelor roșii, pe suprafața cărora sunt prezenți antigeni, se numește „hemaglutinare”. Legătura are loc sub acțiunea anticorpilor specifici (aglutininele). Reacția se numește "pasiv", deoarece antigenele proprii ale eritrocitelor nu reacţionează, iar eritrocitele însele îndeplinesc o funcţie indicator exclusiv auxiliar.

Reacția de hemaglutinare pasivă (indirectă) este un tip de reacție de aglutinare în care eritrocitele (din greacă háima - sânge) sunt folosite ca purtători de antigene, și nu alte particule. În general, în reacția de aglutinare sub acțiunea anticorpilor, microbii sau alte celule se lipesc și precipită - nu neapărat eritrocite, ci, de exemplu, particule de latex, bacterii sau alte particule corpusculare purtătoare de antigen.

În reacția de hemaglutinare pasivă pentru diagnosticul de sifilis, eritrocitele de berbec sau de pasăre acoperite cu antigene palide de treponemă sunt utilizate ca antigen. Când se adaugă ser care conține anticorpi specifici, eritrocitele se lipesc între ele (aglutinare).

Reacția RPHA este denumită metode imunologice, deoarece. se bazează pe interacțiunea specifică a antigenului treponemului pallidum patogen cu un anticorp. În conformitate cu „teoria rețelei”, aglutinarea este rezultatul „reticulare” moleculelor de antigen de suprafață cu moleculele de anticorpi (imunoglobuline).

3. Enunțul reacției de hemaglutinare pasivă

RPHA se pune în tablete de plastic sau în eprubete cu diluții din serul sanguin al pacientului, la care se adaugă un diagnostic eritrocitar.

Procesul de combinare a unui antigen cu eritrocite se numește sensibilizare, iar antigenul corpuscular artificial obținut în acest fel se numește eritrocite sensibilizate. Diagnosticele eritrocitelor se numesc eritrocite sensibilizate de un antigen.

Pentru pregătirea diagnosticului se folosesc eritrocite de berbec sau de pasăre (de obicei pui) tratate mai întâi cu formol și apoi cu tanin, care sunt sensibilizate cu antigenul ultrasunete al treponema pallidum patogen (tulpina Nichols) sau proteine ​​recombinate treponema pallidum (TpN15, TpN17, TpN47). Pot fi utilizate și eritrocitele de oaie sensibilizate cu antigen ultrasonic al treponemului pallidum de cultură.

Numai ser (nu utilizați plasmă). Probele hemolizate și tulburi nu sunt potrivite. Eritrocitele nesensibilizate servesc drept control negativ (pentru a exclude prezența anticorpilor anti-eritrocitari). În fiecare serie de producții utilizați controale pozitive și negative.

Probele de ser sanguin studiat și eritrocite de testare sunt introduse în godeurile (celulele) tabletei imunologice. Dacă serul sanguin al pacientului conține anticorpi anti-treponemici specifici, atunci când serul de testat este adăugat în godeul cu antigenul, se formează complexe antigen-anticorp care sunt asociate cu suprafața purtătorilor (eritrocite). Vizual, acest lucru se manifestă prin lipirea globulelor roșii, adică hemaglutinarea, care este vizibilă cu ochiul liber. Complexele imune „anticorp-antigen-eritrocit”, care coboară treptat sub influența gravitației, sunt distribuite pe întreaga suprafață a fundului puțului și formează o imagine caracteristică a unei „umbrele inversate”.

În funcție de cantitatea de anticorpi conținută în proba de testat, imaginea „umbrelă inversată” variază de la maxim, ocupând întreaga suprafață a fundului puțului, până la o zonă mică în partea centrală, cea mai de jos a acesteia (cu iluminare în centrul şi formarea unui inel mai intens de eritrocite aşezate de-a lungul periferiei).

Complexele imune nu se formează dacă nu există anticorpi specifici în probă sau când la reacție se adaugă eritrocite de control (intacte). În același timp, eritrocitele se adună treptat în punctul cel mai de jos al fundului puțului, formând o figură sub forma unui punct compact sau „buton”, uneori cu o ușoară iluminare în centru.

Dacă serul de sânge uman conține anticorpi anti-eritrocitari, atunci se va forma „umbrela” în orice caz - atât în ​​reacție cu eritrocitele de testare, cât și cu eritrocitele de control. În acest caz, se recomandă alte tehnologii medicale pentru detectarea anticorpilor antitreponemici specifici.

Este posibil fenomenul prozonei (imposibilitatea reacției din cauza excesului de anticorpi), care se elimină prin diluarea serului.

4. Contabilizarea rezultatelor reacției de hemaglutinare pasivă

Rezultatele RPGA sunt luate în considerare vizual după 60-120 de minute la configurarea micrometodei și după 2-4 ore sau a doua zi la configurarea macrovariantei. Când se utilizează eritrocite de păsări mai mari (nucleate), se obține o imagine mai clară, iar rezultatele sunt înregistrate la o dată mai devreme.

Este posibil să se determine titrul (titru ridicat TPHA ≥ 1:2 560).

Rezultatele studiului sunt evaluate conform sistemului 4+ (de la „-” la „++++”) în funcție de dimensiunea filmului format. Când are loc aglutinarea, eritrocitele sunt situate pe suprafața sondei sub forma unei „umbrele”, iar cu un rezultat negativ, eritrocitele alunecă liber în jos și se acumulează pe fundul în centrul sondei sub forma unui „buton”. ".

Evaluarea general acceptată a rezultatelor RPGA:

4+ - RPHA pozitiv. Eritrocitele aglutinate sub formă de „umbrelă” aliniază uniform întreaga suprafață a găurii;

3+ - RPHA pozitiv. Eritrocitele căptușesc întreaga suprafață a găurii, dar unele dintre ele „alunecă” spre centru. În același timp, se formează un inel vizibil de-a lungul periferiei depozitului;

2+ - RPHA slab pozitiv. Eritrocitele formează un film pe o zonă mică a părții inferioare a puțului, formând un inel dens de sediment eritrocitar cu o iluminare vizibilă în centru;

1+ - RPHA nedeterminat, eritrocitele formează un sediment liber la fundul puțului cu margini neclare și un lumen ușor în centru;

(–) - RPHA negativ, toate eritrocitele se află în fundul puțului sub formă de sediment compact („butoane” sau inele) pe un fundal înconjurător curat (fără sedimentare granulară înconjurătoare).

În practica străină, rezultatele RPGA sunt evaluate și ca reactive (în cazul formării de aglutinați), slab reactive (dacă formațiunile sunt nesemnificative) și nereactive (dacă nu se observă aglutinarea).

Contabilitatea rezultatelor reacției se poate face automat folosind analizoare speciale. Pe lângă un studiu calitativ, toate sistemele de testare asigură o analiză cantitativă cu determinarea titrului.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să utilizați RPHA

RPHA devine pozitiv la mijlocul perioadei primare (7-8 săptămâni din momentul infecției, 3-4 săptămâni după apariția unui șancru dur) și rămâne pozitiv ani de zile după tratament.

Cu un nivel foarte ridicat de anticorpi împotriva treponemului în serul studiat (care este cel mai caracteristic sifilisului secundar), este posibil un rezultat fals negativ al TPHA (așa-numitul fenomen „prozonă”).

Anticorpii specifici de aglutinină sunt detectați în sângele persoanelor care au sifilis de mult timp, astfel încât RPGA nu poate fi recomandată pentru diagnosticul diferențial de reinfecție sau pentru determinarea severității procesului infecțios.

RPGA nu este folosit pentru a controla vindecarea, deoarece. poate rămâne pozitiv la mulți ani după recuperare. În același timp, poate fi utilizat ca metodă suplimentară (la RMP sau RPR) în monitorizarea eficacității tratamentului, investigând dinamica scăderii titrurilor de anticorpi. O condiție prealabilă pentru aceasta este utilizarea aceluiași sistem de testare RPGA ca la prima examinare (înainte de tratament) a pacientului, precum și studiul în același laborator.

6. Sensibilitatea și specificitatea RPHA

RPHA este considerat un test foarte sensibil și specific. Această reacție este un test de diagnostic valoros în toate formele de sifilis, dar este deosebit de sensibilă în formele avansate ale bolii. Sensibilitatea RPHA variază în funcție de stadiul bolii. Cu sifilisul primar, sensibilitatea RPHA este de 76% (și mai mare), cu sifilisul secundar - până la 100%. Cu latentă precoce - 97%, cu sifilis tardiv - 94%, cu o specificitate de 98-100%. Sensibilitatea mai scăzută în formele proaspete ale bolii se datorează formării ulterioare a aglutininelor.

Potrivit instituției de stat „TsNIKVI Roszdrav”, sensibilitatea RPHA în diagnosticul diferitelor forme de sifilis a fost de 99,4%. Majoritatea cercetătorilor notează o specificitate de 98-99% a RPHA.

Din punct de vedere al sensibilității și specificității, RPHA nu este inferior, iar în formele tardive și sifilisul congenital, depășește chiar și RIF și RIBT.

7. Domeniul de aplicare al metodei RPGA

TPHA poate fi folosit atât ca test de screening, cât și de confirmare; poate fi utilizat într-o variantă semicantitativă cu calculul titrului de anticorpi. Au fost dezvoltate o metodă cantitativă pentru stabilirea RPHA, o micrometodă, precum și o reacție automată de microhemaglutinare.

8. Caracteristici, avantaje și dezavantaje ale RPGA

Conform literaturii de specialitate, RPGA a ocupat în mod constant o poziție de lider în practica clinică în majoritatea țărilor lumii. TPHA este cel mai utilizat test în clinicile ITS din străinătate.

Tehnica RPGA este usor de realizat, nu necesita echipament special: este nevoie doar de o placa de hemaglutinare pentru a o monta. Studiul nu durează mult; reacția este foarte sensibilă și specifică. Aprobarea metodei în practica clinică a arătat că este extrem de simplă, ieftină și sensibilă. La fel ca ELISA, RPHA este simplu de executat, nu necesită personal înalt calificat și echipamente speciale, iar automatizarea lui este posibilă.

Avantajele testului RPGA:

• ușor de configurat și interpretat,
• nu necesită echipament special,
• timp pentru a obține rezultatul - 45 de minute,
• adecvat pentru screening-ul în masă (este necesar doar 25 µl de ser la o diluție de 1:20),
• grad ridicat de standardizare,
• prezența controalelor interne,
• termen lung de valabilitate
• pret acceptabil
• posibilitatea automatizării contabilităţii.

De asemenea, trebuie remarcate dezavantajele RPGA:

• posibilitatea unor reacții nespecifice în prezența anticorpilor anti-eritrocitari,
• lipsa corelației dintre titrul și stadiul sifilisului,
• reacție pozitivă ulterioară în stadiile incipiente ale sifilisului,
• posibilitatea unor reacții fals pozitive la persoanele care au consumat alcool, dependenți de droguri,
• sensibilitate la vibrații și temperatură în laborator.

Avantajele RPGA în comparație cu RIBT și RIF sunt:

• utilizarea sistemelor de testare industriale,
• posibilitatea de automatizare a reacției,
• nu este nevoie să lucrați cu treponem palid viu,
• elimină necesitatea unui vivarium.

9. Surse și cauze ale erorilor în setarea RPHA, rezultate fals pozitive și fals negative

Reacția de hemaglutinare pasivă este un studiu relativ simplu; atunci când se efectuează, este necesar să se respecte toate recomandările producătorilor de diagnostic și regulile de lucru în laboratorul de diagnostic clinic. Greșelile făcute pot duce la apariția și înregistrarea rezultatelor reacției atât fals-negative, cât și fals-pozitive. Rezultatele fals-pozitive ale RPGA se pot datora influenței factorului uman și factorilor biologici.

Se pot obține rezultate fals pozitive

• în studiul serurilor de sânge ale pacienților cu treponematoze non-venerice,
• din cauza factorului reumatoid
• datorită anticorpilor care reacţionează încrucişat cu antigenul treponemal, care se formează în timpul diferitelor tulburări metabolice sistemice sau induse de medicamente sau induse de medicamente,
• din cauza nivelurilor anormale de imunoglobuline;
• la nou-născuți - datorită formării în organism a fătului sau a copilului de anticorpi IgM la IgG mamei, ceea ce complică interpretarea rezultatelor și diagnosticul de sifilis congenital.

Erori cauzate de influența factorului de participare umană asupra studiului:

• microplăci contaminate
• pipetare incorectă
• vibratii in laborator
• temperatura aerului din laborator este în afara intervalului de temperatură: 18–25 grade

Cele mai tipice erori tehnice în setarea RPGA, care conduc la rezultate nesigure, includ:

• diluarea incorectă a ingredientelor,
• încălcarea temperaturii,
• încălcarea timpului de incubare a reactivilor,
• încălcarea condițiilor de aplicare a reactivilor pe tabletă,
• inconsecvența pH-ului soluțiilor cu cele necesare,
• contaminarea sticlei de laborator.

Următoarele puncte tehnice pot fi, de asemenea, o sursă de erori la configurarea RPGA:

• excluderea din formularea reacției serurilor de sânge de control;
• concentrația neuniformă a eritrocitelor în diagnosticul din cauza amestecării insuficiente înainte de utilizare;
• încălcarea termenilor și condițiilor de depozitare a eritrocitelor de diagnostic și control; utilizarea truselor expirate;
• utilizarea de eprubete contaminate, vârfuri de pipetă, pipete, plăci imunologice, soluții la stabilirea reacțiilor;
• inexactități în diluția inițială a unei probe de ser de sânge;
• minuțiozitate insuficientă în efectuarea dublelor diluții consecutive;
• nerespectarea regimului de temperatură și a timpului de incubație;
• prezența vibrațiilor străine și scuturarea plăcii imunologice în timpul incubației;
• încălcarea metodei de stabilire a RPGA, exprimată în refuzul de a efectua studiul cu eritrocite de control.

Utilizarea plasmei sanguine care conține anticoagulante capabile să provoace aglutinarea eritrocitară nespecifică (RPHA) poate duce la rezultate care nu pot fi interpretate.

Numărul de rezultate fals pozitive și fals negative este mai mic decât în ​​cazul altor teste serologice. LPR în cadrul RPHA sunt rare și posibile cu treponematoze (vici, bejel, halbă). De asemenea, s-au înregistrat rezultate fals pozitive (sub 1% în total) la dependenți de droguri, la pacienții cu mononucleoză infecțioasă, borrelioză, lepră, cu colagenoză, ciroză hepatică, limfosarcom, dar și la gravide.

Rezultatele fals negative ale reacției se pot datora competiției dintre anticorpii IgM și IgG. Rezultate fals negative sunt posibile și la pacienții infectați cu HIV.

10. Modificări ale metodei RPHA

Există modificări micro și macro ale setării RPGA, prima este mai des folosită din cauza economiei, a vitezei de setare și a luării în considerare a rezultatelor.

În plus, a fost dezvoltat un complex de diagnostic automat pentru analiza imaginilor, care a făcut posibilă efectuarea unei evaluări automate cantitative a rezultatelor și eliminarea subiectivității în interpretarea datelor obținute. Complexul hardware-software recunoaște imaginea, prelucrează datele și dă răspunsul în unități relative.

Cititoarele și analizoarele automate sunt, de asemenea, folosite pentru a automatiza înregistrarea rezultatelor RPGA.

TPPA (aglutinarea particulelor de Treponema pallidum) - un test de aglutinare a particulelor artificiale pentru a detecta anticorpii la Treponema pallidum

Scurtă descriere a testului TPPA

În prezent, o modificare a metodei de hemaglutinare pasivă - TPRA (Treponema pallidum particle agglutination) este, de asemenea, utilizată pentru diagnosticarea sifilisului, în care antigenul treponem pal este fixat pe particulele de gelatină. Deoarece particulele de polimer artificial nu au propriile antigene care determină activitatea biologică, atunci trusele pentru serodiagnosticul sifilisului bazate pe acestea au motive să fie considerate mai avansate. Utilizarea particulelor artificiale inerte biologic minimizează aglutinarea nespecifică întâlnită în mod obișnuit cu alți purtători.

TPPA este utilizat pentru diagnosticul serologic al anticorpilor la diferite tipuri și subspecii de treponeame patogene. Acest test poate fi utilizat pentru a detecta anticorpi la agenții cauzali ai sifilisului, halbă, bejel și iacă.

Procedura de studiu este foarte simplă și nu necesită echipament special - se folosesc microplăci standard în formă de „U”. Testul se bazează pe aglutinarea particulelor de gelatină sensibilizate cu antigeni T. pallidum, anticorpi găsiți în serul sanguin al pacientului.

TPPA este un test treponemic de confirmare care poate fi utilizat convenabil atât pentru un număr mic de specimene, cât și pentru screening-ul în masă. TPPA este utilizat în străinătate ca test de confirmare și pentru a înlocui testul de microhemaglutinare MHA-TP (testul de microhemaglutinare pentru anticorpi la T. pallidum).

Sensibilitatea testului TPPA este între 85% și 100%, în timp ce specificitatea este între 98% și 100%. Sensibilitatea TPPA pentru sifilisul primar este de 88%, pentru sifilisul secundar și latent tardiv 98%-100%.

Dacă TPPA este utilizat pentru a diagnostica sifilisul, anticorpii împotriva altor tipuri de treponem (cum ar fi T. pallidum endemicum, pertenue sau carateum) pot provoca rezultate fals pozitive. Există o serie de metode pentru a elimina acești anticorpi din probele de ser înainte de a începe testul.

Principiul testului TPPA

TPPA este o metodă de aglutinare pasivă a particulelor de gelatină din ser sau plasmă umană. Serul care conține anticorpi la treponemul patogen reacționează cu particulele de gelatină sensibilizate cu antigenul treponemului pal al tulpinii Nichols, supuse ultrasunetelor. Ca rezultat al reacției, în godeul plăcii de microtitrare se formează o peliculă netedă de particule de gelatină aglutinată.

Dacă anticorpii nu sunt prezenți, particulele se depun în fundul godeului plăcii, formând un „buton” compact de particule neaglutinate. Godeurile de control cu ​​particule de gelatină nesensibilizate ar trebui să prezinte, de asemenea, un astfel de „buton” compact pentru fiecare ser, adică fără aglutinare.

Aplicarea testului TPPA

TPPA este un test universal care poate fi utilizat la fel de cu succes atât în ​​examinarea preventivă obligatorie a grupurilor de populație pentru sifilis (screening), cât și în instituțiile dermatovenerologice specializate. Avantajul testului TPPA este sensibilitatea sa ridicată, care nu este inferioară testelor clasice, care până de curând erau „standardul de aur” pentru serodiagnosticul sifilisului. Alte avantaje ale testului includ reproductibilitatea ridicată, precum și simplitatea și viteza de stabilire a reacției.

Testul TPPA este utilizat pentru a confirma rezultatele pozitive ale testelor de screening non-treponemic pentru sifilis, cum ar fi testul VDRL, și pentru a evalua pacienții cu teste non-treponemice negative, dar care au semne sau simptome care sugerează sifilisul tardiv. Utilizarea TPPA ca singur test de screening pentru sifilis nu este recomandată.

În plus, testul de aglutinare TPPA poate fi utilizat pentru a examina probe de lichid cefalorahidian în diagnosticul de neurosifilis. În acest caz, ca și în cazul altor teste serologice, interpretarea rezultatelor trebuie efectuată cu combinația obligatorie cu alți indicatori și simptome ale bolii.

Rezultatele testului TPPA

Rezultatul este evaluat conform sistemului de „plusuri” - de la (-) la (2+). Rezultatele testului sunt vizibile cu ochiul liber și sunt interpretate după cum urmează:

Gradul de aglutinare	Scorul testului	Interpretare
Particulele aglutinate acoperă uniform fundul plăcii bine	2+	Pozitiv
Inel mare semnificativ, cu margini exterioare neuniforme și aglutinare periferică	1+	Pozitiv
Particulele formează un inel compact cu un gol în centru și neted frontiere externe	±	slab pozitiv
Particulele formează un inel compact în centrul puțului cu un spațiu ușor în centru și o limită exterioară netedă.	–	Negativ
Particulele formează un „buton” în centrul găurii cu o limită exterioară netedă	–	Negativ

Rezultatele sunt înregistrate pentru a determina conformitatea cu descrierea de mai sus. Probele care prezintă un rezultat nedeterminat (±) trebuie retestate. În cazul în care o probă arată un rezultat nedeterminat la mai multe teste TPPA, se recomandă efectuarea unui studiu folosind alte metode.

Rezultatele analizei nu trebuie luate în considerare izolat. De exemplu, într-un stadiu incipient al infecției, numărul de anticorpi este încă prea mic, drept urmare TPPA și multe alte metode nu sunt sensibile. Prin urmare, dacă se suspectează sifilis, chiar dacă rezultatele testelor sunt negative, probele trebuie reexaminate. Pentru a pune un diagnostic, este necesar să se țină cont de simptomele clinice pe care le are pacientul, istoricul clinic și alte date.

Ca și în testul TPHA, fenomenul prozonă și un rezultat fals negativ pot fi observate pentru TPPA dacă proba de ser conține un titru de anticorpi prea mare.

ELISA - ELISA

Testul imunoenzimatic (ELISA; Testul imunosorbent legat de enzime, ELISA) este una dintre numeroasele metode de diagnostic serologic al bolilor infecțioase. Imunotestul enzimatic (ELISA) în serodiagnosticul sifilisului este un test pentru anticorpi din clasele M, G și A (IgM, IgG, IgA) împotriva antigenelor treponemului palid. Este posibil să se efectueze ELISA cu lichidul cefalorahidian.

Introducerea testului imunosorbent legat de enzime (ELISA) în practică în locul reacției Wasserman și a altor teste cardiolipină a îmbunătățit semnificativ calitatea diagnosticului de laborator al sifilisului. Un avantaj semnificativ al acestei metode este posibilitatea de automatizare a procesului de cercetare, ceea ce reduce influența factorului uman.

1. Istoricul metodei ELISA

Principiile de bază ale imunotestării enzimatice pe suprafața unui purtător în fază solidă au fost dezvoltate de E. Engvar și colab. (1971), B.Van Weeman și A.Schuurs (1971). Imunotestul enzimatic pe care l-au dezvoltat a fost propus pentru prima dată pentru diagnosticul de sifilis în 1975 de către J. Veldkamp și A. Visser, care au apreciat potențialul acestui test automat. ELISA a început să fie utilizat pe scară largă în diagnosticul sifilisului în anii 1980, când au fost dezvoltate și certificate teste de diagnostic, iar metodele de testare au fost standardizate. În URSS, tehnica ELISA pentru diagnosticarea sifilisului a fost dezvoltată de V.N. Bednova, A.V. Babiy și A.V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. Principiul metodei ELISA

Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) conform mecanismului de reacție este aproape de RIF (sunt detectați aceiași anticorpi). Reacția imunologică enzimatică este clasificată ca o reacție imunologică bazată pe interacțiunea foarte specifică a antigenilor treponema pallidum cu anticorpii unui pacient cu sifilis.

În practica sifilidologică, se utilizează în principal o variantă indirectă a ELISA. Principiul celei mai frecvent utilizate variante de reacție indirectă este următorul. Pe suprafața godeurilor unei plăci de polistiren sunt fixate complexe imune, care se formează în timpul interacțiunii anticorpilor unui pacient cu sifilis cu antigenele treponemului palid. După aceea, ele sunt detectate într-o reacție de culoare utilizând conjugați specifici și aditivi substrat-cromogeni adecvați.

Procedura de efectuare a testului este următoarea: serul pacientului este plasat pe un purtător în fază solidă cu un antigen atașat. În prezența anticorpilor în el, pe suprafața purtătorului se formează un complex antigen-anticorp. Pentru a „manifesta” rezultatele reacției, se folosesc anticorpi anti-specie la Ig umană conjugați cu markeri enzimatici. În cazul unei reacții pozitive, enzima atașată la complexul antigen-anticorp descompune substratul adăugat în sistem, rezultând în dezvoltarea colorației de culoare de intensitate diferită.

În reacție, determinarea complexului de AG și AT adsorbit pe faza solidă se realizează folosind anticorpi antiglobulină marcați cu enzima, în funcție de reacția de culoare a enzimei cu substratul.

În reacție, determinarea complexului de antigene și anticorpi adsorbiți pe faza solidă se realizează folosind anticorpi antiglobulină marcați cu enzime.

ELISA prezintă posibilitatea de a detecta Ig serice de diferite clase. Există sisteme pe piață care vă permit să determinați separat IgM și IgG și anticorpii totali.

Antigenii specifici utilizați pentru ELISA pot avea o origine diferită:

ultra-voce- se obtin ca urmare a distrugerii celulei bacteriene T.pallidum prin ultrasunete sau alta metoda;

recombinant- sunt obținute prin tehnologii de inginerie genetică prin introducerea în genomul unei celule bacteriene (de exemplu, Escherichia coli E.Coli) a genei responsabile de sinteza unui anumit antigen T.pallidum, urmată de creșterea masei bacteriene de microorganismul producator, distrugerea acestor celule, izolarea si purificarea antigenului;

peptidă- obţinută ca urmare a sintezei chimice secvenţiale a epitopilor antigenici ai proteinelor T.pallidum.

Organismul este capabil să formeze anticorpi pentru aproape orice parte a moleculei de antigen. Într-un răspuns imun normal, acest lucru nu se întâmplă de obicei. Una sau mai multe peptide imunogene izolate dintr-un antigen proteic au o antigenitate specială, iar majoritatea anticorpilor sunt formați în mod specific pentru acestea. Ei dezvoltă cel mai intens răspuns imunitar. Cele mai informative din ELISA au arătat regiuni imunodominante ale proteinelor treponemului palid cu o greutate moleculară de 15 kD, 17 kD și 47 kD. Ca antigen a fost folosit un extract detergent sau un sonicat de treponeme patogene ale tulpinii Nichols.

3. Metoda de realizare a cercetării prin metoda

Principiul metodei este identificarea unui complex antigen-anticorp specific adsorbit pe faza solidă (suprafața godeurilor unei plăci de plastic) cu anticorpi antiglobulină marcați cu o enzimă (peroxidază) folosind o reacție de culoare cu un substrat, care este cuantificat spectrofotometric.

Antigenii utilizați pentru a sensibiliza godeurile plăcii de polistiren pot fi:

• lizat- obtinut ca urmare a distrugerii treponemului palid prin ultrasunete;
• peptidă- obținut ca urmare a sintezei chimice a fragmentelor de proteine ​​de treponem pal și având reactivitate antigenică similară cu proteinele originale ale agentului patogen;
• recombinant- obținut prin metode de inginerie genetică, purtând determinanți antigenici identici cu treponemul palid.

În practica sifilidologică, se folosește de obicei o variantă indirectă a ELISA.

4. Contabilitatea rezultatelor

În ELISA, pentru a vizualiza reacția antigen-anticorp, se folosește o reacție enzimatică (fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean) cu un substrat, care își schimbă culoarea. Intensitatea culorii determină pozitivitatea reacției (de la „-” la „++++”). Rezultatele ELISA pot fi evaluate vizual pe un sistem cu 4 puncte sau instrumental sub forma unor indicatori digitali de densitate optică obținuți pe cititoare speciale (cum ar fi Multiscan) la o lungime de undă de 492 nm. pentru că evaluarea rezultatelor se realizează spectrofotometric, aceasta excluzând interpretarea subiectivă.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să se folosească

Termenii de pozitivitate ELISA - din a 4-a săptămână de la infectare. Rezultatele ELISA (precum și RIF) devin pozitive în primele zile ale perioadei primare sau la sfârșitul incubației și rămân pozitive în toate perioadele. ELISA este deosebit de valoroasă în diagnosticul precoce al sifilisului - rezultate pozitive la anticorpi pot fi obținute deja la sfârșitul perioadei de incubație a bolii (adică, 4-6 săptămâni după infecție).

6. Sensibilitate și specificitate

ELISA este un test foarte sensibil și specific, ceea ce este avantajul său. ELISA în ceea ce privește mecanismul de reacție, sensibilitatea și specificitatea este apropiată de RIF, tk. aceiași anticorpi iau parte la ambele reacții. Majoritatea cercetătorilor notează specificitate și sensibilitate ridicate în toate etapele bolii. Sensibilitatea diferitelor variante ELISA, conform lui G. A. Dmitriev, ajunge la 98–100%, iar specificitatea este de 96–100%. Potrivit TsNIKVI, sensibilitatea ELISA pentru sifilis este de 99,1% (Ordinul nr. 87 M3 al Federației Ruse).

Varianta ELISA în fază solidă (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) este unul dintre cele mai sensibile teste serologice, permițând detectarea a 0,0005 µg/ml de anticorpi și 0,000005 µg/ml de antigene.

7. Domeniul de aplicare al metodei

Se recomandă utilizarea metodei la examinarea femeilor însărcinate, a persoanelor de contact, a donatorilor și a reprezentanților grupurilor de risc. ELISA poate fi utilizat atât ca test de screening, cât și de confirmare. Într-un timp relativ scurt al istoriei sale, ELISA a evoluat de la un test indicativ la unul de confirmare. În diagnosticul de sifilis, testul este folosit și ca test de confirmare pentru probele care prezintă rezultate pozitive folosind diverse teste non-treponemale și TPHA.

Metoda ELISA poate fi utilizată cantitativ cu calculul indicelui de pozitivitate sau reactivitate, ceea ce vă permite să evaluați nivelul de anticorpi din probă.

În prezent, în Rusia, utilizarea imunotestului enzimatic pentru diagnosticarea sifilisului este reglementată de Ordinul Ministerului Sănătății al Federației Ruse nr. 87 din 26 martie 2001 „Cu privire la îmbunătățirea diagnosticului serologic al sifilisului” (Anexa nr. 1 „Configurarea testelor de screening și diagnostic pentru sifilis”). În comandă, este planificată înlocuirea RSK în complexul de seroreacții (SSR) cu ELISA și RPHA.

8. Surse și cauze ale erorilor de punere în scenă, fals pozitive și fals negative

Imunotestul enzimatic este un studiu complex în mai multe etape, în care este necesar să se respecte cu strictețe toate recomandările producătorilor de truse de diagnosticare, regulile de ajustare și configurare a echipamentului utilizat în studiu.

Următoarele puncte pot fi sursa erorilor la configurarea unui ELISA:

Un studiu în reacția hiperlipidemiei, a serului sanguin hemolizat sau a probelor cu semne de creștere bacteriană;

Nu practicați dubla sau mai mult congelarea unei probe de material biologic; dacă este necesar, reexaminare, utilizați ser dintr-un tub duplicat;

Încălcarea termenilor și condițiilor de păstrare a imunosorbantului și a soluției de spălare; utilizarea truselor de testare expirate;

Aplicarea componentelor de reacție din alte truse de diagnosticare;

Încălcarea timpului etapelor de reacție;

uscarea godeurilor plăcii imunologice în timpul etapelor de reacție;

Reutilizarea vaselor din plastic (tavi din plastic) pentru prepararea unui amestec de cromogen si substrat;

Nerespectarea frecvenței de control metrologic a parametrilor de funcționare a aparatelor utilizate (săibă și spectrofotometru);

Utilizarea sticlei de laborator contaminate la stabilirea reacțiilor: baloane, cilindri de măsurare, eprubete, pipete, vârfuri de pipetă;

Amănunțime insuficientă în efectuarea diluțiilor probelor de material biologic;

Erori la introducerea unei probe de material biologic în godeul corespunzător al tabletei;

Erori la transferul rezultatelor studiului în jurnalul de înregistrare, protocolul de studiu sau formularul de răspuns.

Implementarea atentă a recomandărilor din instrucțiunile de utilizare a truselor de testare de diagnosticare, verificarea regulată a acurateței dozatoarelor de pipete și a dispozitivelor automate, utilizarea controalelor interne pozitive și negative permit obținerea rezultatelor ELISA foarte reproductibile.

9. Caracteristici, avantaje și dezavantaje

ELISA se referă la metode moderne și promițătoare de serodiagnostic a sifilisului datorită simplității, reproductibilității și disponibilității sale. Detectarea anticorpilor prin ELISA este o metodă de diagnostic ideală potrivită pentru examinarea simultană a unui număr mare de probe. Datorită avantajelor sale, a câștigat popularitate în toate țările.

Tehnologia cercetării ELISA asigură conformitatea cu toate recomandările producătorilor de truse comerciale de testare de diagnosticare și minuțiozitatea procedurii de cercetare. Pentru a efectua cercetări în ELISA, este necesar să achiziționați echipamente speciale suplimentare. Tehnica de setare durează mai mult timp în comparație cu RMP, RPR și RPGA.

Prezența automatizării unui număr de etape sau a întregului proces vă permite să examinați simultan un număr mare de mostre de material biologic cu un grad ridicat de standardizare a studiului, minimizând elementul subiectiv în evaluarea rezultatelor, posibilitatea de stocare a protocoalelor fixe de studiu, ceea ce face posibilă arhivarea datelor de studiu și trimiterea din nou la acestea pentru analiză retrospectivă.

Avantaje:

• Permite determinarea diferențiată și totală a anticorpilor IgM și IgG la agentul cauzal al sifilisului.
• sensibilitate ridicată și specificitate care se apropie de 100%,
• reproductibilitatea
• posibilități de automatizare

Avantajele ELISA includ specificitatea ridicată (96-100%) și sensibilitatea (98-100%) observate de majoritatea cercetătorilor.

Prezența automatizării unui număr de etape sau a întregului proces în ansamblu face posibilă examinarea simultană a unui flux cu un număr mare de probe de material biologic cu un grad ridicat de standardizare a studiului, minimizând elementul subiectiv în evaluare a rezultatelor, posibilitatea de stocare a protocoalelor fixe de studiu care permit arhivarea datelor studiului și accesarea lor din nou pentru analiza retrospectivă.

Dezavantajele semnificative ale metodelor manuale, inclusiv determinarea anticorpilor la antigenele T. pallidum prin ELISA, sunt:

~ posibile erori ale personalului în timpul studiului (supraveghere, neglijență, încălcare a tehnologiei);

~ imposibilitatea standardizării complete a procesului de cercetare cu o versiune manuală a ELISA;

~ risc crescut de infectare a personalului.

10. Modificări de metodă

Alături de ELISA indirectă clasică, metoda este de asemenea cunoscută. ELISA prin capcană. A fost propus în 1989 de O. E. Ijsselmudien și colab. pentru a detecta anticorpii din clasa IgM la antigenele Tr. pallidum. Metoda are specificitate și sensibilitate ridicate.

Anticorpii purificați la imunoglobulinele umane din clasa M sunt absorbiți pe suprafața godeurilor tabletei și, după incubarea serului de testat, toate IgM se leagă de purtător. Prezența printre IgM asociate specifice pentru antigenele Tr. pallidum este detectat cu ajutorul antigenelor Tr. pallidum conjugat cu o enzimă.

Această metodă vă permite să detectați anticorpi nu numai din clasa IgM, ci și din clasele IgG, IgA. Pentru a face acest lucru, godeurile plăcilor sunt sensibilizate cu anticorpi purificați cu afinitate dintr-o anumită clasă împotriva imunoglobulinelor umane. În același timp, anticorpii din această clasă sunt capturați din ser, iar detectarea anticorpilor specifici treponemic este realizată prin combinarea acestora cu un conjugat, care este o combinație de antigen treponemal cu o enzimă.

Utilizarea unui ELISA prins reduce riscul de reacții fals pozitive mediate de factorul sanguin reumatoid, reacții încrucișate între imunoglobulinele din clasele M și G. La examinarea nou-născuților, în acest caz, rezultatele testelor fals pozitive asociate cu detectarea IgM îndreptate împotriva IgG antitreponemice materne sunt de asemenea excluse.

Ca variante ELISA în străinătate sunt utilizate pe scară largă test imun enzimatic (EIA) si sistem ICE Sifilis. În cel din urmă, un amestec de anticorpi la IgM și IgG, precum și trei proteine ​​recombinate T. pallidum, a fost adsorbit în godeurile plăcii. Rezultatele pozitive sunt testate în același sistem de testare în două repetări pentru a da rezultatul final.

În Rusia, au fost dezvoltate o serie de sisteme de testare pentru serodiagnosticarea sifilisului prin ELISA cu reactivi domestici. Aceste sisteme au specificitate și sensibilitate ridicate.

Pe lângă cele de mai sus, există și alte opțiuni ELISA, inclusiv cele care permit detectarea directă a agentului patogen în sânge (ELISA direct), dot-ELISA cu reacția pe benzi de nitroceluloză, ELISA cu sânge capilar, precum și imunoblot, sau Western Blot, cu detectarea simultană a anticorpilor la diferite componente ale agentului patogen.

O modificare modernă îmbunătățită a ELISA este imunoblotting.

ICA (analiza imunochimiluminiscentă), ICL (imunochemiluminiscență)

Odată cu dezvoltarea diagnosticului de laborator în contextul modernizării asistenței medicale în Federația Rusă, automatizarea cercetării de laborator a intrat în practica laboratoarelor, ceea ce face posibilă standardizarea etapelor analitice ale cercetării. Acest lucru îmbunătățește calitatea diagnosticului. Odată cu introducerea automatizării, au început să fie utilizate noi metode de înaltă tehnologie cu sensibilitate și specificitate ridicate, cum ar fi imunotestul cu chemiluminiscență (CLIA)

Chemiluminiscența este procesul de emisie de fotoni în timpul tranziției produșilor excitați electronic ai reacțiilor chimice oxidative la starea energetică inițială. În timpul reacției de chimioluminiscență, se eliberează o cantitate semnificativă de energie, iar randamentul cuantic al luminii emise este destul de mare. Dintre toate metodele non-izotopice, chemiluminiscența oferă cea mai mare sensibilitate. Pentru metodele imunometrice, sensibilitatea chemiluminiscenței este cu ordine de mărime mai mare decât cea a radioimunotestului.

Metoda imunochimiluminiscenței (ICL) și-a găsit acum aplicația în diagnosticul markerilor tumorali, bolilor autoimune, diabetului zaharat, markerilor cardiaci, hormonilor (tiroidieni, suprarenalieni, hormoni sexuali feminini și masculini), infecțiilor cu torță, hepatitei virale, virusurilor grupului herpes.

Pe baza metodei imunochimiluminiscenței, au fost dezvoltate o serie de sisteme de testare foarte sensibile și specifice (98-100%) pentru diagnosticarea sifilisului, care sunt utilizate în principal în străinătate.

În metodă, lipoproteinele recombinante obţinute prin metode de inginerie genetică sunt utilizate ca antigene, care sunt analogi completi ai antigenelor T.pallidum.

Pe baza rezultatelor unui studiu clinic, metoda ICA a fost recunoscută și recomandată pentru utilizare în diagnosticul de laborator al sifilisului în Federația Rusă ca test de screening și de confirmare, dacă laboratoarele au echipamentul adecvat. În 2012, ICA a fost inclusă ca test de screening și confirmare pentru diagnosticul de sifilis în Ghidurile clinice pentru managementul pacienților cu infecții cu transmitere sexuală și infecții urogenitale.

Astfel, utilizarea ICA de înaltă tehnologie, care a intrat în practica diagnosticului de laborator atât mondial, cât și domestic odată cu introducerea automatizării, oferă următoarele avantaje:

• excluderea influenței factorilor subiectivi la etapa analitică a studiului
• siguranța personalului atunci când se efectuează studii asupra materialului biologic potențial infectat
• creşterea vitezei de obţinere a rezultatelor de către pacient
• standardizarea cercetării și controlul calității cercetării
• furnizarea de rezultate fiabile și fiabile pacienților
• cercetare clinică de laborator de înaltă calitate.

Din punct de vedere al sensibilității, metoda ICA este comparabilă cu metoda radioimunotestului, iar în ceea ce privește ușurința de execuție, siguranța personalului și mulți alți parametri, o depășește.

Metoda ICA, care are sensibilitate și specificitate ridicate (98-100%), face posibilă cuantificarea nivelului de anticorpi la agentul cauzal al sifilisului și poate fi utilizată pentru a confirma infecția sifilitică și screening-ul. Limitări de utilizare: nu poate fi utilizat pentru a monitoriza eficacitatea terapiei, poate da un rezultat fals pozitiv.

Imunocromatografie (ICH).

Relativ noi pentru utilizare în Federația Rusă sunt metodele de detectare a anticorpilor specifici treponemului bazate pe metode de imunocromatografie (ICH). Ca și în metoda ICA, lipoproteinele recombinante obținute prin metode de inginerie genetică (de exemplu, antigenele Tp15, Tp17, Tp47) și peptida biosintetică TmpA sunt utilizate ca antigene. Antigenele enumerate sunt, de asemenea, utilizați în diferite combinații ca parte a imunosorbanților în ELISA și imunoblot.

Metoda ICG vă permite să determinați rapid conținutul de anticorpi specifici treponemului la agentul cauzal al sifilisului în probele de ser și sânge integral, fără a utiliza echipamente speciale de laborator și este utilizată în furnizarea de asistență medicală primară, inclusiv în indicații epidemiologice.

Limitări de utilizare: nu poate fi utilizat pentru a monitoriza eficacitatea terapiei, poate da un rezultat fals pozitiv.

PBT (teste rapide simple la pat)

Relativ recent, în serodiagnosticul sifilisului, a început să se dezvolte o direcție pentru dezvoltarea așa-numitelor teste simple rapide (PBT) sau teste la patul pacientului (Point-of-care - ROC). Testele rapide simple la pat sau testele imunocromatografice fac posibilă determinarea rapidă a conținutului de anticorpi specifici treponemului la agentul cauzal al sifilisului în probele de ser și sânge integral, fără utilizarea echipamentelor speciale de laborator și să fie utilizate în asistența medicală primară, inclusiv pentru indicatii epidemiologice. Limitări de utilizare: nu poate fi utilizat pentru a monitoriza eficacitatea terapiei, poate da un rezultat fals pozitiv.

Aceste teste se bazează pe detectarea imunocromatografică a anticorpilor la antigenele treponemale ai treponemului palid și sunt efectuate pe benzi; în acest caz, se pot folosi atât sânge integral, cât și ser (Herring A., Ballard R. și colab., 2006). Formatul testelor vă permite să efectuați cercetări în absența echipamentelor speciale și fără utilizarea energiei electrice. Cu toate acestea, din cauza sensibilității și specificității relativ scăzute, aceste teste nu și-au găsit încă aplicarea largă în practică.

Imunoblotting (Western Blot)

În ultimii ani au apărut metode de cercetare care vizează detectarea și analiza conținutului de anticorpi. pentru fiecare antigen treponem palid separat. O astfel de metodă este metoda de blotting imun (sau blotting, imunoblot, Western blot), care este utilizată pentru determinarea anticorpilor IgG sau IgM la treponemul palid. Metoda de imunoblotare este o modificare a imunotestului enzimatic - o variantă a ELISA.

Imunoblotting este una dintre cele mai moderne metode de serodiagnostic a sifilisului și este utilizată activ în străinătate. Și-a primit numele ("Western blotting") ca răspuns plin de umor la numele tehnicilor de detectare a ADN-ului ("Southern Blotting") și ARN ("Northern Blotting").

1. Istoricul metodei

Imunoblotting (Western blot) este utilizat pentru a determina anticorpii IgG sau IgM la antigenele treponemului palid (Herremans M. et al., 2007).

2. Imunoblot clasic

Imunoblot clasic(Analiza Western Blot) combină imunotestul enzimatic și utilizarea unei metode electroforetice. Antigenii proteici ai agentului cauzal al sifilisului sunt separați preliminar prin electroforeză și transferați la un purtător - o membrană (bandă) de nitroceluloză. Acest transfer se numește blotting. Apoi acest purtător cu puncte separate (bloturi) este tratat cu serul de testat și anticorpi la IgG sau IgM marcați cu enzime sau substanțe radioactive. Metoda implică utilizarea proteinelor treponem naturale sau recombinate.

electroforeză este separarea compușilor încărcați pe baza mobilității lor într-un câmp electroforetic. Când se aplică o diferență de potențial într-un mediu, moleculele încărcate pozitiv se deplasează către un electrod încărcat negativ, iar moleculele încărcate negativ se deplasează către un electrod pozitiv.

Majoritatea proteinelor globulare sunt asamblate în așa fel încât majoritatea grupărilor încărcate, și anume cele hidrofile, sunt situate pe suprafața proteinei, în timp ce reziduurile neîncărcate, hidrofobe, sunt scufundate în interiorul globului. Într-un câmp electric, în conformitate cu sarcina lor, proteinele migrează către un electrod încărcat opus.

Separarea electroforetică a proteinelor se realizează într-un mediu de gel sintetic pe bază de poliacrilamidă. Pentru a separa proteinele în funcție de greutatea lor moleculară, înainte de electroforeză, amestecul de proteine ​​este preincubat în prezența dodecilsulfatului de sodiu (SDS).

Studii detaliate ale oamenilor de știință străini Weber și Osborn (1969) au arătat că, după un astfel de tratament, singurul factor care poate afecta mobilitatea proteinelor într-un gel de poliacrilamidă (PAAG) este dimensiunea proteinei, sau mai degrabă greutatea moleculară a acesteia. Acest lucru a făcut posibilă aplicarea metodei de electroforeză în SDS-PAGE în prezența SDS pentru o determinare destul de precisă a greutății moleculare a proteinelor și peptidelor. În literatura străină, această metodă a fost numită SDS-PAGE (electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă).

Profil de reactivitate în testul WB clasic cu antigeni naturali (metoda de electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu). (1) - rezultat martor pozitiv, (2) - rezultat martor negativ, (3-6) - probe clinice.

În testele pentru sifilis folosind această metodă, purificat anterior și distrus în componentele sale constitutive, treponemul palid este supus electroforezei într-un gel de poliacrilamidă sau agaroză. În același timp, antigenele incluse în compoziția sa sunt separate prin greutate moleculară.

Apoi, prin electroforeză verticală, antigenele sunt transferate pe o bandă de nitroceluloză, care conține acum un spectru invizibil de benzi antigenice caracteristice treponemului palid.

În timpul analizei, materialul de testat (ser, plasma sanguină a pacientului etc.) este aplicat pe o bandă (bandă) de nitroceluloză. Dacă există anticorpi specifici în probă, atunci în procesul de incubare se leagă puternic de benzile antigenice care le corespund strict (complementare) și formează un complex „antigen-anticorp”.

După îndepărtarea imunoglobulinelor nelegate în timpul spălării benzii, urmează incubarea cu un conjugat - anticorpi marcați cu enzime la imunoglobulinele umane (anticorpi la IgG sau IgM umane), timp în care anticorpii marcați cu enzima sunt atașați la anticorpul antigen existent. complexe de pe suprafața membranei.

După îndepărtarea conjugatului nelegat în timpul incubării cu soluția de substrat, enzima interacționează cu substratul, rezultând o reacție de culoare - colorarea secțiunilor membranei (sub formă de benzi) în care se află antigenele individuale ale treponemului palid, anticorpii împotriva care se aflau în serul de testare. Intensitatea colorării depinde de cantitatea de anticorpi legați din ser. Rezultatul reacției este evaluat vizual.

Prezența benzilor în anumite zone ale plăcii de nitroceluloză confirmă prezența în serul studiat a anticorpilor la antigeni strict definiți ai treponemului palid.

Imunodeterminanții 15, 5, 17, 44,5, 47 kD determinați prin această metodă au semnificație diagnostică în sifilis. Imunoblotarea Ig G este similară ca sensibilitate și specificitate cu RIF cu absorbție (RIF abs). Imunoblotarea Ig M poate servi ca test de diagnostic pentru sifilisul congenital.

3. Imunoblot în format imunotest liniar

Imunotestul liniar (liniar imunoassay, LIA) vă permite să determinați simultan anticorpi la antigenele treponem palide în ser sau plasmă umană. Antigenele sunt pre-aplicate pe benzile de testare (benzi), care sunt furnizate ca parte a truselor de diagnosticare comerciale.

Benzile sunt realizate din membrană de nitroceluloză, membrană de poliamidă cu suport de plastic sau membrană de nailon cu suport de plastic. În timpul fabricării, mai multe antigene discrete sunt plasate pe banda de testare ca linii antigenice separate. Pe lângă aceste antigene de sifilis, pe fiecare bandă sunt aplicate încă patru linii de control: streptavidină și martori (3+, 1+ și ± linia de tăiere).

Pentru benzi se folosesc antigene artificiale obținute prin inginerie genetică - proteine ​​recombinate sau construcții polipeptidice sintetice. Aceștia sunt analogi ai antigenilor de suprafață ai treponemului palid - TpN15, TpN17, TpN47 și TmpA cu o greutate moleculară de 15, 17, 47 kDa și 44,5 (TmpA), unde kDa = kiloDaltoni. Cu ajutorul lor, se determină anticorpii serici la diferite componente imunodominante ale agentului patogen.

Incubarea probei de testat are loc într-o cuvă, unde este plasată și banda indicator. Anticorpii la T. pallidum sunt determinați prin legarea la antigenii imprimați pe benzile de testare. Dacă în probă există anticorpi specifici pentru T. pallidum, aceștia formează legături cu liniile individuale de antigen. Atunci când anticorpii conținuți în serul de testare interacționează cu antigeni discreti de T. pallidum plasați pe banda de testare, se formează un complex antigen-anticorp sub formă de benzi colorate detectabile vizual.

Luând în considerare rezultatele imunoblotării, reactivitatea serului la fiecare dintre antigene este evaluată separat. Un răspuns total pozitiv este emis atunci când se obține un rezultat simultan cu doi sau trei dintre antigenele prezentate.

Procedurile de cercetare se desfășoară manual sau pe un analizor special, cu interpretarea rezultatelor folosind un program de calculator specializat pentru boli infecțioase.

Datorită gradului ridicat de purificare a antigenelor recombinante și a detectării simultane a anticorpilor la cei mai imunogeni determinanți ai agentului cauzal al sifilisului, metoda are sensibilitate și specificitate ridicate.

4. Contabilitatea rezultatelor

Pentru a citi intensitatea colorării benzilor antigenice pe benzi, au fost dezvoltate fotometre, a căror funcționare se bazează pe reflectarea semnalului, care elimină evaluarea subiectivă și oferă o posibilă oportunitate de automatizare.

5. În ce perioade ale bolii este mai bine să se folosească

Testele care utilizează metoda Western blot pot detecta anticorpi specifici la antigenele Treponema pallidum într-un stadiu foarte incipient al bolii. Cei mai semnificativi în diagnosticul sifilisului sunt anticorpii la antigenele treponemului palid TpN15, TpN17, TmpA și TpN47. Acești antigeni sunt proteine ​​​​de membrană având greutăți moleculare de 15, 17, 44,5 și, respectiv, 47 kDa.

Când treponema pallidum este introdus în corpul uman, anticorpii antisifilitici apar în această ordine: mai întâi se dezvoltă un răspuns imun la antigenele TpN17, apoi la TpN47, după TpN15 și după toate TmpA. Luând în considerare rezultatele testelor, se evaluează separat reactivitatea serului față de fiecare dintre ele. De exemplu, atunci când într-o pată liniară există reactivitate numai la linia antigenică TpN17 și TpN47, aceasta înseamnă că boala este într-un stadiu incipient. Cu cât liniile antigenice devin mai reactive, cu atât mai mult progresează infecția. În tratamentul sifilisului, modelul de reactivitate în acest test se modifică.

Determinarea IgM la proteine ​​cu o greutate moleculară de 15,17, 41, 47 kDa face posibilă identificarea a 29,2% dintre pacienții cu sifilis secundar, 12,5% cu sifilis latent precoce și 8,0% cu serorerezistent. Căutarea IgG la aceleași molecule se caracterizează printr-o sensibilitate de 61,6% pentru sifilisul serorerezistent și de 100% pentru sifilisul latent secundar și precoce.

6. Sensibilitate și specificitate

Conform literaturii de specialitate, sensibilitatea si specificitatea testului sunt foarte mari - 99,6-100%, respectiv 99,3-99,5%. În metoda clasică, aceasta se realizează prin separarea electroforetică a proteinelor, glico- și lipoproteinelor și specificitatea maximă de detectare a serurilor imune sau a anticorpilor monoclonali. În condiții optime, imunoblotting poate detecta antigenul în cantități mai mici de 1 ng în volumul de testat.

Sensibilitatea blotului linear este, de asemenea, de 99,6%, iar specificitatea este între 99,3% și 99,5%.

Potrivit experților, imunoblotarea cu antigeni recombinanți foarte specifici este similară ca sensibilitate și specificitate cu RIF abs.

Conform datelor din literatură străină și rezultatelor unui studiu la TsNIKVI, metoda imunoblotării are sensibilitate ridicată (98,8-100%) și specificitate (97,1-100%) în diagnosticul de sifilis.

7. Domeniul de aplicare al metodei

Imunoblot (immunoblot) este o metodă de referință foarte specifică și foarte sensibilă. Sensibilitatea și specificitatea ridicate permit ca această metodă să fie considerată un test de confirmare pentru sifilis. Metoda poate fi folosită pentru a confirma diagnosticul, precum și dacă alte teste treponemale dau rezultate îndoielnice și contradictorii. Western blot poate confirma diagnosticul la pacienții cu rezultate pozitive sau nedeterminate ale testelor, inclusiv cele obținute prin TPHA sau ELISA.

8. Surse și cauze ale erorilor de punere în scenă, fals pozitive și fals negative

Rezultatele fals pozitive sunt foarte rare. Rezultatele fals-negative sunt, de asemenea, destul de rare și se observă la pacienții cu imunodeficiențe - mai des la persoanele infectate cu HIV și cu efectul unei „ferestre” diagnostice din cauza întârzierii sintezei anticorpilor, precum și a erorilor în stadiul de stadializare.

Utilizarea sistemelor moderne de testare dictează respectarea exactă a tuturor cerințelor atât pentru material, cât și pentru performanța reacției. Practic, sursa erorilor este o încălcare a ordinii și tehnologiei studiului (în special pentru Western blot clasic), nerespectarea recomandărilor producătorilor de truse de testare. . De asemenea, se pot face erori la recoltarea, livrarea, păstrarea probelor de ser sanguin, precum și la efectuarea testelor. Pe lângă mostrele contaminate, alte cauze posibile includ utilizarea truselor de testare expirate și erorile în analiza rezultatelor testelor.

9. Caracteristici, avantaje și dezavantaje

Unicitatea imunoblotului constă în conținutul său ridicat de informații și fiabilitatea rezultatelor.

Testul nu necesită antigene foarte purificate, seruri de referință și de control. Identificarea unei ținte de anticorpi se bazează pe greutatea moleculară a proteinei cu care reacționează anticorpii din serul pacientului. Într-o reacție, poate fi detectată legarea anticorpilor la mai mulți antigeni, fiecare dintre acestea putând fi caracterizat cu precizie. Datorită acestui fapt, imunoblotarea are o serie de avantaje față de alte metode de detectare a anticorpilor, ale căror rezultate depind de standardizare, sensibilitate, calitatea substratului, instabilitatea sau insolubilitatea anumitor antigene.

Metoda este ușor reproductibilă, relativ ușor de realizat și interpretat rezultatele, face posibilă determinarea spectrului de anticorpi la mai multe antigene T. pallidum simultan și evaluarea contribuției anticorpilor cu specificitate diferită la reacția globală.

Utilizarea de antigene recombinante și peptidice înalt purificate minimizează reactivitatea nespecifică a serurilor. Utilizarea metodei face posibilă evitarea metodelor subiective și consumatoare de timp care sunt periculoase pentru cercetător (transplantul tulpinilor de G. pallidum, lucrul cu T. pallidum patogen în formularea reacției). Aceasta determină preferința pentru metoda imunoblotării față de alte teste treponemale (RIF și în special RIBT) pentru diagnosticul de sifilis.

10. Modificări de metodă

Există mai multe sisteme comerciale de testare bazate pe această metodă. Unele dintre ele sunt în format western blot, constau din benzi pe care sunt transferate componente proteice ale T. pallidum, separate anterior prin electroforeza pe gel de poliacrilamida.

Altele sunt în format blot liniar, constau din benzi pe care polipeptidele recombinante și sintetice sunt adsorbite sub formă de linii discrete - analogi ai antigenelor de suprafață ai T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 și TmpA.

Rezultatele Western blot sunt mai dificil de interpretat deoarece benzile prezintă o mare varietate de anticorpi, dintre care mulți sunt specifici grupului. În schimb, interpretarea rezultatelor blot linear este simplă; în plus, liniile de control suplimentare imprimate pe bandă permit evaluarea semi-cantitativă a nivelului de anticorpi la cei patru antigeni de T. pallidum.

Tehnologia xMAP

xMAP este o tehnologie de ultimă generație care face posibilă efectuarea de studii multiparametrice prin detectarea simultană a mai multor analiți într-o singură probă biologică. Ca fază solidă se folosesc microsfere colorate acoperite cu reactivi de captare (oligonucleotide, anticorpi, antigeni).

Proba de testat este adăugată la soluția care conține microsferele. Analiții detectați în probă sunt legați de microsfera corespunzătoare, după care se adaugă în soluție un agent de detectare (anticorpi de detectare, etichetă fluorescentă). Pentru detectarea analitului de determinat se folosește un sistem de două lasere, care permite atât o evaluare calitativă a prezenței unui analit într-o probă (pentru aceasta se folosește un laser roșu care clasifică microsferele după culoare), cât și o evaluare cantitativă. a conținutului de analit dintr-o probă (pentru aceasta se folosește un laser verde).

Studiul se realizează automat pe analizoare precum Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) echipate cu software.

Performanța tehnologiei xMAP depășește semnificativ performanța testului imunoabsorbant clasic legat de enzime (ELISA) cu o cantitate semnificativ mai mică de biomaterial.

Tehnologia xMAP, care are o sensibilitate analitică ridicată, este utilizată în prezent pentru a rezolva o gamă largă de probleme clinice. Cu ajutorul acestuia, într-o probă de material biologic, se realizează detectarea simultană a oncomarkerilor cunoscuți, a markerilor cardiaci, a markerilor fazei acute și a diabetului zaharat, se realizează o gamă largă de citokine, chemokine și factori de creștere. Detectarea simultană a mai multor analiți într-o probă biologică poate reduce semnificativ timpul de examinare a pacientului. Până în prezent, au fost dezvoltate o serie de sisteme de testare pentru detectarea anticorpilor la agenții patogeni ITS, în special infecția sifilitică, folosind metoda xMAP.

CENTRU MEDICAL„Pe Samotechnaya”

Recepție cu programare! Sâmbătă duminică.

Sifilisul este o boală infecțioasă care se poate transmite prin contact sexual. Agentul cauzal al bolii este o bacterie precum treponemul palid (spirocheta), care afectează organele interne, mucoasele și pielea.

Pentru depistarea bolii se folosesc teste de sânge și, în unele cazuri, lichidul cefalorahidian. Rezultatele sunt indicate prin plusuri sau încrucișări sunt utilizate într-o cantitate de la 1 la 4.

Sifilisul patru încrucișări este considerată etapa cea mai periculoasă pentru o persoană. Interpretarea testelor și a diagnosticului este determinată exclusiv de medic.

Patru etape ale bolii și caracteristicile lor

Definirea unei boli cu transmitere sexuală se realizează prin studierea sângelui pentru prezența treponemului.

Această metodă de recunoaștere a sifilisului folosind o reacție serologică este cea mai comună dintre multe teste.

Imunologul a creat un sistem special de caracterizare a bolii, în care crucile indică cantitatea de anticorpi. Este important să știți că nu sunt în boala în sine, dar există treponeame, ulcere și o erupție cutanată sifilitică.

O creștere a titrului de anticorpi indică reproducerea activă a agentului patogen, iar încrucișările sunt conținute în orice analiză cu o evaluare pozitivă a prezenței anticorpilor. Luați în considerare etapele bolii și caracteristicile acestora.

Sifilis o cruce

Dacă există încrucișări, sifilisul este pozitiv, dar există îndoieli chiar și atunci când se observă anticorpi în sânge pentru a lupta împotriva bolii.

Prin urmare, medicii numesc un astfel de rezultat îndoielnic. Adesea rezultatul testului poate însemna o altă boală.

Un rezultat de 1+ înseamnă că a trecut puțin timp de la stadiul infecției. Plus poate fi prezent după tratamentul complet, când anticorpii au supraviețuit.

Sifilis două încrucișări

Două încrucișări înseamnă un rezultat pozitiv, ceea ce indică prezența treponemului în sânge.

O creștere a titrului indică o concentrație scăzută în sânge. Deci, trebuie să examinați bacteria pentru a valida concluzia 2 plus înainte de a începe terapia.

Sifilis trei încrucișări

Un test de sânge cu un scor de trei încrucișări indică un rezultat pozitiv și nu poate fi respins. Un studiu repetat al sângelui confirmă doar diagnosticul celei de-a treia încrucișări, care este tipic pentru boala în stadiul II de dezvoltare.

Sifilis patru încrucișări

Cea mai nefavorabilă concluzie este rezultatul a 4 încrucișări. Dar asta nu înseamnă deloc că boala nu poate fi vindecată.

Această etapă se caracterizează printr-o erupție cutanată vizibilă, căderea părului, febră. Numărul de anticorpi este la un nivel ridicat, astfel încât concluzia este fără îndoială.

Cum se face examinarea?

Recunoașterea sifilisului se realizează în două etape, începând cu examinarea pacientului, terminând cu studiul sângelui pentru anticorpi.

Medicul examinează pacientul, determinând deja probabilitatea prezenței bolii:

• detectarea ulcerelor pe organele genitale sau în cavitatea bucală;
• erupții dermatologice, foci;
• chelie în cap.

Medicul clarifică informațiile de la pacient, pe baza întrebărilor despre prezența unui act sexual suspect sau tratamentul unei boli cu transmitere sexuală.

Examene în laborator

Astăzi, un studiu privind detectarea sifilisului 4 cruce poate fi luat în mai multe moduri, cele mai faimoase sunt prezentate mai jos:

• RPR este un test care determină anticorpii din sânge la fosfolipidele membranei citoplasmatice;
• RIF (reacția de imunofluorescență) este o reacție mai sensibilă, deoarece prezintă un rezultat pozitiv deja în prima etapă la 80% dintre pacienți;
• RW (metoda imunologului german Wassermann) este o metodă de cercetare rapidă și fiabilă, care vă permite să efectuați o examinare și să prescrieți produse farmaceutice eficiente;
• imunotestul enzimatic al sângelui;
• reacția se bazează pe fenomenul de imobilizare a bacteriilor de către anticorpi precum imobilizinele;
• hemaglutinarea pasivă arată prezența și cantitatea de anticorpi.

Până în prezent, sifilisul poate fi tratat în orice stadiu. Dar este mult mai ușor de tolerat tratamentul la primele manifestări ale bolii, atunci când infecția nu a afectat întregul organism.

Termenul de tratament și medicamentele sunt prescrise de un venereolog pe baza caracteristicilor individuale ale corpului uman și a stadiului leziunii.

Nu uitați că cea mai bună prevenire a sifilisului este o relație strânsă cu un partener obișnuit, în a cărui sănătate sunteți complet sigur.

Analiza RPHA este o tehnică care este una dintre cele mai importante dintre alte teste de sânge. Cu ajutorul acestuia, puteți determina dezvoltarea unor boli neplăcute de natură intestinal-infecțioasă. Dar adesea analiza este folosită pentru a detecta sifilisul. Studiul are o mare acuratețe și fiabilitate.

RPHA înseamnă reacție pasivă de hemaglutinare.

RPHA se bazează pe fenomenul de aglutinare a eritrocitelor, în care antigenele - reactivii RPHA - sunt adsorbiți la suprafață atunci când li se adaugă serul sanguin al unui pacient cu sifilis.

După ce serul unei persoane infectate cu sifilis este combinat cu reactivul RPHA, are loc aglutinarea (atașarea sau lipirea) eritrocitelor și acestea precipită. Gradul de aderență depinde direct de acumularea și densitatea anticorpilor în serul sanguin, din acest motiv, RPGA ajută nu numai la detectarea prezenței anticorpilor, ci și la identificarea numărului acestora.

Rezultatul este împărțit în infecție primară și secundară, exprimată în manifestarea diverșilor anticorpi. În primar, IgM este activată, în secundar, IgG. Precizia studiului în faza a doua devine și mai specifică. Dacă în prima fază este de aproximativ 96%, atunci în a doua poate ajunge până la 99%.

Analiza este bună ca studiu independent, dar este mai bine să o folosiți ca metodă de confirmare după un studiu nespecific pozitiv.

Datorită preciziei sale ridicate, această analiză este din ce în ce mai utilizată pentru a confirma sau infirma debutul leziunii de sifilis a unui pacient.

De asemenea, pentru o mai mare fiabilitate, după RPHA, se poate efectua un alt test de confirmare, de exemplu, un imunotest enzimatic „treponemal”.

În general, diagnosticul se realizează întotdeauna într-un mod complex, nu folosind doar 1 tip de examinare, ci prin combinarea diferitelor metode complementare.

Adresați-vă întrebarea medicului cu diagnostic de laborator clinic

Anna Poniaeva. A absolvit Academia Medicală Nijni Novgorod (2007-2014) și rezidențiat în diagnosticare clinică de laborator (2014-2016).

Un mic minus sau, mai degrabă, o caracteristică a analizei este sensibilitatea acesteia chiar și după vindecarea bolii. Rezultatul este menținut pozitiv pe tot parcursul vieții unei persoane care a avut sifilis. Din acest motiv, RPHA nu este utilizat pentru a diagnostica boala precoce sau tardivă. De asemenea, este imposibil să folosiți această analiză pentru a determina eficacitatea tratamentului.

Cu orice rezultat pozitiv, există o suspiciune de infecție. Dar ocazional poate apărea o reacție fals pozitivă. Adevărat, prezența sa cantitativă nu depășește de obicei 3% și este cauzată de o serie de motive neinfecțioase.