سلامتی کودکان. همه چیز درباره داروها چیست؟ اینترفرون آلفا 2b انسان چیست؟
در مطالعات بالینی که با طیف گسترده ای از نشانه ها و با طیف گسترده ای از دوزها انجام شده است (از 6 میلیون IU / m2 در هفته برای لوسمی سلولهای مودار ؛ تا 100 میلیون IU / M2 در هفته برای ملانوما) شایع ترین عوارض جانبی تب ، خستگی ، و سردردمیالژی در طی 72 ساعت پس از قطع مصرف دارو ، تب و خستگی فروکش کرد. اگرچه تب می تواند یکی از علائم سندرم مانند آنفولانزا باشد ، که اغلب با درمان اینترفرون مشاهده می شود ، برای رد کردن دیگران باید آزمایشاتی انجام شود. دلایل ممکن تب مداوم
مشخصات ایمنی زیر از 4 بدست آمد تحقیقات بالینی در بیماران مبتلا به هپاتیت مزمن C که به مدت 1 سال Intron A را به عنوان مونوتراپی یا همراه با ribavirin مصرف کردند. همه بیماران 3 میلیون IU از Intron A 3 بار در هفته دریافت کردند.
در جدول 2 ، عوارض جانبی مشاهده شده با فرکانس بیشتر یا مساوی با 10٪ در بیمارانی که قبلاً تحت درمان قرار نگرفته بودند و به مدت 1 سال از اینترون A (یا اینترون A در ترکیب با رباویرین) دریافت کرده بودند. به طور کلی ، عوارض جانبی گزارش شده خفیف تا متوسط \u200b\u200bبود.
جدول 2
| عوارض جانبی | اینترون A (806 \u003d n) | Intron A + ribavirin (n \u003d 1010) |
| واکنشهای محلی | ||
| واکنشهای التهابی در محل تزریق | 9–16% | 6–17% |
| سایر واکنشها در محل تزریق | 5–8% | 3–36% |
| واکنشهای عمومی | ||
| سردرد | 51–64% | 48–64% |
| خستگی | 42–79% | 43–68% |
| لرز | 15–39% | 19–41% |
| تب | 29–39% | 29–41% |
| سندرم آنفلوانزا | 19–37% | 18–29% |
| آتنیا | 9–30% | 9–30% |
| کاهش وزن | 6–11% | 9–19% |
| واکنشهای دستگاه گوارش | ||
| حالت تهوع | 18–31% | 25–44% |
| بی اشتهایی | 14–19% | 19–26% |
| اسهال | 12–22% | 13–18% |
| درد معده | 9–17% | 9–14% |
| استفراغ | 3–10% | 6–10% |
| واکنش سیستم اسکلتی عضلانی | ||
| میالژی | 41–61% | 30–62% |
| آرتروالژی | 25–31% | 21–29% |
| درد استخوان و عضله | 15–20% | 11–20% |
| واکنش CNS | ||
| افسردگی | 16–36% | 25–34% |
| تحریک پذیری | 13–27% | 18–34% |
| بیخوابی | 21–28% | 33–41% |
| اضطراب | 8–12% | 8–16% |
| توانایی اختلال در تمرکز | 8–14% | 9–21% |
| ناتوانی عاطفی | 8–14% | 5–11% |
| واکنش های پوستی | ||
| آلوپسی | 22–31% | 26–32% |
| خارش | 6–9% | 18–37% |
| پوست خشک | 5–8% | 5–7% |
| راش | 10–21% | 15–24% |
| واکنشهای تنفسی | ||
| فارنژیت | 3–7% | 7–13% |
| سرفه | 3–7% | 8–11% |
| تنگی نفس | 2–9% | 10–22% |
| دیگر | ||
| سرگیجه | 8–18% | 10–22% |
| عفونت ویروسی | 0–7% | 3–10% |
عوارض جانبی مشاهده شده در بیماران مبتلا به هپاتیت C ویروس با موارد مشاهده شده هنگام استفاده از Intron A برای سایر نشانه ها با افزایش وابسته به دوز در فراوانی توسعه مطابقت دارد.
هنگام استفاده از اینترون A برای سایر نشانه ها (در کارآزمایی های بالینی و خارج از کلینیک) ، بندرت (| 1/10000 ،< 1/1000) или очень редко (.
از کل بدن.بسیار بندرت - ورم صورت.
گزارش شده است که شرایط استن (استنی ، ضعف و خستگی) ، کمبود آب بدن ، تپش قلب ، پسوریازیس ، عفونت های قارچی و عفونت های باکتریایی (از جمله سپسیس) گزارش شده است.
از سیستم ایمنی بدن.به ندرت ، ساركوئیدوز یا بدتر شدن آن.
با استفاده از اینترفرونهای آلفا ، ایجاد اختلالات مختلف خود ایمنی و واسطه ایمنی از جمله پورپورا ترومبوسیتوپنیک ایدیوپاتیک یا ترومبوتیک ، روماتیسم مفصلی، لوپوس اریتماتوز سیستمیک ، واسکولیت و سندرم Vogt-Koyanagi-Harada.
موارد واکنش حساسیت حاد از جمله کهیر ، آنژیوادم گزارش شده است ورم آلرژیک و آنافیلاکسی.
از طرف سیستم قلبی عروقی - سایپرز ، باشگاه دانش: به ندرت - آریتمی (معمولاً در بیماران با سابقه بیماریهای قبلی سیستم قلبی عروقی یا با کاردیوتوکسیک قبلی انجام می شود) ، کاردیومیوپاتی برگشت پذیر گذرا (ذکر شده در بیماران بدون سابقه سیستم قلبی عروقی). بسیار بندرت - افت فشار خون شریانی ، ایسکمی میوکارد و انفارکتوس میوکارد.
از سیستم عصبی مرکزی و سیستم عصبی محیطی.به ندرت - تمایل به خودکشی؛ بسیار نادر - رفتار پرخاشگرانه ، از جمله کارگردانی به افراد دیگر ، اقدام به خودکشی ، خودکشی ، روانپریشی (از جمله توهم) ، اختلال آگاهی ، نوروپاتی ، پلی ونوروپاتی ، انسفالوپاتی ، ایسکمی مغزی و عروق مغزی ، خونریزی مغزی عروقی ، نوروپاتی محیطی ، تشنج.
از ارگان شنوایی.بسیار نادر - اختلال شنوایی.
از سیستم غدد درون ریز.به ندرت - دیابت، بدتر شدن دوره دیابت موجود.
از دستگاه گوارش است.بسیار بندرت - پانکراتیت ، افزایش اشتها ، لثه خونریزی ، کولیت.
از کبد و مجاری صفراوی.بسیار بندرت - سمیت کبدی (از جمله مرگ).
تغییر در دندانها و پریودنتیم. در بیمارانی که درمان ترکیبی با نیترون A و ریباویرین داشتند ، تغییرات پاتولوژیک در دندانها و پریودنتیم مشاهده شد. خشکی دهان با درمان ترکیبی طولانی مدت با ریباویرین و اینترون A می تواند در آسیب به دندانها و مخاط دهان نقش داشته باشد. بیماران باید روزانه 2 بار مسواک بزنند و معاینات منظم دندان انجام دهند. علاوه بر این ، استفراغ در بعضی از بیماران ممکن است رخ دهد.
از سمت متابولیسم.به ندرت - هایپرگلیسمی ، هایپرتریگلیسیریدمی.
از سیستم اسکلتی عضلانی.بندرت - رابدومیولیز (گاهی اوقات شدید) ، گرفتگی ساق پا ، درد کمر ، میوزیت.
از طرف پوست.به ندرت - اریتما مولتیفره ، سندرم استیونز-جانسون ، نکرولیز سمی اپیدرمال ، نکروز در محل تزریق.
از سیستم تنفسی.به ندرت ذات الریه به ندرت - نفوذ ریه ، پنومونییت.
از دستگاه ادراری.به ندرت - سندرم نفروتیک ، عملکرد کلیه ، نارسایی کلیه.
از سیستم خونریزی.به ندرت ، هنگام استفاده از اینترون A به تنهایی یا همراه با ribavirin ، کم خونی آپلاستیک و آپلازی کامل مغز استخوان قرمز ذکر شده است.
از طرف اندام بینایی.به ندرت - خونریزی در شبکیه ، تغییرات کانونی در فوندوس ، ترومبوز عروق شبکیه و رگها ، کاهش حدت بینایی ، کاهش زمینه های بینایی ، نوریت اپتیک ، ادم سر عصب بینایی.
از نظر بالینی تغییرات قابل توجه پارامترهای آزمایشگاهی(بیشتر در هنگام تجویز دارو در دوزهای بیش از 10 میلیون IU در روز مشاهده می شود) - کاهش تعداد گرانولوسیت ها و لکوسیت ها ، کاهش سطح هموگلوبین و تعداد پلاکت ها ، افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز ، LDH ، سطح کراتینین و نیتروژن اوره سرم. افزایش فعالیت ALT و ACT در پلاسما خون هنگام استفاده در تمام نشانه ها به جز هپاتیت ، و همچنین در برخی از بیماران مبتلا به هپاتیت مزمن B در غیاب DNA HBV ، به عنوان آسیب شناسی ذکر شده است.
اگر در حین استفاده از Intron A برای هرگونه علامت اثرات نامطلوب ایجاد شود ، باید دوز کاهش یابد یا درمان به طور موقت قطع شود تا اثرات نامطلوب از بین بروند. اگر عدم تحمل مداوم یا مكرر با استفاده از رژیم دوز كافی یا پیشرفت بیماری انجام شود ، باید اینترون A كنار گذاشته شود.
- داروسازی بالینی
عمل دارویی - ضد ویروسی ، ضد توموری و سیستم ایمنی بدن.
این پروتئین نوترکیب بسیار تمیز و با وزن مولکولی 19300 دالتون است. بدست آمده از یک کلون E. coli با هیبریداسیون پلاسمید باکتریایی با یک ژن لکوسیت انسانی که سنتز اینترفرون را رمزگذاری می کند. برخلاف اینترفرون ، آلفا 2a دارای آرژینین در موقعیت 23 است. اثر ضد ویروسی دارد که دلیل آن تعامل با گیرنده های غشایی خاص و القای سنتز RNA و در نهایت پروتئین ها است. دومی نیز به نوبه خود در تولید مثل طبیعی ویروس یا انتشار آن دخالت می کند. این فعالیت ایمنی بدن ، که با فعال شدن فاگوسیتوز ، تحریک تشکیل آنتی بادی و لنفوکین ها همراه است. دارای اثر ضد پرولیفراتیو بر روی سلولهای توموری است.
- فارماکوکینتیک
70٪ هنگام تزریق عضلانی وارد گردش سیستمیک می شود. این ماده بطور عمده در کلیه ها و به میزان کمی در کبد از طریق بیوترانسفورم صورت می گیرد. اینترفرون آلفا -2b توسط کلیه ها دفع می شود.
- فارماکوکینتیک
- نشانه های استفاده
- هپاتیت مزمن B
- هپاتیت مزمن C
- قارچ قارچ.
- لنفوسارکوم سلول T اولیه.
- لوسمی سلول مویی.
- مولتیپل میلوما (اشکال کلی).
- لوسمی میلوئید مزمن.
- ملانوم بدخیم.
- سرطان مثانه (به طور سطحی واقع شده است).
- سرطان سلول بازال.
- کندیلوماتوز اشاره کرد.
- سارکوم کاپوسی (از جمله ایدز).
- لنفوم غیر هوچکین (به عنوان بخشی از درمان ترکیبی).
- روش مصرف و دوز
بسته به علائم و رژیم درمانی بستگی دارد.
- با لوسمی سلول مایع
بزرگسالان به طور عضلانی یا زیر جلدی 2 میلیون IU / m2 3 بار در هفته تجویز می شوند.
- با سارکوم کاپوسی
30 میلیون IU / m 2 3 بار در هفته.
- با لوسمی سلول مایع
- موارد منع مصرف
- بیماری شدید قلبی عروقی.
- اختلال عملکرد کبدی و کلیوی شدید.
- صرع و / یا اختلالات عملکردی جدی سیستم عصبی مرکزی.
- هپاتیت مزمن با تهدید سیروز کبدی.
- بیماری کبد در مرحله جبران خسارت.
- هپاتیت مزمن با یا بعد از درمان قبلی با سرکوب کننده های سیستم ایمنی (به استثنای شرایط پس از لغو درمان کوتاه مدت با کورتیکواستروئیدها).
- هپاتیت خود ایمنی.
- تاریخچه بیماریهای خود ایمنی.
- گیرندگان پیوند ایمن سرکوب شده.
- بیماری های قبلی غده تیروئید.
- حساسیت به اینترفرون آلفا -2b.
- کاربرد در دوران بارداری و شیردهی
کاربرد در دوران بارداری در مواردی امکان پذیر است که سود مورد انتظار مادر از خطر بالقوه جنین بیشتر باشد. زنان در سن باروری باید از روشهای معتبر پیشگیری از بارداری در هنگام استفاده از اینترفرون alfa-2b استفاده کنند.
در صورت لزوم ، استفاده در طول شیردهی باید در مورد خاتمه تصمیم گیری کند شیر دادن.
- اثر متقابل
اینترفرونها می توانند اثرات عصبی ، سلولی یا دلایل قلبی داروهایی را که قبلاً با آنها تجویز شده یا همزمان با آنها تجویز شده اند ، تقویت کنند.
- شرایط خاص
نباید در بیماران مبتلا به استفاده شود اختلالات روانی در بیهوشی با احتیاط در بیمارانی که سابقه بیماری ریوی دارند (از جمله بیماری انسداد مزمن ریوی) ، دیابت قندی با تمایل به کتواسیدوز ، افزایش لخته شدن خون (از جمله سابقه ترومبوفلبیت و آمبولی ریوی) ، حالات میلودپرس شدید
قبل از شروع و به طور سیستماتیک در طول دوره درمان ، باید کنترل عملکرد کبد ، الگوهای خون محیطی ، پارامترهای بیوشیمیایی خون ، کراتینین انجام شود. در طول دوره درمان ، باید هیدراتاسیون کافی از بدن انجام شود. در بیماران مبتلا به هپاتیت مزمن C ، سطح هورمون تحریک کننده تیروئید باید در طول درمان کنترل شود.
در هپاتیت مزمن B ، همراه با کاهش عملکرد مصنوعی کبد (که با کاهش سطح آلبومین یا افزایش زمان پروترومبین افزایش می یابد) ، سود مورد انتظار ارزیابی می شود و خطر احتمالی درمان. استفاده از پسوریازیس همزمان در مواردی توجیه می شود که سود مورد انتظار درمان از خطرات بالقوه بالاتر باشد. با همراهی دیابت قندی یا فشار خون بالا شریانی ، معاینه فوندوس قبل و حین درمان ضروری است. اگر سابقه نارسایی مزمن قلبی ، انفارکتوس میوکارد و / یا آریتمی قبلی یا موجود وجود داشته باشد ، درمان با اینترفرون alfa-2b باید تحت نظارت دقیق پزشک انجام شود.
- تأثیر توانایی رانندگی وسایل نقلیه و استفاده از مکانیسم ها
تأثیر بر توانایی رانندگی وسایل نقلیه و مکانیسم های کنترل در ابتدای درمان ، باید از بالقوه خودداری کنید گونه های خطرناک فعالیت هایی که نیاز به توجه بیشتر دارند ، واکنش های روانی حرکتی سریع ، تا دوره تثبیت عملکرد اینترفرون آلفا-2b.
Interferon alfa-2b به صورت پودر برای تزریق و محلول تزریق در لیست VED گنجانده شده است.
- تأثیر توانایی رانندگی وسایل نقلیه و استفاده از مکانیسم ها
فرم ، ترکیب و بسته بندی را منتشر کنید
تزریق شفاف ، بی رنگ.
برندگان:
0.5 میلی لیتر - آمپول (5) - بسته های بسته بندی شده سلول (1) - بسته های مقوایی.
0.5 میلی لیتر - آمپول (5) - بسته های بسته بندی شده سلول (2) - بسته های مقوایی.
0.5 میلی لیتر - بطری (1) - بسته های مقوایی.
0.5 میلی لیتر - بطری (5) - بسته های بسته بندی شده سلول (1) - بسته های مقوایی.
0.5 میلی لیتر - سرنگ های شیشه ای (1) - بسته های سلول کانتور (1) - بسته های مقوایی.
0.5 میلی لیتر - سرنگ های شیشه ای (1) - بسته های سلولی کانتور شده (3) - بسته های مقوایی.
0.5 میلی لیتر - سرنگ های شیشه ای (3) - بسته های سلولی کانتور (1) - بسته های مقوایی.
0.5 میلی لیتر - سرنگ های شیشه ای (3) - بسته های سلولی کانتور شده (3) - بسته های مقوایی.
تزریق شفاف ، بی رنگ.
برندگان: استات سدیم ، کلرید سدیم ، نمک سدیم سدیم اسید تترا استیک اسید تترا استیک ، tween-80 ، دکستران 40 ، آب d / i.
1 میلی لیتر - آمپول (5) - بسته های بسته بندی شده سلول (1) - بسته های مقوایی.
1 میلی لیتر - آمپول (5) - بسته های بسته بندی شده سلول (2) - بسته های مقوایی.
1 میلی لیتر - بطری (1) - بسته های مقوایی.
1 میلی لیتر - بطری (5) - بسته های بسته بندی شده سلول (1) - بسته های مقوایی.
1 میلی لیتر - سرنگ های شیشه ای (1) - بسته های سلولی کانتور شده (1) - بسته های مقوایی.
1 میلی لیتر - سرنگ های شیشه ای (1) - بسته بندی سلول های محفظه دار (3) - بسته های مقوایی.
1 میلی لیتر - سرنگ شیشه ای (3) - بسته های سلولی کانتور (1) - بسته های مقوایی.
1 میلی لیتر - سرنگ شیشه ای (3) - بسته های سلولی کانتور شده (3) - بسته های مقوایی.
گروه کلینیکی و دارویی
اینترفرون داروی آنتینوپلاستیک ، ضد ویروسی و سیستم ایمنی بدناثر دارویی
اینترفرون Altevir ® اثرات ضد ویروسی ، سیستم ایمنی بدن ، ضد پرولیفراتیو و ضد تومور دارد.
اینترفرون آلفا -2b با تعامل با گیرنده های خاص روی سطح سلول ، زنجیره ای پیچیده از تغییرات در داخل سلول را آغاز می کند ، از جمله القای سنتز تعدادی از سایتوکاین ها و آنزیم های خاص ، باعث اختلال در سنتز RNA ویروسی و پروتئین های ویروس در سلول می شود. نتیجه این تغییرات فعالیت ضد ویروسی و ضد پریشانی غیر اختصاصی همراه با پیشگیری از تکثیر ویروسی در سلول ، مهار تکثیر سلولی و اثرات سیستم ایمنی بدن اینترفرون است. Interferon alpha-2b روند ارائه آنتی ژن به سلولهای ایمنی را تحریک می کند ، توانایی تحریک فعالیت فاگوسیتیک ماکروفاژها و همچنین فعالیت سمیت سلولی سلولهای T و "سلولهای کشنده طبیعی" را دارد که در سیستم ایمنی ضد ویروسی نقش دارند.
از تکثیر سلولی به ویژه سلولهای توموری جلوگیری می کند. تأثیر مطلوبی بر سنتز برخی انکوژن ها دارد و منجر به مهار رشد تومور می شود.
فارماکوکینتیک
مکش
هنگامی که s / c یا i / m دولت اینترفرون alfa-2b ، فراهمی زیستی قابل دسترس آن از 80٪ تا 100٪ متغیر است. بعد از معرفی اینترفرون آلفا -2b ، T max در پلاسمای خون 4-12 ساعت ، T 1/2 - 2-6 ساعت است. 16-24 ساعت پس از تزریق ، اینترفرون نوترکیب در سرم خون تشخیص داده نمی شود.
متابولیسم
متابولیسم در کبد انجام می شود.
اینترفرونهای آلفا قادر به مختل کردن فرآیندهای متابولیک اکسیداتیو هستند و باعث کاهش فعالیت آنزیمهای کبدی میکروزومی سیستم سیتوکروم P450 می شوند.
برداشت از حساب
این ماده عمدتا توسط کلیه ها با فیلتراسیون گلومرولی دفع می شود.
نشانه های استفاده از دارو
به عنوان بخشی از درمان پیچیده در بزرگسالان:
- با هپاتیت مزمن ویروسی B و بدون علائم سیروز کبدی ؛
- با هپاتیت ویروسی مزمن C در صورت عدم وجود علائم نارسایی کبد (مونوتراپی یا درمان ترکیبی با ریباویرین)؛
- با پاپیلوماتوز حنجره؛
- با زگیل تناسلی.
- با لوسمی سلول مویی ، لوسمی میلوئید مزمن ، لنفوم غیر هوچکین ، ملانوما ، میلوما مولتیپل ، سارکوم کاپوسی در زمینه پیشگیری از ایدز ، سرطان پیشرونده کلیه.
رژیم دوز
s / c ، i / m و i / v را اعمال کنید. درمان باید توسط پزشک شروع شود. علاوه بر این ، با اجازه پزشک ، بیمار می تواند به خودی خود یک دوز نگهدارنده تزریق کند (در مواردی که دارو s / c یا i / m تجویز می کند).
هپاتیت مزمن B: Altevir ® به صورت زیر جلدی یا عضلانی با دوز 5-10 میلیون IU 3 بار در هفته به مدت 24-24 هفته تزریق می شود. در صورت عدم وجود دینامیک مثبت (طبق مطالعه DNA DNA ویروس هپاتیت B) درمان پس از 3-4 ماه استفاده متوقف می شود.
هپاتیت مزمن C: Altevir ® به صورت زیر جلدی یا عضلانی با دوز 3 میلیون ME 3 بار در هفته به مدت 24-48 هفته تجویز می شود. در بیمارانی که دوره ای مکرر از بیماری دارند و در بیمارانی که قبلاً تحت درمان با Interferon alfa-2b قرار نگرفته اند ، در صورت ترکیبی از درمان با ریبویرین ، اثر درمان افزایش می یابد. مدت زمان درمان ترکیبی حداقل 24 هفته است. در بیماران مبتلا به هپاتیت مزمن C و ژنوتیپ 1 ویروس با بار ویروس بالا ، باید Altevir درمانی به مدت 48 هفته انجام شود ، که در آنها تا پایان 24 هفته اول درمان ، ویروس هپاتیت C RNA در سرم تشخیص داده نمی شود.
پاپیلوماتوز حنجره: Altevir sub به صورت زیر جلدی با دوز 3 میلیون IU / m 2 3 بار در هفته تجویز می شود. درمان بعد از برداشتن جراحی (یا لیزر) از بافت تومور آغاز می شود. دوز با توجه به تحمل دارو انتخاب می شود. رسیدن به پاسخ مثبت ممکن است به مدت 6 ماه به درمان نیاز داشته باشد.
لوسمی سلول مویی: دوز توصیه شده Altevir برای تجویز زیر جلدی برای بیماران بعد از طحال یا بدون آن 2 میلیون IU / m 2 3 بار در هفته است. در اکثر موارد ، عادی سازی یک یا چند پارامتر خونریزی بعد از 1-2 ماه درمان اتفاق می افتد ، می توان زمان درمان را به 6 ماه افزایش داد. این رژیم دوز باید به طور مداوم رعایت شود ، مگر اینکه پیشرفت سریع بیماری یا شروع علائم عدم تحمل شدید دارویی مشاهده شود.
لوسمی میلوئید مزمن: دوز توصیه شده Altevir به عنوان مونوتراپی 4 تا 5 میلیون IU / m 2 در روز در روز در روز است. برای حفظ تعداد لکوسیتها ، ممکن است دوز 5 / 0-10 میلیون IU / m 2 لازم باشد. اگر این درمان به شما امکان دهد تعداد لکوسیت ها را کنترل کنید ، پس از آن برای حفظ بهبودی خون شناسی ، باید از داروی مورد استفاده در حداکثر دوز تحمل (4-10 میلیون IU / m 2 روزانه) استفاده شود. اگر درمان منجر به ترمیم جزئی خونریزی یا کاهش قابل توجهی از نظر بالینی در تعداد لکوسیت ها نگردد ، باید مصرف دارو پس از 8 تا 8 هفته قطع شود.
لنفوم غیر هوچکین: Altevir as به عنوان درمان کمکی در ترکیب با رژیم های شیمی درمانی استاندارد استفاده می شود. این دارو به صورت زیر جلدی با دوز 5 میلیون IU / m 2 3 بار در هفته به مدت 2-3 ماه تجویز می شود. دوز بسته به تحمل دارو باید تنظیم شود.
ملانوما: Altevir as به عنوان یک درمان کمکی در صورت وجود خطر بالای عود در بزرگسالان پس از برداشتن تومور استفاده می شود. Altevir ® به صورت داخل وریدی با دوز 15 میلیون IU / m2 5 بار در هفته به مدت 4 هفته تزریق می شود ، سپس در روز به مدت 48 هفته در روز با دوز 10 میلیون IU / m2 3 بار در هفته تزریق می شود. دوز بسته به تحمل دارو باید تنظیم شود.
مولتیپل میلوما: Altevir during در دوره دستیابی به بهبودی پایدار با دوز 3 میلیون IU / m 2 3 بار در هفته در روز تجویز می شود.
سارکوم کاپوسی با ایدز: دوز مطلوب مشخص نشده است. از این دارو می توان در دوزهای 10-12 میلیون IU / m2 / day s / c یا i / m استفاده کرد. در صورت تثبیت بیماری یا پاسخ به درمان ، درمان تا زمان وقوع رگرسیون تومور یا ترک دارو لازم است ادامه یابد.
سرطان کلیه:دوز و رژیم بهینه برقرار نشده است. توصیه می شود از داروی زیر جلدی در دوزهای 3 تا 10 میلیون IU / m 2 3 بار در هفته استفاده شود.
تهیه محلول برای تجویز داخل وریدی
حجم محلول Altevir مورد نیاز برای تهیه دوز مورد نیاز جمع آوری شده ، به 100 میلی لیتر محلول کلرید سدیم استریل 0.9٪ اضافه شده و بیش از 20 دقیقه تزریق می شود.
عوارض جانبی
واکنشهای عمومی: اغلب اوقات - تب ، ضعف (واکنش های وابسته به دوز و برگشت پذیر هستند ، در طی 72 ساعت پس از قطع درمان یا خاتمه آن ناپدید می شوند) ، لرز؛ کمتر اوقات ، ضعف.
از طرف سیستم عصبی مرکزی: اغلب اوقات - سردرد؛ كمتر - آستنی ، خواب آلودگی ، سرگیجه ، تحریک پذیری ، بی خوابی ، افسردگی ، افکار خودکشی و تلاش؛ به ندرت - عصبی بودن ، اضطراب.
از سیستم اسکلتی عضلانی: اغلب - میالژی؛ کمتر - آرتروالژی.
از دستگاه گوارش:اغلب اوقات - کاهش اشتها ، حالت تهوع؛ کمتر - استفراغ ، اسهال ، خشکی دهان ، تغییر در طعم. به ندرت - درد شکم ، سوء هاضمه؛ احتمالاً افزایش معکوس در فعالیت آنزیم های کبدی.
از طرف سیستم قلبی عروقی: اغلب - کاهش فشار خون. بندرت - تاکی کاردی.
واکنش های پوستی: كمتر - آلوپسی ، افزایش عرق؛ به ندرت - بثورات پوستی ، خارش پوست.
از سیستم خونریزی: لکوپنی برگشت پذیر احتمالی ، گرانولوسیتوپنی ، کاهش سطح هموگلوبین ، ترومبوسیتوپنی.
دیگران: به ندرت - کاهش وزن ، تیروئیدیت خود ایمنی.
موارد منع مصرف دارو
- سابقه بیماری قلبی عروقی شدید (نارسایی مزمن کنترل نشده قلبی ، انفارکتوس میوکارد اخیر ، آریتمی شدید قلبی).
- نارسایی شدید کلیوی و / یا کبدی (از جمله مواردی که در اثر وجود متاستازها ایجاد می شود).
- صرع ، و همچنین اختلالات شدید سیستم عصبی مرکزی ، به ویژه با افسردگی ، افکار خودکشی و تلاش (از جمله سابقه) بیان می شود.
- هپاتیت مزمن با سیروز جبران نشده کبد و در بیمارانی که تحت درمان با سرکوب کننده های سیستم ایمنی (به استثناء یک دوره کوتاه مدت کامل درمان GCS) تحت درمان قرار گرفته اند یا اخیراً تحت درمان قرار گرفته اند.
- هپاتیت خود ایمنی یا در غیر این صورت بیماری خودایمنی;
- درمان با سرکوب کننده های سیستم ایمنی پس از پیوند.
- بیماری غده تیروئید ، قابل کنترل با روشهای درمانی معمول نیست.
- بیماری های ریوی جبران نشده (از جمله COPD).
- دیابت شیرین جبران نشده؛
- انعقاد بیش فعالی (از جمله ترومبوفلبیت ، آمبولی ریوی).
- میلودودپرس شدید؛
- بارداری؛
- دوره شیردهی (شیردهی)؛
- حساسیت به اجزای دارویی.
استفاده از دارو در دوران بارداری و شیردهی
این دارو در دوران بارداری و شیردهی (شیردهی) منع مصرف دارد.
درخواست تخلف از عملکرد کبد
برنامه کاربردی برای اختلال در عملکرد کلیه
این دارو در نارسایی شدید کلیوی و یا کبدی منع مصرف دارد (از جمله مواردی که در اثر وجود متاستاز ایجاد می شود).
دستورالعمل های ویژه
قبل از درمان با Altevir برای هپاتیت مزمن ویروسی B و C ، بیوپسی کبد برای ارزیابی میزان آسیب کبدی (علائم یک روند التهابی فعال و / یا فیبروز) توصیه می شود. اثر درمان هپاتیت مزمن C با درمان ترکیبی با Altevir و ribavirin افزایش می یابد. استفاده از Altevir در ایجاد سیروز کبد جبران نشده و یا کما کبدی مؤثر نیست.
در صورت بروز عوارض جانبی در طول درمان با Altevir ، میزان مصرف دارو باید 50٪ کاهش یابد یا دارو به طور موقت تا زمان ناپدید شدن از بین برود. اگر یک اثرات جانبی پس از کاهش دوز ، مجدداً ظاهر شود یا دوباره ظاهر شود ، یا پیشرفت بیماری مشاهده شود ، پس از آن باید درمان با Altevir قطع شود.
اگر تعداد پلاکت ها زیر 50x10 9 / L باشد یا تعداد گرانولوسیت ها زیر 9/0 75 75/0 باشد ، توصیه می شود دوز آلتویر را 2 بار با آزمایش خون بعد از 1 هفته کاهش دهید. اگر این تغییرات ادامه داشته باشد ، باید دارو را لغو کرد.
اگر سطح پلاکت ها زیر 25x10 9 / l کاهش یابد یا سطح گرانولوسیت ها زیر 0/0/5/9 لیتر باشد ، توصیه می شود پس از گذشت 1 هفته از داروی Altevir با کنترل خون استفاده کنید.
در بیمارانی که داروهای اینترفرون آلفا 2b دریافت می کنند ، می توان آنتی بادی را در سرم خون تشخیص داد که فعالیت ضد ویروسی آن را خنثی می کند. تقریباً در همه موارد ، تیتر آنتی بادی کم است ، ظاهر آنها منجر به کاهش اثربخشی درمان یا بروز سایر اختلالات خود ایمنی نمی شود.
مصرف بیش از حد
اطلاعات در مورد مصرف بیش از حد Altevir ® ارائه نشده است.
تداخلات دارویی
اثر متقابل دارو بین Altevir و سایر داروها به طور کامل بررسی نشده است. Altevir باید با احتیاط به همراه قرص های خواب آور و آرام بخشداروهای مسکن و داروهای ضد احتقان:
با قرارگیری همزمان Altevir و تئوفیلین ، غلظت دومی در سرم خون باید کنترل شود و در صورت لزوم رژیم دوز تغییر کند.
هنگام استفاده از Altevir در ترکیب با داروهای شیمی درمانی (سیتارابین ، سیکلوفسفامید ، دوکسوروبیسین ، تنیپوزید) ، خطر اثرات سمی افزایش می یابد.
شرایط توزیع داروخانه ها
این دارو با تجویز در دسترس است.
شرایط و دوره های ذخیره سازی
این دارو باید مطابق با SP 3.3.2-1248-03 در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد در دسترس کودکان قرار نگیرد. یخ نزن عمر مفید 18 ماه است.
حمل و نقل در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد؛ یخ نزن
"این اختراع مربوط به مهندسی ژنتیک ، بیوتکنولوژی ، پزشکی ، داروسازی است. جدید پلاسمید نوترکیب نوترکیب pSX50 جدید نوترکیب که کد کننده سنتز لکوسیت آلفا-2b اینترفرون انسانی است ، بیان آن تحت کنترل پروموترهای لاکتوز و تریپتوفان و پایانه رونویسی است. در نتیجه تبدیل سلولهای گیرنده E. coli BL21 گیرنده با DNA پلاسمید نوترکیب pSX50 ، باکتری E. coli SX50 بدست آمد - تولید کننده لکوسیت انسانی نوترکیب آلفا-2b اینترفرون با بازده حداکثر 0.9-1.0 گرم آلفا-2b اینترفرون با 1 لیتر محیط کشت. روش بدست آوردن اینترفرون نوترکیب آلفا 2b مبتنی بر استفاده از سویه نوترکیب ایجاد شده از E. coli SX50 و فراهم آوردن کشت عمیق آن بر روی یک ماده مغذی با محتوای کاهش یافته تریپتوفان با افزودن مداوم بسترهای مغذی در طول بیوسنتز ، تخریب مکانیکی سلولهای میکروارگانیسم در فشار بالا ، انحلال پروتئین جمع شده در محلول غلیظ هیدروکلراید گوانیدین و به دنبال آن تجدید مجدد اینترفرون در محلولهای بافر فیزیولوژیکی در حضور عوامل حاشیه ای و تصفیه آن با استفاده از تصفیه کروماتوگرافی سه مرحله ای از اینترفرون بر روی رزین هایی مانند Chelating Sepharose Fast Flow بی حرکت با یون های مس +2 ، کروماتوگرافی تبادل یونی و چنین ژل های رزمی کروماتوگرافی فیلتراسیون بر روی رزین های نوع Superdex 75 این روش با استفاده از داده های الکتروفورز تحت شرایط کاهش و غیر کاهش می تواند ماده ای از اینترفرون با خلوص بیش از 99٪ را بدست آورد. هنگام رنگ آمیزی ژل ها با نقره و بیش از 98٪ مطابق با RF HPLC و عاری از پیروژن (آزمایش LAL) در مقادیر حداقل 400-800 میلی گرم از 1 لیتر محیط کشت. 3 ن. و 3 کریستال f- کریستال ، 6 بیمار.
نقشه های ثبت اختراع RF 2242516
این اختراع مربوط به مهندسی ژنتیک است داروها، بیوتکنولوژیکی ، به دست آمده ، به عنوان مثال ، به روش های تولید صنعتی لکوسیت انسانی نوترکیب اینترفرون آلفا -2b برای اهداف پزشکی (از این پس اینترفرون) ، و همچنین به سویه های نوترکیب تولید کننده اشرشیا کولی (E. coli) و DNA پلاسمیدی که رمزگذاری سنتز اینترفرون را به دست می آورد ، به دست آمد.
اینترفرون ها مولکول های پروتئین با وزن مولکولی 15000 تا 21،000 دالتون هستند که در پاسخ به عفونت ویروسی یا سایر عوامل بیماری زا توسط سلول ها تولید و ترشح می شوند. سه گروه اصلی از اینترفرون ها وجود دارد: آلفا ، بتا و گاما. به خودی خود ، این گروه ها یکدست نیستند و ممکن است حاوی چندین گونه مولکولی مختلف اینترفرون باشند. بنابراین ، بیش از 14 گونه ژنتیکی آلفا اینترفرون شناسایی شده است که مورد توجه بوده و در پزشکی به عنوان عوامل ضد ویروسی ، ضد پرولیفراتیو و سیستم ایمنی بدن بطور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد.
روشهای شناخته شده برای تولید اینترفرون لکوسیت انسانی از لکوسیت ها خون اهدا کرد ناشی از ویروس ها و سایر عوامل ایجاد کننده ویروس انسانی (SU1713591 ، RU 2066188 ، RU 2080873).
مهمترین نقطه ضعف این روش ها برای تولید اینترفرون ها ، احتمال آلودگی محصول نهایی به ویروس های انسانی مانند هپاتیت B و ویروس C ، ویروس نقص ایمنی و غیره است.
در حال حاضر ، روش به دست آوردن اینترفرون توسط سنتز میکروبیولوژیکی به عنوان امیدوار کننده تر شناخته می شود ، و این امکان را می دهد که محصول مورد نظر را با بازده قابل توجهی بالاتر از یک ماده اولیه نسبتاً ارزان دریافت کنید. رویکردهای مورد استفاده در این حالت امکان ایجاد گونه هایی از ژن ساختاری را فراهم می کند که برای بیان باکتری ها بهینه باشند و همچنین عناصر نظارتی که بیان آن را کنترل می کنند.
از سازه های مختلف گونه های Pichia pastoris ، Pseudomonas putida و Escherichia coli بعنوان میکروارگانیسم های شروع استفاده می شود.
ضرر در استفاده از P. pastoris به عنوان تولید کننده اینترفرون (JN Garcia، JA Aguiar et al. // بیان سطح بالای انسانی IFN-2b در Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada، 12 (3)، 152-155، 1995)، شرایط بسیار دشوار برای تخمیر این نوع مخمر ، نیاز به حفظ شدت غلظت القا کننده ، به ویژه متانول ، در فرآیند بیوسنتز است. مضرات استفاده از Ps. putida (SU1364343، SU1640996، SU1591484، RU1616143، RU2142508) پیچیدگی فرآیند تخمیر در سطح بیان پایین (10 میلی گرم اینترفرون در هر لیتر محیط کشت) است. بارور تر استفاده از سویه های اشرشیا کولی است (سمینین. انکول. ، 1997 ، یون) ؛ 24 (3 پمپ 9): S9-41-S9-51).
تعداد زیادی پلاسمید و سویه باکتری E. coli ایجاد شده بر اساس آنها بیان کننده اینترفرون شناخته شده اند: گونه های E. coli ATCC 31633 و 31644 با پلاسمیدها Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 یا Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515) ، E. coli strain pINF-AP2 (SU 1312961) ، E. coli strain pINF-F-Pa (AU 1312962) ، E. E. coli SG 20050 با پلاسمید p280 / 21FN (Kravchenko V.V. و همکاران شیمی بیو ارگانیک ، 1987 ، در مقابل 13 ، شماره 9 ، صص 1186-1193) ، کرنش E. coli SG 20050 با پلاسمید pINF14 (SU 1703691) ، E. coli SG 20050 را با پلاسمید pINF16 (2054041 RU) و مضرات فن آوری های مبتنی بر استفاده از این گونه ها عدم ثبات آنها و همچنین عدم بیان سطح کافی اینترفرون است.
در کنار خصوصیات سویه های مورد استفاده ، اثر بخشی فرایند تا حد زیادی به فناوری مورد استفاده برای جداسازی و تصفیه اینترفرون بستگی دارد.
یک روش شناخته شده برای تولید اینترفرون ، از جمله کشت سلول های PS است. putida ، از بین بردن زیست توده ، درمان با پلی اتیلن آمین ، شکنش با سولفات آمونیوم ، کروماتوگرافی آبگریزی در فنیل سیلوکروم C-80 ، کسری pH لیزات ، غلظت و دیافیلتراسیون آن ، کروماتوگرافی تبادل یونی بر روی سلولز DE-52 ، شستشو در گرادیان pH ، الیوز تبادل یونی در سلول -52 ، غلظت با عبور از طریق یک کاست فیلتر و فیلتراسیون ژل در Sephadex G-100 (SU 1640996). ضرر این روش علاوه بر تخمیر پیچیده چند مرحله ای ، فرایند چند مرحله ای در بدست آوردن محصول نهایی است.
همچنین روش تولید اینترفرون از جمله کشت باکتری E. coli SG 20050 / pIF16 ، در LB-broth در فلاسک ها در یک شاکر ترموست شده ، سانتریفیوژ زیست توده ، شستشوی آن با محلول بافر و فراصوت برای از بین بردن سلول ها شناخته شده است. لیزات حاصل از سانتریفوژ ، شسته شده با محلول اوره 3M در بافر ، در محلول کلرید گوانیدین در بافر ، سونیت ، سانتریفیوژ ، سولفیتولیز اکسیداتیو ، دیالیز در برابر 8M اوره ، تجدید مجدد و کروماتوگرافی دو مرحله ای نهایی در سلولز CM-52 و Sephadec G-50 حل می شود. RU 2054041). مضرات این روش ، بهره وری نسبتاً کم آن در مراحل اصلی فرآیند جداسازی و تصفیه است. به طور خاص ، این امر در مورد اولتراسونیک محصول ، دیالیز و سولفیتولیز اکسیداتیو که منجر به بی ثباتی عملکرد اینترفرون و همچنین عدم امکان استفاده از این روش برای تولید صنعتی اینترفرون می شود ، صدق می کند.
به عنوان نزدیکترین آنالوگ (نمونه اولیه) می توان روشی برای تولید اینترفرون لکوسیت انسانی نشان داد که شامل کشت یک سویه نوترکیب E. coli ، انجماد زیست توده حاصل در دمای بالاتر از -70 درجه سانتیگراد ، یخ زدایی ، از بین بردن سلولهای میکروارگانیسم با لیزوزیم ، از بین بردن DNA و RNA می باشد. به لیزات DNase و تصفیه فرم نامحلول جدا شده اینترفرون با شستن با محلول بافر با مواد شوینده ، حل محلول اینترفرون در محلول هیدروکلراید گوانیدین ، \u200b\u200bتجدید ساختار و تصفیه یک مرحله ای توسط کروماتوگرافی تبادل یونی. به عنوان تولید کننده ، باکتری E. coli SS5 با استفاده از پلاسمید نوترکیب pSS5 حاوی سه پروموتر: P lac ، P t7 و P trp و ژن اینترفرون آلفا با تعویض نوکلئوتید معرفی شده استفاده می شود.
بیان اینترفرون توسط سویه E. coli SS5 حاوی این پلاسمید توسط سه پروموتر کنترل می شود: P lac ، P t7 و P trp. میزان بیان اینترفرون حدود 800 میلی گرم به ازای هر لیتر سوسپانسیون سلولی است (RU 2165455).
ضرر این روش تولید کم در استفاده از تخریب آنزیمی سلول ها ، DNA و RNA میکروارگانیسم ها و تصفیه کروماتوگرافی یک مرحله ای از اینترفرون است. این امر باعث عدم ثبات روند آزاد سازی اینترفرون ، منجر به کاهش کیفیت آن می شود و امکان استفاده از طرح فوق را برای تولید صنعتی اینترفرون محدود می کند. از مضرات این پلاسمید و کرنش بر اساس آن استفاده از پلاسمید یک پروموتر قوی کنترل نشده فاکتور T7 در فشار E. coli BL21 (DE3) است که در آن ژن پلیمراز T7 RNA در زیر پروموتور اهرم لاک قرار دارد و که همیشه "جریان دارد". در نتیجه ، سنتز اینترفرون به طور مداوم در سلول اتفاق می افتد ، که منجر به تفکیک پلاسمید و کاهش زنده ماندن سلول های کرنش و در نتیجه - کاهش در عملکرد اینترفرون می شود.
هدف از این اختراع ساختن نوعی تولیدکننده نوترکیب E. coli صنعتی با استفاده از یک DNA پلاسمید نوترکیب جدید با سطح بالایی از بیوسنتز اینترفرون می باشد ، و ایجاد یک فناوری صنعتی موثر برای تولید یک ماده اینترفرون پزشکی مطابق با کیفیت با "اروپای فارماکوپه" برای ماده آلفا-2 اینترفرون است.
این مشکل با ایجاد پلاسمید نوترکیب پلاسمیدی DNA pSX50 و Escherichia coli SX50 ، که در مجموعه تمام روسیه از سویه های صنعتی شرکت دولتی یونان فدرال GosNII Genetics با شماره VKPM B-8550 سپرده شده ، حل شد.
و همچنین روشی برای تولید آلفا 2b اینترفرون نوترکیب مبتنی بر استفاده از یک سویه نوترکیب E. coli SX50 و فراهم کردن زیر کشت آن در یک ماده مغذی با کاهش محتوای تریپتوفان با افزودن مداوم بسترهای مغذی در طول بیوسنتز ، تخریب مکانیکی سلولهای میکروارگانیسم در فشار بالا ، انحلال جمع پروتئین در محلول غلیظ هیدروکلراید گوانیدین ، \u200b\u200bو به دنبال آن تجدید مجدد اینترفرون در محلولهای بافر فیزیولوژیکی با حضور عوامل حاشیه ای و تصفیه کروماتوگرافی سه مرحله ای از اینترفرون بر روی رزینهای نوع سریع جریان Flat Chelating Sepharose ، بی حرکت با یون های مس +2 ، کروماتوگرافی تبادل یونی و ژل نوع CM کروماتوگرافی روی رزین Superdex 75.
مطابق این اختراع ، یک پلاسمید نوترکیب نوترکیب نوترکیب جدید pSX50 نوترکیب جدید وجود دارد که سنتز اینترفرون لکوسیت انسانی آلفا-2b را رمزگذاری می کند ، بیان آن تحت کنترل پروموترهای لاکتوز و تریپتوفان و پایانه رونویسی است. Plasmid pSX50 دارای 3218 جفت پایه (bp) است و با قطعات زیر مشخص می شود:
دنباله از 1 نوکلئوتید به 176 نوکلئوتید (NT) شامل یک قطعه DNA 176 جفت باز حاوی پروموتور تریپتوفان (P TRP).
دنباله از 177 ن. تا سال 194 ن. شامل یک قطعه DNA مصنوعی با 18 bp است که شامل توالی Shine Delgarno است که مسئول شروع ترجمه است.
جانشینی از سال 195 میلادی به 695 ن. شامل یک قطعه DNA از 501 bp است که حاوی توالی ژن اینترفرون با تعویض نوکلئوتید زیر است: در موقعیت 37 ، تغییر از A به C ، در موقعیت 39 ، تغییر از G به T ، در موقعیت 40 ، تغییر از A به C ، در موقعیت 42 ، تغییر از G به T ، در موقعیت 67 ، جایگزین A با C ، در موقعیت 69 جایگزین G با T ، در موقعیت 70 به جای A با C ، در موقعیت 72 جایگزین A با T ، در موقعیت 96 جایگزین G با A ، در موقعیت 100 جایگزین A با C ، c در موقعیت 102 تغییر A به T ، در موقعیت 114 تغییر A به C ، در موقعیت 120 تغییر C به G ، در موقعیت 126 تغییر G به A ، در موقعیت 129 تغییر G به A ، در موقعیت 330 تغییر C به G ، در موقعیت 339 جایگزینی G توسط A ، در موقعیت 342 جایگزینی G توسط A ، در موقعیت 487 جایگزینی A توسط C ، در موقعیت 489 جایگزینی A توسط T ، در موقعیت 495 جایگزینی G توسط A؛
دنباله از 696 ن. تا 713 N. شامل یک قطعه DNA مصنوعی 18 جفت وزنی است که شامل یک پلی لینر مصنوعی است.
دنباله از 714 ن. تا سال 1138 ه شامل یک قطعه DNA از پلاسمید pKK223-3 با 4129 نانومتر است. به 4553 ن. اندازه 425 جفت باز ، حاوی توالی پایان دهنده رونویسی دقیق rrnBT 1 T 2؛
دنباله از سال 1139 ه به سال 1229 ه شامل یک قطعه DNA از پلاسمید pUC19 با 2487 نانومتر است. تا 2577 ن. اندازه 91 جفت باز ، حاوی پروموتر ژن β- لاکتوماز (مقاومت ژن در برابر آمپی سیلین - Amp R).
دنباله از سال 1230 ه تا سال 2045 ن. شامل یک قطعه DNA پلاسمید pUC4K با 720 نانولوله است. تا سال 1535 ه اندازه 816 جفت باز ، حاوی منطقه ساختاری ژن کان.
دنباله از سال 2046 ه به 3218 ن. شامل یک قطعه DNA پلاسمید pUC19 از 1625 تا 453 نانومتر است. اندازه 1173 جفت باز ، حاوی توالی مسئول تکثیر پلاسمید (اوری) و پروموتور lac (P lac) است.
شکل 1-5 نقشه های ساختاری و نقشه فیزیکی پلاسمید pSX50 را نشان می دهد.
شکل 6 دنباله کامل نوکلئوتید را برای پلاسمید pSX50 نشان می دهد.
سویه Escherichia coli SX50 با تبدیل سلولهای اشرشیا کولی BL21 با پلاسمید pSX50 با استفاده از فناوری مهندسی ژنتیک سنتی بدست آمد. E. E. coli SX50 با ویژگی های زیر مشخص می شود.
ویژگی های فرهنگی و مورفولوژیکی
سلول های کوچک ، مستقیم ، ضخیم میله ای شکل ، گرم منفی ، غیر ورزشی هستند. سلول ها در محیط مواد مغذی ساده رشد خوبی می کنند. هنگام رشد روی آگار Difco ، مستعمرات گرد ، صاف ، محدب ، ابری ، براق ، خاکستری با لبه های صاف شکل می گیرد. هنگام رشد در محیط مایع (در یک محیط حداقل با گلوکز یا در آب مایع LB) ، آنها شدید و حتی مه را تشکیل می دهند.
علائم فیزیکی و بیولوژیکی
ایروبی دامنه دما برای رشد 4-42 درجه سانتی گراد با pH بهینه 6.5-7.5 است.
هر دو نمک معدنی به شکل آمونیوم و نیترات و ترکیبات آلی به شکل اسیدهای آمینه ، پپتون ، تریپتون ، عصاره مخمر و غیره به عنوان منبع نیتروژن استفاده می شوند.
از اسیدهای آمینه ، گلیسیرین ، کربوهیدرات ها به عنوان منبع کربن استفاده می شود. مقاومت آنتی بیوتیکی. سلولها مقاومت به كانامایسین را نشان می دهند (حداكثر 100 میكروگرم در میلی لیتر).
سویه Escherichia coli 8X50 تولید کننده اینترفرون است.
روش ، شرایط و ترکیب محیط برای ذخیره سازی کرنش
در L-arape با افزودن كانامایسین به غلظت 20 میكروگرم در میلی لیتر در روغن ، در مایع L-حاوی 15٪ گلیسرول و آنتی بیوتیك های مربوطه در آمپول ها با دمای منهای 70 درجه سانتیگراد ، در حالت لیوفیلیزه در آمپول ها با دمای حداكثر 4 درجه سانتیگراد قرار می گیرند.
باکتری Escherichia coli SX50 توسط راهنمای Bergi (1974) به عنوان گونه گونه Escherichia coli شناخته شده است.
روش تولید صنعتی اینترفرون آلفا 2b
یکی از ویژگی های روش پیشنهادی توسعه فناوری است که به شما امکان می دهد تا اینترفرون را از فرم غیر محلول که در طی تخمیر انباشته می شود ، جدا کنید و این امکان را می دهد تا بطور قابل توجهی طرح فن آوری فرآیند جداسازی را ساده کرده و بازده محصول مورد نظر را افزایش دهید.
این روش شامل کشت باکتری Escherichia coli SX50 در یک ماده مغذی است ، با افزودن مداوم بسترهای مغذی ، ترجیحاً گلوکز و عصاره مخمر ، در فرایند بیوسنتز ، ترجیحا با کاهش محتوای تریپتوفان ، تخریب مکانیکی سلولهای میکروارگانیسم با فشار زیاد 700-900 بار ، انحلال اینترفرون در بافر محلول هیدروکلراید گوانیدین ، \u200b\u200bتجدید مجدد اینترفرون در محلول های بافر فیزیولوژیکی با حضور عوامل حاشیه ساز ، و به دنبال آن تصفیه کروماتوگرافی سه مرحله ای از اینترفرون بر روی رزینهای Chelating Sepharose Fast Flow بی حرکت با یونهای مس +2 ، کروماتوگرافی تبادل یونی روی رزینهای تبادل یونی ژل نوع CM سفاروز رزین هایی مانند Superdex 75.
شرایط بهینه برای مراحل انفرادی دریافت اینترفرون به شرح زیر است:
تخمیر با افزودن مداوم بسترها در طی کل فرآیند انجام می شود که منجر به آن می شود سطح بالا بیان اینترفرون؛
تخریب سلول ها در یک جداکننده از نوع Gaulin با فشار 900 بار انجام می شود.
از بین بردن اجزای محلول سلولی محلول (DNA ، RNA ، پروتئین ها ، لیپوپلی ساکاریدها و غیره) با شستن فرم نامحلول اینترفرون با محلول های بافر حاوی مواد شوینده (Triton XI00 ، اوره و غیره) انجام می شود.
رسوب حاصل از حاوی اینترفرون در محلول بافر 6M هیدروکلراید گوانیدین حل می شود.
تجدید مجدد اینترفرون در یک محلول بافر فیزیولوژیکی حاوی عوامل حائل کننده انجام می شود.
تصفیه کروماتوگرافی سه مرحله ای از اینترفرون روی Chelating Sepharose Fast Flow انجام می شود ، که توسط یون های مس +2 بی حرکت می شود ، روی یک رزین تبادل کاتیونی سریع جریان Sepharose CM و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل روی رزین نوع Superdex 75 انجام می شود.
پس از هر یک از تصفیه کروماتوگرافی ، تصفیه عقیم سازی از طریق فیلترهای بدون پیروژن با اندازه منافذ 0.22 میکرومتر انجام می شود.
عملکرد اینترفرون در نتیجه استفاده از روش توصیف شده تقریباً 400-800 میلی گرم اینترفرون از 1 لیتر محیط کشت است. کیفیت محصول به دست آمده مطابق با استانداردها و الزامات "فارماکوپه اروپایی" برای ماده آلفا -2b اینترفرون است.
تفاوتهای اساسی بین روش پیشنهادی و نمونه اولیه عبارتند از:
استفاده از یک سازه کرنش با بهره وری بالاتر ، که امکان دستیابی به مقدار بیشتری از اینترفرون از 1 لیتر محیط کشت در طول بیوسنتز را ممکن می سازد.
استفاده از تخریب مکانیکی مؤثر زیست توده سلولی ، که به شما امکان می دهد عصاره خالص تر از فرم نامحلول اینترفرون را در مدت زمان کوتاه تر و تلفات کمتری بدست آورید.
استفاده از محلول های بافر فیزیولوژیکی در طول ترمیم مجدد در حضور عوامل حاشیه ای باعث افزایش بازده به درستی ترمیم شده از اینترفرون می شود.
تصفیه کروماتوگرافی سه مرحله ای از اینترفرون امکان دستیابی به ماده اینترفرون با خلوص بیش از 99٪ با توجه به الکتروفورز را در شرایط کاهش و عدم کاهش هنگام رنگ آمیزی ژل ها با نقره و بیش از 98٪ مطابق با RF HPLC و عملا عاری از پیروژن ها (آزمایش LAL) فراهم می کند.
ماهیت و مزایای گروه ادعا شده از اختراعات با مثالهای زیر نشان داده شده است.
مثال 1. ساخت پلاسمید نوترکیب pSX50
روش ساخت پلاسمید pSX50 مراحل زیر را شامل می شود:
ساخت بردار پلاسمید pSX10؛
1. ساخت پلاسمید pSX3 (2641 جفت باز)
2. ساخت و ساز پلاسمید بردار pSX10 (2553 جفت باز)
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX41 (3218 جفت باز)؛
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX43 (3218 جفت باز)؛
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX45 (3218 جفت باز)؛
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX50 (3218 جفت باز).
ساخت بردار پلاسمید pSX10
پلاسمید بردار pSX10 یک بردار pUC19 است که در آن توالی کد کننده ژن بتا-لاکتوماز ارائه مقاومت آمپی سیلین توسط دنباله کدگذاری ژن کان جایگزین شده و حاوی پایانه رونویسی از پلاسمید pKK223-3 است.
ساخت وکتور پلاسمید pSS10 در دو مرحله انجام می شود:
به دست آوردن پلاسمید pSX3 (2641 جفت باز) ، که یک پلاسمید pUC19 است ، که در آن منطقه کد کننده ژن آمپ با منطقه کد کننده ژن kan جایگزین می شود.
به دست آوردن پلاسمید باد pSX10 (2553 جفت باز) ، که یک پلاسمید pSX3 است ، که در آن یک قطعه DNA که کد کننده پایانه رونویسی rBT 1 T 2 است ، در پشت سایت BamHI وارد می شود.
برای به دست آوردن پلاسمید pSX3 ، پنج دور تقویت DNA توسط PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) انجام می شود. در دور اول ، با استفاده از DNA پلاسمید pUC19 به عنوان یک الگوی ، تقویت یک قطعه DNA از 1828 جفت باز انجام می شود. (قطعه PU1-PU2) با استفاده از آغازگرها:
این و واکنش PCR متعاقب آن تحت شرایط زیر انجام می شود: 20 میلی متر Tis-HCl ، pH 8.8 ، 10 میلی متر (NH4) 2 SO 4 ، 10 میلی متر KCl ، 2 tM MgCl 2 ، 0.1 T Triton X100 ، 0.1 میلی گرم در میلی لیتر BSA ، 0.2 mM از هر dNTP ، 1.25 واحد. Pfu DNA پلیمراز ، DNA 100 نانوگرم. فرآیند تقویت شامل مراحل زیر است: گرم کردن در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ، 35 چرخه PCR (30 ثانیه در دمای 95 درجه سانتیگراد ، 30 ثانیه در 56 درجه سانتیگراد ، 2 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد) و جوجه کشی به مدت 10 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد. پس از تقویت (و پس از تقویت پس از آن) ، قطعه DNA با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز 1٪ انجام می شود. در طی دور دوم و سوم ، با استفاده از DNA پلاسمید pUC4K به عنوان یک الگوی ، یک قطعه DNA 555 جفت باز تقویت می شود. (قطعه KM1-KM2) با استفاده از آغازگرها:
و تقویت یک قطعه DNA 258 جفت باز (KMZ-KM4) با آغازگرها
در دور پنجم PCR قطعات (PU1-PU2) و (KM1-KM4) در شرایط زیر ترکیب می شوند: گرم کردن در 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ، 5 چرخه PCR (30 ثانیه 95 درجه سانتیگراد ، 30 ثانیه 56 درجه سانتیگراد ، 10 دقیقه 72 درجه ج) و جوجه کشی به مدت 10 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد. DNA به دست آمده پس از آخرین PCR مستقیماً به سلولهای باکتری E. coli DH5 تبدیل می شود و در محیط LA حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین بذر می رود. پس از جوجه کشی به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد ، کلون ها از ریخته می شوند ، DNA پلاسمید جدا شده و تجزیه و تحلیل محدودیت انجام می شود. در نتیجه ، پلاسمید pSX3 با اندازه 2641 جفت باز به دست می آید.
برای به دست آوردن بردار پلاسمید pSX10 ، سه دور تقویت DNA توسط PCR انجام می شود. در دور اول ، با استفاده از DNA پلاسمید pSX3 به عنوان یک الگوی ، تقویت یک قطعه DNA از 2025 جفت باز انجام می شود. (قطعه 10.1-10.2) با استفاده از آغازگرها:
در دور دوم ، با استفاده از DNA پلاسمید pKK223-3 به عنوان یک الگوی ، تقویت یک قطعه DNA از 528 جفت باز انجام می شود. (قطعه KK1-KK2) با استفاده از آغازگرها:
در دور سوم PCR ، قطعات (10.1-10.2) و (KK1-KK2) با شرایط زیر ترکیب می شوند: گرم کردن در 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ، 5 چرخه PCR (30 ثانیه 95 درجه سانتیگراد ، 30 ثانیه 56 درجه سانتیگراد ، 10 دقیقه 72 درجه ج) و جوجه کشی به مدت 10 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد. DNA به دست آمده پس از آخرین PCR به طور مستقیم به سلولهای باکتری E. coli DH5 تبدیل می شود و در محیط LA حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین بذر می رود. پس از جوجه کشی به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد ، کلون ها از ریخته می شوند ، DNA پلاسمید جدا شده و تجزیه و تحلیل محدودیت انجام می شود. در نتیجه ، پلاسمید pSX10 از 2553 جفت باز به دست می آید.
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX41
پلاسمید نوترکیب pSX41 یک قطعه DNA Hind III - BamHI از وکتور پلاسمید pSX3 (2529 bp) است ، Hind III یک قطعه DNA EcoRI 168 bp است که کد کننده پروموتر اکتری تریپتوفان E. coli (P trp) ، EcoRI-XbaI است قطعه DNA مصنوعی از 20 جفت وزنی توالی SD که رمزگذاری کننده SD (Shine-Delgarno) و قطعه DNA XbaI-BamHI از 501 جفت باز است که کد کننده ژن اینترفرون آلفا 2b انسانی است.
برای به دست آوردن Hind III - BamHI ، قطعه DNA وکتور پلاسمید pSX3 (2529 جفت باز) ، DNA پلاسمید pSX3 با آنزیم های محدود HindIII و BamHI درمان می شود و پس از آن ، تصفیه الکتروفورز در ژل آگارز 1٪ انجام می شود. قطعه DNA هین III EcoRI با 168 جفت باز کد کننده پروموتر اپراتور تریپتوفان (P TRP) توسط PCR با استفاده از کل DNA DNA coli به عنوان یک الگوی و آغازگرهای TRP1 و PRP2 بدست می آید ، و پس از آن پردازش قطعه تقویت شده با آنزیم های محدود Hindlll و EcoRI:
برای به دست آوردن EcoRI-Xbal یک قطعه مصنوعی 20 جفت باز DNA که کد کننده دنباله SD (Shine-Delgarno) است ، الیگونوکلئوتیدهای مکمل زیر سنتز می شوند:
یک قطعه DNA 501 bp XbaI-BamIII که کد کننده ژن اینترفرون آلفا 2b انسانی است توسط PCR با استفاده از DNA کل انسان به عنوان یک الگوی و آغازگرهای IFN1 و IFN2 بدست می آید ، و پس از آن پردازش قطعه تقویت شده با آنزیم های محدود کننده Xbal و BamIII:
سپس قطعات پاک شده الکتروفورز ترکیب شده و با آنزیم فاژ T4 فاژ پیوند می خورند ، DNA به سلولهای باکتری E. coli DH5 تبدیل می شود و در محیط LA حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین آبکاری می شود. پس از جوجه کشی به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد ، کلون ها از غربالگری خارج می شوند ، DNA پلاسمید جدا می شود ، تجزیه و تحلیل محدودیت انجام می شود و ساختار اولیه DNA مشخص می شود. در نتیجه ، پلاسمید 3218 جفت باز pSX41 بدست می آید. در مرحله بعد ، جهش زایی مرحله به مرحله از ژن اینترفرون برای افزایش سطح بیان محصول مورد نظر انجام می شود. جهش ژن اینترفرون شامل جایگزینی سه قلو است که به ندرت در E. coli یافت می شود ، با کدگذاری اسیدهای آمینه مربوطه ، با سه گانه که اغلب در E. coli یافت می شود ، همان اسیدهای آمینه را کدگذاری می کند. جهش زایی DNA ژن اینترفرون توسط PCR انجام می شود.
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX43
برای به دست آوردن پلاسمید نوترکیب pSX43 ، یک دور تقویت DNA توسط PCR با استفاده از DNA پلاسمید pSX41 به عنوان یک الگوی و آغازگرهای IFN3 و IFN4 انجام می شود:
PCR تحت شرایط زیر انجام می شود: گرم کردن در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ، 20 چرخه PCR (30 ثانیه 95 درجه سانتیگراد ، 30 ثانیه 56 درجه سانتیگراد ، 10 دقیقه 72 درجه سانتیگراد) و جوجه کشی به مدت 20 دقیقه با 72 درجه سانتیگراد. DNA به دست آمده پس از PCR به طور مستقیم به سلولهای باکتری E. coli DH5 تبدیل شده و روی محیط LA حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین آبکاری می شود. پس از جوجه کشی به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد ، کلون ها از غربالگری خارج می شوند ، DNA پلاسمید جدا می شود ، تجزیه و تحلیل محدودیت انجام می شود و ساختار اولیه DNA مشخص می شود. در نتیجه ، پلاسمید pSX43 با اندازه 3218 جفت باز به دست می آید.
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX45
برای به دست آوردن پلاسمید نوترکیب pSX45 ، یک دور تقویت DNA توسط PCR با استفاده از DNA پلاسمید pSX43 به عنوان یک الگوی و آغازگرهای IFN5 و IFN6 انجام می شود:
PCR تحت شرایط زیر انجام می شود: گرم کردن در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ، 20 چرخه PCR (30 ثانیه 95 درجه سانتیگراد ، 30 ثانیه 56 درجه سانتیگراد ، 10 دقیقه 72 درجه سانتیگراد) و جوجه کشی به مدت 20 دقیقه با 72 درجه سانتیگراد. DNA به دست آمده پس از PCR به طور مستقیم به سلولهای باکتری E. coli DH5 تبدیل شده و روی محیط LA حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین آبکاری می شود. پس از جوجه کشی به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد ، کلون ها از غربالگری خارج می شوند ، DNA پلاسمید جدا می شود ، تجزیه و تحلیل محدودیت انجام می شود و ساختار اولیه DNA مشخص می شود. به عنوان یک نتیجه ، پلاسمید 3218 جفت باز pSX45 بدست می آید.
ساخت پلاسمید نوترکیب pSX50.
برای به دست آوردن پلاسمید نوترکیب pSX50 ، یک دور تقویت DNA توسط PCR با استفاده از DNA پلاسمید pSX45 به عنوان یک الگوی و آغازگرهای IFN7 و IFN8 انجام می شود:
PCR تحت شرایط زیر انجام می شود: گرم کردن در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ، 20 چرخه PCR (30 ثانیه 95 درجه سانتیگراد ، 30 ثانیه 56 درجه سانتیگراد ، 10 دقیقه 72 درجه سانتیگراد) و جوجه کشی به مدت 20 دقیقه با 72 درجه سانتیگراد. DNA به دست آمده پس از PCR به طور مستقیم به سلولهای باکتری E. coli DH5 تبدیل شده و روی محیط LA حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین آبکاری می شود. پس از جوجه کشی به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد ، کلون ها از غربالگری خارج می شوند ، DNA پلاسمید جدا می شود ، تجزیه و تحلیل محدودیت انجام می شود و ساختار اولیه DNA مشخص می شود. در نتیجه ، یک پلاسمید 3218 جفت باز pSX50 بدست می آید.
مثال 2. به دست آوردن فشار E. coli SX50 - تولید کننده اینترفرون
سویه تولید کننده اینترفرون E. coli SX50 با تبدیل سلولهای E. coli BL21 با پلاسمید نوترکیب pSX50 بدست می آید. سویه تولید کننده اینترفرون در یک تخمیر کننده 30 لیتر به تراکم نوری 25.0-30.0 o.u رشد می یابد. در محیط M9 حاوی 1٪ هیدرولیز کازئین اسید (Difco) ، 1٪ گلوکز ، 40 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین در 38-39 درجه سانتیگراد. در طی تخمیر ، بستر مواد مغذی به طور مداوم با استفاده از یک کنترل گرانش سنجی اضافه می شود.
مثال 3. روش جداسازی اینترفرون از سویه E. coli SX50
اینترفرون در 4 مرحله بدست آمد:
مرحله ی 1. کشت گونه E. coli SX50.
مرحله 2. جداسازی و تصفیه فرم نامحلول اینترفرون.
مرحله 3. انحلال و تجدید مجدد اینترفرون.
مرحله 4 تصفیه کروماتوگرافی اینترفرون.
مرحله ی 1. کشت گونه E. coli SX50
تلقیح رشد یافته ای از سویه E. coli SX50 در حجم 3 لیتر LB غنی از LB به مدت 12 ساعت در دمای 26 درجه سانتیگراد به طور نامحسوس به یک تخمیر کننده حاوی 27 لیتر محیط استریل حاوی M9 ، 1٪ هیدرولیز اسید کازئین ، 1٪ گلوکز ، 1 میلی متر MgCl وارد می شود. 2 ، 0.1 میلی مولار CaCl 2 ، 40 میلی گرم در میلی لیتر کانامایسین. کشت در یک تخمیر در دمای 38-39 درجه سانتیگراد انجام می شود و pH برابر 7/0 ± 7/0 با تیتراسیون اتوماتیک با محلول هیدروکسید سدیم 40٪ حفظ می شود. غلظت اکسیژن محلول در محدوده (10 50 50) درصد اشباع با تغییر سرعت همزن از 100 به 800 دور در دقیقه و تأمین هوا از 1 تا 15 لیتر در دقیقه حفظ می شود. غلظت بسترها ، به ویژه گلوکز و عصاره مخمر ، در طی تخمیر اندازه گیری می شود و غلظت آنها با تغییر نرخ خوراک محلول های غلیظ از طریق پمپ های پریستالتیک با استفاده از کنترل کننده گرانشی حفظ می شود.
تجمع اینترفرون نامحلول توسط میکروسکوپ کنتراست فاز ، الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید 15٪ (SDS-PAAG) و کروماتوگرافی با کارایی بالا فاز معکوس (RF HPLC) بررسی می شود. تخمیر پس از رسیدن به حداکثر تراکم نوری (30-30 پوند) و متوقف کردن سنتز اینترفرون متوقف می شود. در پایان تخمیر ، مایع کشت با سانتریفیوژ شدن در یک روتور جریان با سرعت چرخش 5000-10000 دور در دقیقه جدا می شود. زیست توده در کیسه های پلاستیکی بسته بندی شده و در دمای منهای 70 درجه سانتیگراد منجمد می شود.
مرحله 2. جداسازی و تصفیه فرم نامحلول اینترفرون
300-400 گرم زیست توده منجمد از فشار E. coli SX50 در 3000 میلی لیتر بافر 1 (20 میلی متر Tris-HCl ، pH 8.0 ، 10 میلی متر EDTA ، 0.1 0.1 Triton X100) به حالت تعلیق در می آیند. این سیستم تعلیق از طریق هموژنایزر جریان گولین از نوع عبور داده می شود ، در 900 بار نگه داشته شده و در یک روتور جریان از طریق 15000 دور در دقیقه سانتریفیوژ می شود. رسوب حاصل در شرایط مشابه به صورت متوالی با بافر 2 (20 میلی متر Tris-HCl ، pH 8.0 ، 1 میلی متر EDTA ، 3 M اوره) و بافر 3 (20 میلی متر Tris-HCl pH 8.0 ، 1 میلی متر EDTA) شسته می شود و سرانجام رسوب اینترفرون در 200 متوقف می شود. میلی لیتر بافر 3. در این حالت ، زمان جداسازی و تصفیه فرم نامحلول اینترفرون بیش از 5 ساعت نیست.
مرحله 3. انحلال و تجدید مجدد اینترفرون
به حالت تعلیق فرم نامحلول اینترفرون به دست آمده در مرحله قبل ، هیدروکلراید گوانیدین خشک به غلظت 6 M اضافه می شود ، دییتیوترتیتول به غلظت 50 میلی متر ، Tris-HCl pH 8.0 به غلظت 50 میلی متر ، NaCl به غلظت 150 میلی متر و تریتون X100 با غلظت 0.1 درصد اضافه می شود. دمای اتاق به مدت 2 ساعت می باشد. مواد حل نشده با عقیم سازی فیلتراسیون از طریق غشایی با قطر منافذ 0.22 میکرون از هم جدا می شوند.
ترمیم مجدد اینترفرون با رقیق کردن محلول حاصل 100-200 بار بافر 4 (20 میلی متر تریس-هیدروکلراید pH 8.0 ، 100 میلی متر سدیم کلسیم ، 0.1 میلی متر EDTA) انجام می شود. سپس مخلوط تجدید حیات با همزن ثابت به مدت 12-15 ساعت در دمای 4-8 درجه سانتی گراد انکوبه می شود. سپس سولفات منیزیم به غلظت 1 میلی متر اضافه می شود و مواد جمع شده با استریل کردن فیلتراسیون از طریق فیلتر غشایی با قطر منافذ 0.22 میکرون برداشته می شوند.
مرحله 4 تصفیه کروماتوگرافی اینترفرون
تصفیه کروماتوگرافی اینترفرون در سه مرحله انجام می شود.
1- اینتفرون مجدداً متولد شده در مرحله اول با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی روی رزین سریع چلواتین Sepharose Flough Flowers (زیست شناسی Amersham) با یون های مس +2 بی حرکت می شود. برای این کار ، یک محلول اینترفرون بر روی ستونی با Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow اعمال می شود و اینترفرون با یک بافر اسید سیتریک 0.1 م ، با pH 2.2 شسته می شود.
2- در مرحله دوم تصفیه کروماتوگرافی ، محلول اینترفرون بر روی رزین تبادل سریع کاتیونی تبادل کننده جریان خون CM Sepharose (Amersham Biosc علوم) اعمال می شود و اینترفرون با شیب محلول ها (0.0-0.5 M NaCl) در 50 میلی متر سدیم سدیم (CH 3 COO) بافر ، pH 5.5 حاصل می شود.
3. تصفیه فرم مونومر از اینترفرون از باقیمانده های فرم های پلیمری اینترفرون در مرحله سوم تصفیه اینترفرون توسط ژل فیلتراسیون روی رزین Superdex 75 (Biers علوم Amersham) انجام می شود. کروماتوگرافی در 50 میلی متر سدیم سدیم (CH3 COO) بافر ، pH 5.0 ، حاوی 0.15 M NaCl انجام می شود.
روش توصیف شده ایزوله و خالص سازی اینترفرون به شما امکان می دهد 4-8 گرم از اینترفرون بسیار تمیز در یک چرخه ایزوله به مدت 7-10 روز از زیست توده به دست آمده از 10 لیتر محیط کشت بدست آورید. کیفیت اینترفرون به دست آمده کاملاً مطابق با الزامات "فارماکوپه اروپایی" برای ماده اینترفرون آلفا -2b است ، یعنی:
غلظت اینترفرون کمتر از 2 × 10 8 IU / ml نیست.
فعالیت خاص اینترفرون کمتر از 10 I 10 8 IU / میلی گرم نیست.
خلوص الکتروفورز آماده سازی در شرایط کاهش و عدم کاهش هنگام رنگ آمیزی ژل ها با نقره کمتر از 99٪ نیست؛
نقطه ایزوالکتریک اینترفرون جدا شده در ناحیه pH 5.8-6.3 است.
نقشه پپتید اینترفرون جدا شده اساساً با نقشه پپتید استاندارد اروپا برای اینترفرون آلفا 2b CRS تفاوت ندارد.
همانطور که از مثالهای بالا در زیر آمده است ، گروه ادعا شده از اختراعات ، دستیابی به اینترفرون آلفا -2b در بازده بالا با یک فناوری نسبتاً ساده و قابل اعتماد را ممکن می سازد.
مطالبه
1. DNA پلاسمید نوترکیب pSX50 ، رمزگذاری سنتز آلفا-2b اینترفرون انسانی نوترکیب ، با توجه به اینکه اندازه ای از 3218 جفت پایه (bp) دارد و از قطعات زیر تشکیل شده است: دنباله از 1 تا 176 نوکلئوتید (bp) شامل یک قطعه است. DNA 176 جفت باز حاوی پروموتور تریپتوفان (Ppp) ، دنباله 177 تا 194 جفت باز. شامل یک قطعه DNA مصنوعی از 18 جفت باز حاوی توالی Shine Delgarno مسئول شروع ترجمه ، دنباله 195 تا 695 جفت باز است. شامل یک قطعه DNA از 501 جفت باز حاوی ژن اینترفرون آلفا-2b با تعویض نوکلئوتید: 37 (A\u003e C) ، 39 (G\u003e T) ، 40 (A\u003e C) ، 42 (G\u003e T) ، 67 ( A\u003e C) ، 69 (G\u003e T) ، 70 (A\u003e C) ، 72 (A\u003e T) ، 96 (G\u003e A) ، 100 (A\u003e C) ، 102 (A\u003e T) ، 114 (A \u003e C) ، 120 (C\u003e G) ، 126 (G\u003e A) ، 129 (G\u003e A) ، 330 (C\u003e G) ، 339 (G\u003e A) ، 342 (G\u003e A) ، 487 (A\u003e ج) ، 489 (A\u003e T) ، 495 (G\u003e A) ، دنباله 696 تا 713 n. شامل یک قطعه DNA مصنوعی از 18 جفت باز حاوی یک پلی لینر مصنوعی ، دنباله ای از 714 تا 1138 جفت باز است. شامل یک قطعه DNA پلاسمید pKK223-3 از 4129 تا 4553 nt. اندازه 425 جفت باز ، حاوی توالی پایان دهنده رونویسی دقیق rrnBT 1 T 2 ، دنباله 1139 تا 1229 nt. شامل یک قطعه DNA پلاسمید pUC19 از 2487 تا 2577 نانولوله است. اندازه 91 جفت باز ، حاوی پروموتر ژن β- لاکتوماز (مقاومت ژن به آمپی سیلین -Amp R) ، دنباله ای از 1230 تا 2045 nt. شامل یک قطعه DNA پلاسمید pUC4K با 720 نانولوله است. تا سال 1535 ه اندازه 816 جفت باز ، حاوی منطقه ساختاری ژن کان ، دنباله ای از 2046 جفت باز. به 3218 ن. شامل یک قطعه DNA پلاسمید pUC19 از 1625 تا 453 نانومتر است. اندازه 1173 جفت باز ، حاوی توالی مسئول تکثیر پلاسمید (اوری) و پروموتور lac (P lac) است.
2- سویه باکتری Eschcerichia coli SX50 با پلاسمید نوترکیب مطابق ادعای 1 - تولیدکننده لکوسیت انسانی نوترکیب اینترفرون آلفا -2b - تبدیل شده است.
3- روشی برای به دست آوردن اینترفرون انسانی آلفا 2b انسانی ، از جمله کشت باکتری Escherichia coli SX5 طبق ادعای 2 در یک ماده مغذی با اضافه شدن مداوم بسترهای مغذی در حین بیوسنتز ، تخریب مکانیکی سلولهای میکروارگانیسم با فشار 700-900 بار ، انحلال اینترفرون در محلول بافر هیدروکلراید گوانیدین ، تجدید مجدد اینترفرون در محلولهای بافر فیزیولوژیکی با حضور عوامل حائز تنفسی ، تصفیه کروماتوگرافی سه مرحله ای از اینترفرون روی رزین های سریع چلهینگ Sepharose جریان بی حرکت با یون های مس +2 ، کروماتوگرافی تبادل یونی در رزین های تبادل یونی از نوع CM Sepharose Fast Flow و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل فوق العاده ...
4- روشی طبق ادعای 3 که در آن کشت بر روی یک ماده مغذی با کاهش محتوای تریپتوفان با افزودن مداوم بسترهای مغذی ، ترجیحا گلوکز و عصاره مخمر انجام می شود.
5- روشی مطابق ادعای 3 که قبل از انحلال اینترفرون با از بین بردن اجزای سلولی محلول از جمله DNA ، RNA ، پروتئین ها ، لیپوپلی ساکاریدها ، شستشو با محلول های بافر حاوی مواد شوینده از نوع Triton XI 00 ، اوره ها خالص می شوند.
6. روش طبق ادعای 3 ، كه در آن پس از هر بار تصفیه كروماتوگرافی ، تصفیه عقیم سازی از طریق فیلترهایی با اندازه منافذ 0.22 میكرومتر انجام می شود.