Značenje brojeva 1 128 je sifilis. Osnovne metode za dijagnosticiranje sifilisa i dekodiranje pokazatelja

Sifilis je klasificiran kao spolno prenosiva bolest, čiji je glavni "krivac" blijeda treponema. Ova bakterija može ući u tijelo nakon spolnog kontakta, ili kućnim putem.

Dijagnostičke mjere usmjerene na prepoznavanje ove bolesti su složene. Na rezultate testova mogu utjecati različiti antibiotici, trudnoća i drugi čimbenici koji će biti opisani u članku.

Kada je propisana analiza za sifilis - indikacije za dijagnozu

Neki pacijenti prilikom dolaska na pregled kod ginekologa ili androloga ne daju objektivne podatke o kvaliteti svog spolnog života.

Možda je razlog uobičajena sramota, a možda je razlog tome nedostatak informacija iz područja spolno prenosivih bolesti.

Liječnik može poslati na pregled čak i ako se sifilis ni na koji način ne manifestira, a pacijent je 100% siguran da se ne bi mogao zaraziti ovom bolešću. Činjenica je da se razmatra patologija mogu se prenijeti svakodnevnim kontaktom ili biti asimptomatski.

Testiranje na sifilis se naručuje ako:

• Tijekom trudnoće morate biti prijavljeni.
• Pacijent želi dati krv kao darivatelj.
• Postoji mogućnost zauzimanja određene pozicije (vojnik, zdravstveni radnik, kuhar itd.), za što je potrebno proći posebno liječničko povjerenstvo.
• Osoba je u zatvoru.
• Došlo je do spolnog odnosa s bolesnicom od sifilisa.
• Majka novorođenčeta ima sifilis.
• Pacijent je pokazao znakove ove bolesti. Često su to osipovi u području genitalija.
• Prva analiza potvrdila je prisutnost predmetne bolesti.

U prisutnosti sifilisa radi se redovito testiranje krvi. To je potrebno za kontrolu kvalitete terapijskih mjera.

Nakon terapije pacijent uzima i krv za istraživanje.

Kako se testirati na sifilis

Za istraživačke manipulacije često koriste krv iz vene. U određenim situacijama, laboratorijski asistent može uzeti pravi uzorak za dijagnozu s prsta, ili iz leđne moždine.

Interval od trenutka isporuke do primitka rezultata može biti različit: od jednog dana do dva tjedna. Sve će odrediti vrsta testiranja.

Prilikom pripreme za isporuku krvne pretrage za identifikaciju dotične bolesti, potrebno je pridržavati se sljedećih preporuka:

• Masnu hranu dan prije testa treba isključiti iz prehrane. To će izazvati opalescenciju krvnog seruma, što će iskriviti dobivene rezultate.
• Izbjegavajte hranu najmanje 8 sati prije testiranja na sifilis.
• Alkohol, nikotin mogu ometati procjenu reakcije. Stručnjaci savjetuju da se 24 sata prije testa ne piju pića koja sadrže alkohol, a s cigaretama treba pričekati barem sat vremena prije testa.
• Ako bolesnik uzima antibiotike, navedenu analizu treba provesti najmanje tjedan dana nakon završetka liječenja.

Načini predaje materijala za istraživanje i dekodiranje pokazatelja

Danas niti jedna od metoda za dijagnosticiranje ove bolesti ne može jamčiti točnost dobivenih informacija. U svakom slučaju, greške postoje, a mogu doseći i 10%.

U tom smislu, prijavite se kompleks istraživačkih metoda.

Serološka analiza - nespecifične i specifične pretrage

Ova vrsta dijagnoze indicirana je za ograničene simptome bolesti ili njezinu potpunu odsutnost.

Postoje dvije vrste serodijagnoze:

1.Nespecifični testovi

Oni su relevantni kada trebate testirati veliku skupinu ljudi na sifilis, ali ova tehnika nije prikladna kada trebate potvrditi dijagnozu.

Testiranje nije teško, ali konačnu ocjenu treba dati liječnik.

Ove vrste dijagnostike uključuju sljedeće testove:

A) Precipitacijske mikroreakcije (MR)

Slična studija indikativna je nakon mjesec dana nakon infekcije. Krv iz prsta podliježe pregledu, ali ponekad se može koristiti i cerebrospinalna tekućina.

Pozitivan rezultat testa ( antitijela u titru variraju od 1:2 do 1:320 ) još ne znači da pacijent ima sifilis: moguće je konačno potvrditi dijagnozu polaganjem dodatnih pretraga.

Negativna reakcija može biti rezultat dvije mogućnosti:

• Pacijent nema sifilis.
• Sifilis je, ali - u početnoj fazi razvoja.

B) Wassermanova reakcija ( P.B. RW)

Materijal za testiranje ovdje je isti kao u gornjoj analizi.

Ova metoda ispitivanja može dati objektivne informacije najmanje 6 tjedana nakon infekcije. O prisutnosti naznačene spolne patologije moguće je govoriti ako su titri protutijela 1:2 - 1:800.

Rezultati analiza u RV ocjenjuju se sljedećim matematičkim znakovima:

• « — »Nema sifilisa.
• « + "ili" ++ "- navodi se slabo pozitivna reakcija.
• « +++ ' je pozitivna reakcija.
• « ++++ » - pacijent ima oštro pozitivnu reakciju na sifilis.

2. Specifični testovi

Postoji mnogo različitih testova za ovu vrstu pregleda koji ciljaju na specifična antitijela. Ne pojavljuju se u krvi odmah, već otprilike mjesec dana nakon infekcije i mogu ostati tamo nekoliko godina (ako se ne liječe).

Liječnik mora razumno odabrati jednu ili drugu vrstu analize, detaljno poznavati svaku od njih, kretati se po dobivenim rezultatima i moći razlikovati dijagnozu nakon što dobije odgovor.

Najčešći tipovi specifičnih testova su:

A) Reakcija imunofluorescencije (RIF)

Relevantan je u vrlo ranim fazama sifilisa, ali optimalno razdoblje za testiranje je 6-8 tjedana nakon infekcije.

Za studiju je potrebna kapilarna / venska krv.

• Trudnoća, defekti vezivnog tkiva mogu uzrokovati lažnu reakciju, što se ocjenjuje znakom " — «.
• Pozitivni rezultati se izražavaju kao plus (" + ") od jedan do četiri.

B) Reakcija pasivne aglutinacije (RPHA)

Tijekom ovog testa uzima se mala količina krvi iz prsta/vene, koja se zatim pomiješa s crvenim krvnim stanicama ovna/pijetla. U prisutnosti uzročnika ove bolesti u krvotoku, mikrotijela se lijepe zajedno, nakon čega slijedi njihovo slijeganje.

Ova vrsta testiranja je vrlo osjetljiva: može potvrditi pozitivnu reakciju na sifilis dulje vrijeme nakon liječenja.

Mononukleoza i greške u strukturi vezivnog tkiva također mogu biti uzrok lažno pozitivne reakcije.

Za dobivanje odgovora potrebno je najviše 1 sat, a pacijenti se mogu provjeriti 4 tjedna nakon infekcije: u ranijim vremenima, antitijela se neće proizvoditi u dovoljnom volumenu.

Koliko dugo je infekcija u krvi, možete procijeniti prema titrima:

• Ako njihova vrijednost ne prelazi 1:320, onda se infekcija dogodila nedavno.
• Što su titri veći, treponema je duže u tijelu.

C) Enzimski imunotest (ELISA)

Jedna od najpouzdanijih metoda za dijagnosticiranje ove bolesti, koja se počela koristiti krajem prošlog stoljeća.

Vrlo je indikativan već 21 dan nakon infekcije, a pozitivan rezultat od 98-99% će ukazati na prisutnost sifilisa.

ELISA se često koristi nakon nespecifičnih testova ili u kombinaciji s nekim specifičnim testovima.

ELISA test otkrivanjem jedne ili druge skupine antitijela u krvi ( IgA, IgM, IgG) omogućuje određivanje stadija bolesti:

• Ako uzorak krvi sadržiIgA, ali odsutanIgM,IgG: nije prošlo više od 14 dana od trenutka kada je blijeda treponema ušla u tijelo.
• Ako se identificiraIgA,IgM, ali neIgG: infekcija se dogodila prije otprilike 28 dana.
• Prisutnost u krvi svih navedenih antitijela ukazuje da je prošlo više od mjesec dana od infekcije.
• Ako je reakcija krvi na prisutnostIgA je negativan iIgM,IgG pozitivan: prošlo je ogromno vremensko razdoblje od trenutka infekcije ili uspješnog liječenja bolesti.

D) Treponema pallidum reakcija imobilizacije (RIBT)

Jedna od najpopularnijih metoda za dijagnosticiranje sifilisa.

Nema smisla koristiti ga u ranoj fazi infekcije, ali nakon 12. tjedna rezultati RIBT testa pouzdani su 99%.

Ova dijagnostička metoda koristi se kod sumnje na neurosifilis, sifilis unutarnjih organa ili u kombinaciji s nespecifičnim pretragama.

Kada uzima durant antibiotike, pacijent mora pričekati najmanje 25 dana nakon završetka terapije. Antibioticima topivim u vodi potrebno je manje vremena da se izluče iz tijela: 7-8 dana.

Krv se uzima iz vene, na prazan želudac, a rezultati se tumače kao postotak imobilizacije:

• Ako razina imobilizacije ne prelazi 20%, test na sifilis smatra se negativnim.
• Kada prelazi 50%, reakcija na navedenu patologiju je pozitivna.

U drugim slučajevima propisana je ponovljena studija.

D) Imunobloting

Jedna od najnovijih metoda istraživanja, kojoj se okreće kada drugi testovi daju upitan rezultat.

Ovom dijagnostičkom manipulacijom moguće je otkriti čak i minimalnu količinu antitijela u krvi: ima gotovo 100% točnost.

Ne provode sve klinike takvo testiranje: nije jeftino.

Laboratorijska analiza

Cijena analize koja se razmatra vrlo je niska, a rezultat možete saznati za 30 minuta.

1. Za provedbu takve studije pacijentu se uzima uzorak od ulceroznih/erozivnih defekata nalazi u području genitalija. Mikroskopsko ispitivanje uzetog uzorka često se provodi u laboratoriju.

Zahvaćena područja u početku se brišu fiziološkom otopinom. To će pomoći u zaštiti oštećenog područja od ulaska štetnih mikroorganizama.

2. Zatim, pomoću posebne petlje, iritirajte površinu nekoliko minuta dok se ne pojavi bistra bijela tekućina. S ovom manipulacijom trebate biti oprezni: nečistoće krvi nemoguće je ući u uzeti uzorak.

3. Izvađena tekućina se prenosi u prozirno staklo. Ponekad se miješa sa fiziološkom otopinom.

Pozitivna reakcija može se reći kada se otkriju tipične treponeme, koje će imati najmanje 8 kovrča. Ako je rezultat negativan, postupak se ponavlja (ponekad i nekoliko puta).

Sifilis trna je specifičan test za otkrivanje IgG antigena. Obično se ova studija koristi nakon pozitivnog rezultata RPR-a ili za procjenu učinkovitosti odabranog tretmana. Sifilis trna je vrlo osjetljiv test koji može pokazati pozitivan rezultat i do 20 godina nakon uspješne terapije, a u nekim slučajevima zaostali tragovi bolesti mogu potrajati do kraja života.

Test na sifilis tpha (reakcija pasivne hemaglutinacije) predložio je T. Rathlev 1965. godine. Bit metode bila je reakcija lijepljenja i taloženja eritrocita, čija površina u sifilisu sadrži antigene za blijedu treponemu, što se opaža samo ako u krvi postoje antitreponemska antitijela.

Analizu Trna preporuča se provesti mjesec dana nakon očekivanog datuma infekcije. Prije samog skupljanja trebali biste se suzdržati od jela najmanje 8 sati. Ako rezultati tran testa upućuju na odsutnost infekcije, ali bolesnik ima simptome, rane simptome infekcije ili je u prošlosti imao spolni odnos s osobom za koju je utvrđeno da je zaražena spirohetama, preporuča se provesti drugi sljedeća studija s razmakom od 2 tjedna. Za razliku od lažno negativnog tpha rezultata, pri korištenju ove metode detekcije IgG antigena, što može biti uzrokovano preranom studijom, lažno pozitivan rezultat za blijedu treponemu može se uočiti u tri slučaja:

• Infektivna mononukleoza;
• Lepreova bolest;
• Sistemske lezije vezivnog tkiva.

Do danas se tpha test koristio kao najučinkovitiji specifični serološki test za potvrdu pozitivnih rezultata drugih testova na sifilis ili, ako je potrebno, za procjenu učinkovitosti liječenja.

Rezultati studija prisutnosti IgG antigena nisu ograničeni na samo dvije oznake "negativno" ili "pozitivno", rezultati studije također ukazuju na titar antitijela, na koji se liječnik usredotočuje tijekom boravka pacijenta u bolnici. za procjenu učinkovitosti terapijskog učinka. Po vrijednosti titara može se zaključiti o trenutnom razdoblju infekcije i uspješnosti terapijskih mjera. Dakle, titri karakteristični za prvi stadij bolesti kreću se od 1:80 do 1:320. S prijelazom bolesti u sekundarni stadij, analiza na sifilis tpha pokazat će zamjetan porast titara na 1:5120, nakon čega slijedi smanjenje latentnog razdoblja na 1:80. Nakon uspješne terapije titri mogu značajno pasti, ali će ostati pozitivni još mnogo godina nakon otpusta.

Ponekad, uz pozitivnu studiju tpha, titri su toliko beznačajni da dijagnoza sifilisa izaziva ozbiljne sumnje. U tom slučaju se zapisuje o sumnjivosti dobivenih podataka i preporučuje se ponovno polaganje za 1-2 tjedna.

Obično se testovi na sifilis trna uzimaju ujutro u kratkom vremenskom razdoblju, što je povezano sa zahtjevom za studijom, među kojima se ukazuje na potrebu dostave uzoraka krvi u laboratorij najkasnije 2 sata nakon uzimanja. U tom slučaju uzorci se moraju transportirati na temperaturama do +8°C.

Materijal za ispitivanje tpha je krvni serum koji je donirala osoba na prazan želudac. Ako su tijekom uzimanja krvi i naknadne analize ispunjeni svi potrebni uvjeti, tada će točnost dobivenih podataka biti 76% za primarni sifilom, 100% za sekundarni oblik bolesti i 94% za kasni stadij bolesti. Otkrivanje blijede treponema tijekom razdoblja asimptomatskog tijeka bolesti je oko 97%. A razina specifičnosti, koja doseže do 99%, omogućuje gotovo potpuno isključivanje varijanti lažno pozitivnih rezultata, olakšavajući diferencijalnu dijagnozu pacijenata.

Treponemski testovi za sifilis. Opći opis.

Kako bi se pouzdano dijagnosticirao sifilis i identificirala antisifilitička antitijela u tijelu pacijenta (u krvnom serumu ili cerebrospinalnoj tekućini), koriste se posebne laboratorijske tehnologije istraživanja - takozvane serološke metode.

Prilikom provođenja dijagnostičkih pretraga na sifilis koriste se različite serološke reakcije: aglutinacija, precipitacija, imunofluorescencija, fiksacija komplementa, enzimski imunotest itd. Sve ove serološke reakcije temelje se na interakciji antigena i antitijela.

Nazivaju se specifični serološki testovi treponem jer se u tim pretragama koristi treponema pallidum ili njezini antigeni, odnosno antigeni treponemskog podrijetla. Svrha treponemskih testova je identificirati specifična antitijela na antigenske strukture uzročnika sifilisa, odnosno antitijela usmjerena specifično protiv samih bakterija T. Pallidum, a ne protiv tjelesnih tkiva oštećenih treponemom. Specifična antitreponemska antitijela IgM klase mogu se otkriti već krajem drugog tjedna bolesti.

7. Lažno pozitivni i lažno negativni rezultati

Pozitivan PB test na sifilis kod ljudi koji nemaju tu bolest naziva se lažno pozitivnim. Učestalost lažno pozitivnih rezultata kod zdravih osoba je 0,2-0,25%. Ako je postotak nespecifičnih lažno pozitivnih rezultata RV kod zdravih ljudi vrlo nizak, onda kod nekih bolesti može biti visok.

Svi nespecifični rezultati seroloških reakcija mogu se podijeliti u sljedeće glavne skupine:

1. Bolesti uzrokovane prisutnošću uobičajenih antigena kod sličnih uzročnika bolesti (spirohete): povratna groznica, freskanje, bežel, pinta, oralna treponema, leptospira.

2. Pozitivne reakcije zbog promjena u metabolizmu lipida i promjena u serumskim globulinima. To uključuje pozitivne rezultate kod trudnica s gihtom, poremećenog sastava lipida kao posljedica trovanja olovom, fosforom, nakon uzimanja natrijevog salicilata, digitalisa itd. Ove reakcije trebaju uključivati ​​i pozitivne reakcije kod određenih zaraznih bolesti (tifus, malarija, upala pluća, itd.). guba, endokarditis, kolagenoza, infarkt miokarda, potres mozga, rak, ciroza jetre itd.)

3. Tehničke pogreške u ponašanju. Pogrešan izbor doze komplementa, nepoštivanje uvjeta i uvjeta skladištenja reagensa, isključenje kontrolnih uzoraka krvnog seruma iz reakcije, korištenje kontaminiranih epruveta i instrumenata.

8. Modifikacija Wassermannove reakcije

Postoje modifikacije Wassermanove reakcije u kvalitativnim i kvantitativnim verzijama, na hladnoći, s cerebrospinalnom tekućinom.

Modifikacija RV-a na hladnoćičinilo se osjetljivijim. Značajka metode postavljanja Wassermanove reakcije na hladnoću su trofazni temperaturni režimi pri kojima se odvija vezanje komplementa. Ova reakcija se također stavlja na kardiolipin i treponemski antigen.

Osim kvalitativne procjene RW-a, postoji i metoda za njegovu kvantitativno postavljanje s različitim razrjeđenjima krvnog seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titar reagina određen je maksimalnim razrjeđenjem, što ipak daje oštro pozitivan rezultat (4+). Kvantitativna formulacija RV je važna u dijagnozi nekih oblika sifilisa i u praćenju učinkovitosti terapije.

9. Opseg

U Rusiji je RSKt dio kompleksa standardnih seroloških testova na sifilis (SSR).

Wassermanova reakcija s treponemskim i kardiolipinskim antigenom (RSKt) se koristi za

• dijagnostika svih oblika sifilisa,
• kontrola učinkovitosti liječenja,
• preglede osoba koje su imale spolni kontakt sa oboljelim od sifilisa,
• pregledi osoba s kliničkom i anamnestičkom sumnjom na sifilis
• tijekom preventivnog pregleda na sifilis bolesnica u psihijatrijskim i neurološkim bolnicama, darivatelja i trudnica, uključujući osobe upućene na umjetni prekid trudnoće.

Trenutno, prema nalogu Ministarstva zdravstva Ruske Federacije, preporuča se zamijeniti RSKT osjetljivijim treponemskim metodama (ELISA ili RPHA).

U inozemstvu se Wassermanova reakcija s treponemskim antigenom već duže vrijeme ne koristi u kliničkoj laboratorijskoj praksi i nije uključena u popis standardnih testova koje preporučuje Svjetska zdravstvena organizacija.

Kompleks klasičnih seroloških reakcija (CSR)

DAC- to reakcijski kompleks koristi se za serodijagnostiku sifilisa kao standardna metoda. Ovaj kompleks reakcija uključuje Wassermanovu reakciju s kardiolipinskim antigenom (ekstraktom iz srca bika obogaćenog lecitinom i kolesterolom) i treponemskim antigenom (suspenzija apatogenih kulturnih blijedih treponema tretiranih ultrazvukom), kao i reakciju mikroprecipitacije (RMP). ) plazmom ili inaktiviranim serumom, koji se stavlja s kardiolipinskim antigenom

CSR postaju pozitivni sredinom primarnog razdoblja (njegova podjela na seronegativnu i seropozitivnu precizno je određena CSR-om), u sekundarnom razdoblju CSR je pozitivan u 98-100% bolesnika, au tercijarnom razdoblju - samo u 60-70 %. Odnosno, kako se trajanje bolesti povećava, pozitivnost CSR-a postupno se smanjuje.

Prednosti KSR-a:

1) Jeftina, jednostavnost i brzina postavljanja. To posebno vrijedi za reakciju mikroprecipitacije: RMP je trenutno glavna metoda probira (probira);

2) Netreponemski testovi prikladni su za praćenje izlječenja sifilisa.

Nedostaci CSR-a:

1) Subjektivnost ocjene rezultata reakcija ("na oko");

2) Niska osjetljivost u kasnim oblicima sifilisa;

3) Nedostatak specifičnosti u odnosu na modernije testove. Kada se provode, često se bilježe lažno pozitivne reakcije (LPR).

LPR može biti posljedica križne reaktivnosti između blijede spirohete i drugih mikroba, poremećaja metabolizma lipida i proteina, nestabilnosti stanične membrane i stvaranja autoantitijela. LPR se bilježi kod akutnih (malarija, infektivna mononukleoza i dr.) i kroničnih (tuberkuloza, guba, hepatitis, borelioza itd.) infekcija, infarkta miokarda, ciroze jetre, kolagenoza (osobito kod SLE), onkopatologije, cijepljenja, uporabe lijekova, zlouporaba alkohola i masne hrane. Lažno pozitivan može biti CSR u zadnjim tjednima trudnoće, nakon poroda i kod nekih žena tijekom menstruacije. Lažno negativni rezultati CSR-a mogu biti povezani s HIV infekcijom.

RIT, RIBT - Reakcija imobilizacije blijede treponeme

Test imobilizacije Treponema pallidum (TPI; Treponema pallidum imobilizacijski test, TPI) je klasična metoda koja služi za otkrivanje specifičnih antitijela na treponeme. Reakcija RIBT kao antigen koristi patogeni treponema pallidum T. pallidum (Nicholsov soj) uzgojen u testisima kunića. RIBT se temelji na gubitku pokretljivosti živih blijedih treponema nakon izlaganja antitijelima iz krvnog seruma i komplementa bolesnika. Rezultati se procjenjuju mikroskopijom u tamnom polju. Unatoč činjenici da je RIBT test uveden u kliničku praksu kao specifičan test za sifilis, naporan je, tehnički složen, dugotrajan i skup za korištenje.

1. Povijest RIBT metode

Treponema pallidum imobilizacijski test (TPRT) zapravo je prvi specifični test za dijagnozu sifilisa. Ovu reakciju predstavili su 1949. američki istraživači Nelson i Mayer (R. W. Nelson i M. M. Mayer) i detaljno je raspravljali u znanstvenim radovima u narednim desetljećima. Neuspješni pokušaji korištenja živih treponema u testovima već su napravljeni. Zbog činjenice da je Nelson uspio stvoriti okruženje u kojem su treponeme ostale održive i do 8 dana, njegovo istraživanje je okrunjeno uspjehom.

2. Princip RIBT metode

Metoda se temelji na fenomenu gubitka pokretljivosti blijedih treponema u prisutnosti imobilizirajućih antitreponemskih protutijela ispitivanog krvnog seruma i komplementa u anaerobnim uvjetima. Antigen je živa patogena blijeda treponema dobivena od zečeva umjetno zaraženih sifilisom.

3. Postavljanje RIBT testa

U reakciji sudjeluju test serum, komplement i antigen. Krvni serum subjekta dodaje se živim treponemima dobivenim iz tkiva testisa kunića nakon umjetne infekcije. U prisutnosti anti-treponemskih antitijela-imobilizina u serumu, blijedi treponemi se prestaju kretati (imobilizirani). Imobilizinska protutijela su kasna antitreponemska antitijela.

Reakcija se provodi toplinom inaktiviranim serumima ili uzorcima seruma osušenih na voštanom papiru (suhe kapi). Inaktivacija seruma zagrijavanjem provodi se 30 minuta na temperaturi od 56°C. Prije uzimanja krvi ispitanik ne smije primati lijekove, posebno penicilinske pripravke. Prijem lijekova se otkazuje za vrijeme njihovog mogućeg kašnjenja u tijelu.

Kao antigen koriste se bakterije soja Nichols, dobivene iz 7-10-dnevnog sifilitičnog orhitisa kunića (upala testisa). Razdoblje od trenutka postavljanja reakcije do registracije njezinih rezultata traje 18-20 sati, stoga je za održavanje vitalnosti i dobre pokretljivosti mikroorganizama potrebno okruženje za preživljavanje.

RIBT koristi dodatak zamorcima. Za dobivanje komplementa potrebno je uzeti krv u sterilnim uvjetima od nekoliko zamoraca.

U slučaju bakterijske kontaminacije, komplement se odbacuje. Ne može se koristiti u reakciji imobilizacije blijede treponema očuvanog komplementa, tk. otrovan je za mikroorganizme.

U reakciji imobilizacije koristi se višak komplementa. Njegova količina uvelike ovisi o okruženju za preživljavanje blijede treponeme.

RIBT se stavlja u sterilne kutije, prethodno zračene baktericidnom kvarcnom lampom 45-60 minuta. Svaki krvni serum ispituje se u dvije epruvete: iskusan i kontrolirati. U obje epruvete dodaju se ispitni serum i antigen u potrebnim količinama. U epruvetu se ulije aktivni komplement, a u kontrolnu epruvetu ulije se ista količina inaktiviranog krvnog seruma zamorca. Nakon punjenja sadržaj epruveta se miješa blagim protresanjem.

RIBT se odvija u anaerobnim uvjetima. Epruvete sa sastojcima stavljaju se u mikroanaerostat iz kojeg se vakuum pumpom usisava atmosferski zrak i iz cilindra se ubrizgava mješavina plinova (95 dijelova dušika i 5 dijelova ugljičnog dioksida). Mikroanaerostat s epruvetama stavlja se u termostat (35°C) na 18-20 sati.

Procjena rezultata RIBT-a provodi se nakon vađenja epruveta iz termostata i mikroanaerostata (tj. nakon 18-20 sati iskustva). Pasteurovom pipetom kap sadržaja epruvete nanese se na predmetno staklo, koje se prekrije pokrovnim staklom i pregleda u tamnom polju mikroskopa (objektiv 40, okular 10X). U različitim dijelovima preparata pregledava se nekoliko vidnih polja, računajući broj pokretnih i nepokretnih blijedih treponema u svakom. Brojanje počinje s lijekom iz kontrole, a zatim iz epruvete.

Pri postavljanju reakcije koristi se 5 kontrolnih studija: s očito pozitivnim i negativnim krvnim serumima, s aktivnim i inaktiviranim komplementom i medijem preživljavanja za blijedu treponemu. Kontrolno negativni krvni serum koristi se za procjenu stupnja pokretljivosti blijede treponeme u ovom pokusu. Kontrolni pozitivan krvni serum - za procjenu stupnja imobilizirajuće aktivnosti u uvjetima ovog pokusa. Provodi se proučavanje aktivnog i inaktiviranog komplementa i okoliša kako bi se utvrdio njihov učinak na pokretljivost blijede treponeme.

Uz nedostatak komplementa u eksperimentu, imobilizirajuća antitijela ne pokazuju svoju aktivnost ispravno i treponemi ostaju pokretni. Stoga se nakon pokusa provodi određivanje rezidualnog komplementa kako bi se procijenilo je li pokretljivost blijedih treponema u epruvetama nastala zbog nedostatka komplementa. Za to se koristi hemolitički sustav - mješavina suspenzije ovnujskih eritrocita i razrijeđenog hemolitičkog seruma koji se čuva u termostatu.

Rezidualni komplement se određuje dodavanjem hemolitičkog sustava u potrebnom volumenu u svaku epruvetu. Cijevi se stavljaju u termostat na 37° na 45 minuta. U pokusnim epruvetama treba doći do hemolize eritrocita, u kontrolnim epruvetama treba doći do odgode hemolize. Odsutnost hemolize u epruvetama ukazuje na nedovoljnu količinu komplementa, u tim slučajevima ispitivanje treba ponoviti. Ponovljeni pregled krvnog seruma ne provodi se samo ako se zabilježi 100% imobilizacija blijedih treponema.

4. Računovodstvo rezultata RIBT-a

Imobilizirani treponemi se broje pod mikroskopom pomoću mikroskopije tamnog polja. Istraživač mora imati vještinu procjene kretanja treponema. Treba obratiti pozornost na intenzitet pokreta koje čini blijeda treponema. Kod ove bakterije nije uvijek moguće uočiti valovite kontrakcije i fleksijske pokrete, ponekad samo rotacijske. Također biste trebali moći razlikovati aktivne pokrete treponema od kretanja s protokom tekućine.

Za procjenu rezultata reakcije izračunava se postotak imobilizacije blijedih treponema, tj. omjer pokretnih i nepokretnih treponema u eksperimentu (s aktivnim komplementom) i kontroli (s neaktivnim komplementom) prema formuli:

X \u003d (M - C) × 100 / M

gdje je M broj mobilnih treponema u kontroli; C - broj mobilnih treponema u eksperimentu; X - % imobilizacija. U praktičnom radu postotak imobilizacije određuje se prema unaprijed sastavljenoj tablici koristeći gornju formulu.

Reakcija imobilizacije blijede treponema procjenjuje se kao

• pozitivan tijekom imobilizacije 51 - 100% treponem,
• slabo pozitivno: 31 - 50% nepokretni treponemi,
• sumnjivo: 21 - 30% nepokretni treponemi,
• negativan: 0 - 20% nepokretne treponeme.

Reakcija imobilizacije blijede treponeme postaje pozitivna na kraju primarnog - početkom sekundarnog razdoblja sifilisa (od 7-8. tjedna od trenutka infekcije i više). Istodobno, RIBT je od male koristi za dijagnosticiranje ranih stadija sifilisa, jer se antitijela koja imobiliziraju blijedu treponemu i određuju se u reakciji pojavljuju tek 3-6 tjedana nakon infekcije. Antitijela-imobilizini pripadaju klasi imunoglobulina IgG. Pojavljuju se u krvi kasnije od reagina (antikardiolipinska protutijela), kasnije od fluoresceinskih protutijela (otkrivaju se RIF i ELISA) i precipitina (otkriva se RMP).

U budućnosti, RIBT ostaje pozitivan. Kod kasnih oblika sifilisa postoji visoka osjetljivost reakcije. Kod sekundarnog, kasnog sifilisa, neurosifilisa, kongenitalnog sifilisa, pozitivan RIBT rezultat bilježi se u 95-100% slučajeva. Kod tercijarnog sifilisa, sa specifičnim lezijama unutarnjih organa, živčanog sustava, kada je RV često negativan, RIBT daje pozitivne rezultate u 98-100% slučajeva.

RIBT je dugo bio prepoznat kao najspecifičniji test za sifilis. Prema literaturi, specifičnost RIBT-a je 99%, osjetljivost se kreće od 79 do 94%. Prema TsNIKVI-ju, osjetljivost RIBT-a (ukupno, za sve faze sifilisa) je 87,7%.

7. Opseg metode

Opseg RIBT-a postupno se sužava zbog trajanja postavljanja, visoke cijene i intenziteta rada. RIBT je prilično složena i skupa analiza koja zahtijeva visokokvalificirano osoblje i prisutnost vivarija. S tim u vezi, uporaba ove metode posljednjih godina značajno je smanjena. U SAD-u se ovaj test trenutno koristi samo u istraživačkim laboratorijima.

Na temelju složenosti i visoke cijene RIF-a i RIBT-a, ima smisla koristiti ih za dijagnozu kasnih i latentnih oblika sifilisa. RIBT zadržava svoju poziciju "reakcionog arbitra" u diferencijalnoj dijagnozi ranih latentnih oblika sifilisa i lažno pozitivnih rezultata. Ova reakcija može biti korisna u dijagnosticiranju neurosifilisa i kada su drugi serološki testovi nedosljedni.

RIBT postaje pozitivan mnogo kasnije od RIF-a i RV-a. Stoga se ne koristi za dijagnosticiranje zaraznih oblika sifilisa.

RIBT je, kao i RIF, vrlo sporo negativan u procesu antisifilitičke terapije. Zbog toga je neprikladan za praćenje napretka antisifilitičke terapije.

Lažno pozitivni rezultati (FPR) u RIBT su rijetki i zabilježeni su uglavnom kod brojnih treponematoza (jaws, pinta, bejel), koje se ne nalaze u Rusiji, kao i kod lepre, sarkoidoze, SLE, tuberkuloze, ciroze jetre i neke druge rijetke bolesti nesifilitičke prirode. S dobi bolesnika povećava se broj lažno pozitivnih rezultata RIBT-a.

RIBT se može pokazati lažno pozitivnim ako test serum sadrži treponemicidne tvari (npr. peniciline, tetracikline, eritromicin) koje uzrokuju nespecifičnu imobilizaciju blijede treponeme. To može biti zbog toga što bolesnik uzima treponemocidne antibiotike, stoga se pregled ne provodi. provedeno kod osoba koje su primile antibiotike u posljednjih mjesec dana. Krv na RIBT može se ispitati najkasnije 2 tjedna nakon prestanka uzimanja antibiotika i drugih antisifilitičkih lijekova.

9. Modifikacije reakcije imobilizacije blijedih treponema

Uz mikroanaerostatsku tehniku, postoji i melange postavka RIBT-a prema N.M. Ovčinnikov. Anaerobni uvjeti tijekom formuliranja reakcije stvaraju se stavljanjem reakcijske smjese u melanger (mješalicu leukocita), čija su oba kraja zatvorena gumenim prstenom. Tehnika reakcije melange omogućuje odbacivanje vakuumske pumpe, cilindra s mješavinom dušika i ugljičnog dioksida i mikroanaerostata. U usporednoj studiji na velikom kliničkom materijalu dobiveni su rezultati koji nisu inferiorni u odnosu na klasičnu anaerostatsku tehniku.

10. Značajke, prednosti i nedostaci RIBT-a

RIBT je tehnički složena i skupa dijagnostička metoda. Tehnologija zahtijeva značajna sredstva za održavanje kunića i testiranje. Ovaj dugotrajni test trenutno se koristi uglavnom u znanstvene svrhe. U većini stranih zemalja gotovo 40 godina RIBT se praktički ne koristi u dijagnostičke svrhe, već samo u istraživačkom radu.

Nedostaci reakcije:

• RIBT zahtijeva rad sa živom patogenom treponemom pallidum soja Nichols, koja ostaje zarazna za ljude unatoč prilagodbi na kuniće
• reakcija je složena, dugotrajna i skupa
• potreban je vivarij
• potrebno je visoko kvalificirano osoblje za postavljanje reakcije, bilježenje rezultata i održavanje vivarija
• subjektivnost evaluacije rezultata
• nedostatak automatizacije
• ne postoji način standardiziranja ove serološke metode.
• reakcija nije primjenjiva u pozadini antisifilitičke terapije koja je u tijeku
• nemogućnost korištenja za kontrolu izlječenja. RIBT u bolesnika sa sifilisom može ostati pozitivan dugi niz godina (pa čak i doživotno), unatoč primljenom potpunom liječenju.
• reakcija može dati lažno pozitivne rezultate u bolesnika s malignim tumorima, dijabetesom, gubom, autoimunim bolestima, upalom pluća, teškom kardiovaskularnom patologijom.

Prednosti RIBT-a su:

1) Dovoljno visoka osjetljivost;

2) Visoka specifičnost.

RIF (reakcija imunofluorescencije)

Reakcija imunofluorescencije (RIF) je ekspresna dijagnostička metoda za otkrivanje mikrobnih antigena ili otkrivanje antitijela. Testovi temeljeni na detekciji fluorescentnog signala smatraju se među najboljim testovima za sifilis.

1. Povijest metode

Fluorescentno antitijelo na treponeme (FTA) prvi su put razvili 1957. od strane Deacona i ostalih (Deacon, Falcone i Harris).

2. Princip metode

RIF metoda temelji se na činjenici da antigeni tkiva ili mikrobi tretirani imunološkim serumima s antitijelima obilježenim fluorokromima mogu svijetliti u UV zrakama fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu, tretirane takvim luminiscentnim serumom, svijetle duž periferije stanice u obliku zelenog ruba

Kao antigen u RIF-u koristi se suspenzija živih patogenih blijedih treponema Nichols soja iz orhitisa kunića, koja se suši na predmetnom predmetu i fiksira acetonom. Krvni serum bolesnika dodaje se u blijede treponeme osušene i fiksirane acetonom na staklo.

Nakon ispiranja pripravak se tretira serumom koji sadrži protutijela protiv humanih imunoglobulina obilježenih fluoresceinom. Još jednom, pripravak se ispere i gleda pod fluorescentnim mikroskopom. Ako test serum sadrži anti-treponemska fluoresceinska protutijela, primijetit će se žuto-zeleni sjaj treponema.

3. Način provođenja istraživanja RIF metodom

Antigen fiksiran na stakalcu (patogena treponema pallidum) obrađuje se test serumom. Nakon ispiranja, pripravak se tretira fluorescentnim anti-humanim imunoglobulinskim serumom obilježenim fluorokromom. U ovom slučaju, nastali fluorescentni kompleks (anti-humani globulin + fluorescein tioizocijanat) veže se za ljudski globulin na površini blijede treponeme, osiguravajući sjaj blijede treponeme pod fluorescentnim mikroskopom.

Za otkrivanje kompleksa antigen-antitijelo koristi se luminiscentni serum, koji predstavlja anti-vrste (anti-humane) imunoglobuline konjugirane s FITC-om. Prisutnost antitijela na treponeme u serumu određuje se sjajem treponema kada se pregleda pod fluorescentnim mikroskopom. Ispitivanje se provodi u kvalitativnoj i polukvantitativnoj verziji.

4. Računovodstvo rezultata

Vizualizacija rezultata RIF-a provodi se pomoću fluorescentnog mikroskopa. Rezultati se ocjenjuju stupnjem luminescencije treponema u preparatu. U prisutnosti antitijela vidljiv je sjaj treponema, ali ako u serumu nije bilo antitreponemskih antitijela, tada se treponemi ne vide. Stupanj luminescencije osušene blijede treponeme pričvršćene na staklo označen je u "plusima" (od "-" do "++++"). Negativan rezultat - bez sjaja ili razine pozadine - 1+.

5. U kojim razdobljima bolesti je bolje koristiti

Reakcija imunofluorescencije (RIF) prilično je osjetljiva u svim stadijima infekcije, od kraja inkubacije do kasnog sifilisa. Primarno razdoblje sifilisa u klasičnom tijeku počinje 3-4 tjedna nakon infekcije. RIF postaje pozitivan u prvim danima primarne menstruacije ili čak na kraju razdoblja inkubacije, od 3. tjedna nakon infekcije. Rezultati RIF-a ostaju pozitivni u svim razdobljima, uključujući i kasne oblike.

RIF postaje pozitivan nešto ranije od RW. Prema nekim izvješćima, pozitivan RIF javlja se u 80% bolesnika s primarnim seronegativnim sifilisom. U sekundarnom razdoblju RIF je pozitivan u gotovo 100% slučajeva. Uvijek je pozitivan kod latentnog sifilisa i daje 95-100% pozitivnih rezultata kod kasnih oblika bolesti i kongenitalnog sifilisa.

6. Osjetljivost i specifičnost

Reakcija imunofluorescencije (RIF) je skupina metoda visoke osjetljivosti i specifičnosti. RIF je osjetljiv u svim fazama infekcije, od razdoblja inkubacije do kasnog sifilisa. Prema WHO-u, osjetljivost RIF-a u primarnom sifilisu je 70-100%, u sekundarnom i kasnom sifilisu - 96-100%, specifičnost - 94-100%. Prema TsNIKVI-ju, osjetljivost RIF-a u svim oblicima sifilisa je 99,1%.

Specifičnost RIF-a može se povećati prethodnom obradom test seruma sorbentom – ultrazvučnim treponemskim antigenom koji veže grupna antitijela (RIF-abs).

7. Opseg metode

RIF se primjenjuje:

• kao potvrdna reakcija kod ranog, latentnog sifilisa
• za retrospektivnu dijagnozu
• za razlikovanje latentnih oblika sifilisa i lažno pozitivne rezultate istraživanja sifilisa.
• kao potvrdni test za neurosifilis.

RIF se naširoko koristi kao potvrdni test, ali nije namijenjen rutinskoj uporabi ili probiru jer ga je tehnički teško postaviti. Za izvođenje RIF-a potrebno je imati vivarij ili kupiti suspenziju patogenih blijedih treponema, što ograničava mogućnost reakcije. Međutim, posljednjih su se godina na domaćem tržištu počeli pojavljivati ​​testni sustavi koji omogućuju provođenje reakcije u nedostatku vivarija i vlastitog laboratorijskog soja patogene treponema pallidum.

8. Izvori i uzroci inscenacijskih pogrešaka, lažno pozitivnih i lažno negativnih

LPR pri postavljanju RIF-a su rijetki (s kolagenozama, boreliozom).

RIF se još uvijek smatra jednim od najboljih testova za sifilis, "zlatnim standardom" serodijagnostike. RIF je u usporedbi s RIBT-om jednostavniji za postavljanje,

Unatoč visokoj dijagnostičkoj vrijednosti, potreba za korištenjem živog T. pallidum, visoka cijena i trajanje studije ometaju rašireno uvođenje RIF-a u svakodnevnu praksu. Postavljanje reakcije je naporno. Osim toga, ocjena rezultata RIF-a je subjektivna.

Prednosti RIF-a i RIBT su:

1) Visoka osjetljivost (posebno za RIF);

2) Visoka specifičnost (osobito za RIBT).

Nedostaci RIF-a i RIBT:

1) Tehnička složenost, visoka cijena metoda.

2) Subjektivna ocjena rezultata, nedostatak automatizacije;

3) RIF i RIBT u bolesnika sa sifilisom mogu ostati pozitivni dugi niz godina (pa čak i doživotno), unatoč primljenom potpunom liječenju. Stoga se ove reakcije ne mogu koristiti za kontrolu izlječenja.

10. Modifikacije metode

U praksi se za serodijagnostiku sifilisa koristi i koristi se nekoliko modifikacija imunofluorescentne reakcije:

• RIF-abs- najosjetljivija metoda serodijagnostike sifilisa, postaje pozitivna ranije od ostalih reakcija (od 3. tjedna od infekcije);
• RIF-200(serum bolesnika se razrijedi 200 puta nakon prikaza) je vrlo specifična metoda za serodijagnostiku sifilisa.
• RIF-10(10 puta razrjeđivanje test seruma) - osjetljivija metoda od RIF-200.
• RIF-ts provodi s alkoholom.
• RIF-abs-IgM- otkrivanje ranih antitreponemskih antitijela IgM klase.

1. Najraširenija modifikacija RIF-abs- reakcija imunofluorescencije s apsorpcijom. Prije postavljanja reakcije, serum ispitanika iscrpljuje se mješavinom nepatogenih treponema kako bi se isključile križne reakcije. Grupna antitijela se uklanjaju iz proučavanog seruma pomoću kulturnih treponema uništenih ultrazvukom, što značajno povećava specifičnost reakcije. Budući da se testni serum koristi u razrjeđenju 1:5, RIF-abs je vrlo osjetljiv.

Glavne indikacije za primjenu RIF-abs u kliničkoj praksi su:

• dijagnoza latentnih i kasnih oblika sifilisa,
• otkrivanje lažno pozitivnih rezultata CSR-a i RMP-a, osobito u trudnica i somatskih bolesnika sa sumnjom na sifilis,
• uspostaviti retrospektivnu dijagnozu bolesti.

RIF-abs nije vrlo informativan u procjeni rezultata liječenja: u 85% bolesnika koji su primili adekvatnu antisifilitičku terapiju pozitivni rezultati RIF-a traju dugi niz godina.

Ova reakcija se naziva "zlatnim standardom" za serodijagnostiku sifilisa. Koristi se za arbitražne slučajeve, ali je za pouzdan rezultat potrebna svježa koncentrirana suspenzija soja T. pallidum Nichols iz orhitisa starog 7 dana kod kunića, koja se ne smije zamrznuti.

2. U SSSR-u je instaliran u dvije verzije - RIF-10 i RIF-200, tj. s razrjeđenjem test seruma za 10 i 200 puta. RIF-200 - testni serum se razrijedi 200 puta kako bi se smanjio broj lažno pozitivnih rezultata. To osigurava visoku specifičnost reakcije, ali njezina osjetljivost donekle opada. RIF-10 je osjetljiviji, ali češće daje nespecifične pozitivne rezultate od RIF-200, koji se odlikuje visokom specifičnošću. RIF-10 je osjetljiviji, RIF-200 i RIF-abs su specifičniji.

Osjetljivost RIF-200 i RIF-abs procjenjuje se na 84–99%, a specifičnost je 97–99%.

3. RIF-ts provodi s alkoholom. Reakcija se postavlja korištenjem cijele cerebrospinalne tekućine kako bi se identificirale specifične lezije CNS-a.

4. Reakcija RIF-abs-IgM predloženo za detekciju ranih antitreponemskih antitijela klase IgM. Ova se reakcija može koristiti za dijagnosticiranje kongenitalnog sifilisa, ranih oblika sifilisa, te za razlikovanje slučajeva reinfekcije i serorelapsa.

Poznate su dvije modifikacije ove reakcije:

– FTA-ABS-IgM, baziran na korištenju anti-IgM konjugata (fluoresceinom obilježena protutijela na ljudski IgM) u drugoj fazi reakcije umjesto anti-humanog fluorescentnog globulina;

- ruska inačica RIF-abs-IgM, naznačena time što se testnom krvnom serumu dodaje sorbent koji uklanja IgG antitijela, a RIF-abs se stavlja s preostalim IgM antitijelima.

Glavne indikacije na formulaciju RIF-abs-IgM su:

- serodijagnostika kongenitalnog sifilisa u nedostatku manifestacija kongenitalnog sifilisa na koži i sluznicama u djeteta;

- diferencijalna dijagnoza reinfekcije i kliničko-serološki ili serološki recidiv sifilisa, u kojem će RIF-abs-IgM biti negativan, a RIF-abs - pozitivan;

- procjena učinkovitosti terapije rano stečenog ili kongenitalnog sifilisa: nakon adekvatnog liječenja, RIF-abs-IgM postaje negativan unutar sljedećih 3-6 mjeseci.

Ova se reakcija može koristiti za otkrivanje kongenitalnog sifilisa. Poznato je da velike molekule IgM ne mogu proći kroz zdravu posteljicu. Stoga se antitijela klase M protiv treponema pallidum mogu pojaviti u tijelu djeteta ili zbog kršenja zaštitne funkcije placente, ili ih proizvodi tijelo djeteta sa sifilisom. Antitijela klase IgM pojavljuju se u krvi bolesnika sa sifilisom već u prvim tjednima bolesti, a protutijela klase IgG pojavljuju se kasnije. Odvojeno određivanje protutijela oba razreda izuzetno je korisno u dijagnostici kongenitalnog sifilisa u djece, jer će prisutnost antitijela klase IgM u djeteta u prvom mjesecu života ukazivati ​​na to da ih stvara tijelo djeteta sa sifilisom, dok će detekcija samo IgG antitijela ukazati na majčinsko porijeklo potonjih.

Izjava o reakciji 19S(IgM)-RIF-abs uključuje prethodno odvajanje gel filtracijom većih 19S IgM molekula iz

frakcije manjih 7S IgG molekula. Daljnja studija RIF-abs reakcije krvnog seruma koji sadrži samo 19S IgM frakciju,

eliminira sve moguće izvore grešaka. Ali tehnika postavljanja ove reakcije je složena i dugotrajna, zahtijeva posebnu opremu i obuku stručnjaka.

Reakcija imunološke adhezije (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Ova se reakcija temelji na korištenju fenomena koji je opisao Rieckenberg 1912. godine. RIP se temelji na činjenici da se virulentni treponemi tkiva, senzibilizirani serumom bolesnika sa sifilisom, prianjaju na površinu eritrocita u prisutnosti komplementa i eritrocita i, tijekom centrifugiranja, odnose se s njima u sediment, nestaju iz supernatant.

Za uspostavljanje reakcije koriste se sljedeći sastojci: test serum, antigen, komplement, donorski eritrociti, izotonična otopina natrijevog klorida. Kao antigen koristi se suspenzija blijede treponema Nicholsovog soja.

Najšire u odnosu na serodijagnostiku sifilisa, ovaj test proučavali su domaći i strani autori 50-60-ih godina. Podaci o vrijednosti RIP-a kao dijagnostičkog testa bili su proturječni. Reakcija je zahtijevala maksimalnu točnost, jer su se netočnim ulijevanjem sastojaka, s viškom ili nedostatkom ispitnog materijala u pripravku, dobivali nepouzdani rezultati.

U Rusiji je opsežna istraživanja proveo L.V. Sazonova, koji je dobio slične rezultate u RIP-u i RIT-u koristeći svježe pripremljenu suspenziju patogenih blijedih treponema soja Nichols. Međutim, uporaba antigena zagrijanog ili konzerviranog fenolom oštro je iskrivila rezultate reakcije i učinila antigen nestabilnim. Preporučite ovaj test za zamjenu RIT L.V. Sazonova je to smatrala nemogućim.

G.P. Avdeeva je, koristeći druge temperaturne i vremenske režime u pripremi antigena, dobila različite rezultate u proučavanju RIP-a. Prema njezinim riječima, osjetljivost ove reakcije je veća od osjetljivosti KCP-a i RIT-a, ali nešto inferiorna u odnosu na RIF, a specifičnost RIP-a, RIT-a i RIF-a je bliska.

Međutim, nedostatak proizvodnje antigena za RIP nije omogućio šire proučavanje ovog testa i njegovo uvođenje u praksu.

RPHA reakcija pasivne hemaglutinacije

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA) je uobičajen serološki test koji je čvrsto ukorijenjen u laboratorijskoj praksi. ima prilično visoku razinu učinkovitosti u studiji.

1. Povijest RPHA metode

Po prvi put su G.Blumental i W.Bachman (1932) izvijestili o upotrebi RPHA za dijagnozu sifilisa. Godine 1965. za dijagnozu sifilisa predložena je neizravna ili pasivna reakcija hemaglutinacije. Modifikacije reakcije korištenjem različitih antigena izvijestio je T. Ratlev 1965. - 1967. godine. Mikromodifikaciju RPGA predložio je Sokh R.M. i koautori 1969. Prvi komercijalni testni sustav razvili su japanski znanstvenici Tomisava et. al. godine 1969. godine

2. Princip RPGA metode

Iz pripremljene homogene suspenzije eritrocita "nabijenih" antigenima, kada se doda test serum koji sadrži antitijela, taloži se talog u obliku pahuljica. Nastali precipitat sastoji se od eritrocita "zalijepljenih" antitijelima, a naziva se "hemaglutinirati". Suspenzija eritrocita se priprema unaprijed i isporučuje kao dio dijagnostičkih testnih sustava.

Proces lijepljenja crvenih krvnih stanica, na čijoj površini su prisutni antigeni, naziva se "hemaglutinacija". Vezanje nastaje pod djelovanjem specifičnih antitijela (aglutinina). Reakcija se zove "pasivno", jer vlastiti antigeni eritrocita ne reagiraju, a sami eritrociti obavljaju isključivo pomoćnu indikatorsku funkciju.

Pasivna (indirektna) reakcija hemaglutinacije je vrsta reakcije aglutinacije u kojoj se kao nositelji antigena koriste eritrociti (od grčkog háima - krv), a ne druge čestice. Općenito, u reakciji aglutinacije pod djelovanjem antitijela, mikrobi ili druge stanice se lijepe i talože - ne nužno eritrociti, već, na primjer, čestice lateksa, bakterije ili druge korpuskularne čestice koje nose antigen.

U reakciji pasivne hemaglutinacije za dijagnozu sifilisa kao antigen se koriste eritrociti ovnova ili ptica obloženi antigenima blijede treponema. Kada se doda serum koji sadrži specifična antitijela, eritrociti se lijepe (aglutinacija).

Reakcija RPHA naziva se imunološkim metodama, jer. temelji se na specifičnoj interakciji antigena patogene treponema pallidum s protutijelom. U skladu s "teorijom rešetke" aglutinacija je rezultat "poprečnog povezivanja" molekula površinskog antigena s molekulama antitijela (imunoglobulini).

3. Iskaz reakcije pasivne hemaglutinacije

RPHA se stavlja u plastične tablete ili u epruvete s razrjeđenjima krvnog seruma bolesnika u koje se dodaje eritrocitni dijagnostikum.

Proces spajanja antigena s eritrocitima naziva se senzibilizacija, a umjetni korpuskularni antigen dobiven na ovaj način naziva se senzibilizirani eritrociti. Dijagnostikumi eritrocita nazivaju se eritrociti osjetljivi na antigen.

Za pripremu dijagnostikuma koriste se eritrociti ovna ili ptice (obično piletine) tretirani prvo formalinom, a zatim taninom, koji se senzibiliziraju ultrazvučnim antigenom patogene treponema pallidum (Nicholsov soj) ili rekombinantnim proteinima treponema pallidum (TpN17, TpN17, TpN47). Mogu se koristiti i ovčji eritrociti senzibilizirani ultrazvučnim antigenom kultivirane treponema pallidum.

Samo serum (nemojte koristiti plazmu). Hemolizirani i zamućeni uzorci nisu prikladni. Nesenzibilizirani eritrociti služe kao negativna kontrola (da se isključi prisutnost anti-eritrocitnih protutijela). U svakoj seriji produkcija koristite pozitivne i negativne kontrole.

U jažice (stanice) imunološke tablete unose se uzorci ispitivanog krvnog seruma i test eritrocita. Ako bolesnikov krvni serum sadrži specifična anti-treponemska antitijela, onda kada se test serum doda u jažicu s antigenom, nastaju kompleksi antigen-antitijelo koji su povezani s površinom nositelja (eritrocita). Vizualno se to očituje lijepljenjem crvenih krvnih stanica, odnosno hemaglutinacijom, što je vidljivo golim okom. Imunološki kompleksi "antitijelo-antigen-eritrocit", koji se postupno spuštaju pod utjecajem gravitacije, raspoređeni su po cijeloj površini dna zdenca i tvore karakterističnu sliku "obrnutog kišobrana".

Ovisno o količini antitijela sadržanih u ispitivanom uzorku, slika "obrnute kišobran" varira od maksimalne, koja zauzima cijelu površinu dna bušotine, do malog područja u središnjem, najnižem dijelu (sa prosvjetljenjem u središte i stvaranje intenzivnijeg prstena staloženih eritrocita duž periferije).

Imunološki kompleksi ne nastaju ako u uzorku nema specifičnih antitijela ili kada se reakciji dodaju kontrolni (netaknuti) eritrociti. Istodobno, eritrociti se postupno skupljaju na najnižoj točki dna bunara, tvoreći lik u obliku kompaktne točke ili "gumbi", ponekad s blagim prosvjetljenjem u središtu.

Ako ljudski krvni serum sadrži anti-eritrocitna antitijela, tada će u svakom slučaju nastati "kišobran" - kako u reakciji s test eritrocitima, tako i s kontrolnim eritrocitima. U ovom slučaju preporučuju se druge medicinske tehnologije za otkrivanje specifičnih antitreponemskih protutijela.

Moguć je fenomen prozone (nemogućnost reakcije zbog viška antitijela) koji se eliminira razrjeđivanjem seruma.

4. Obračunavanje rezultata reakcije pasivne hemaglutinacije

Rezultati RPGA se uzimaju u obzir vizualno nakon 60-120 minuta pri postavljanju mikrometode i nakon 2-4 sata ili sljedeći dan pri postavljanju makrovarijante. Pri korištenju većih (nukleiranih) eritrocita ptica dobiva se jasnija slika, a rezultati se bilježe ranije.

Moguće je odrediti titar (visoki titar TPHA ≥ 1:2 560).

Rezultati istraživanja ocjenjuju se prema 4+ sustavu (od "-" do "++++") prema veličini formiranog filma. Kada dođe do aglutinacije, eritrociti se nalaze na površini jažice u obliku "kišobrana", a s negativnim rezultatom, eritrociti slobodno klize prema dolje i akumuliraju se na dnu u središtu jažice u obliku "gumbi". ".

Općeprihvaćena ocjena rezultata RPGA:

4+ - pozitivan RPHA. Aglutinirani eritrociti u obliku "kišobrana" ravnomjerno oblažu cijelu površinu rupe;

3+ - pozitivan RPHA. Eritrociti oblažu cijelu površinu rupe, ali neki od njih "skliznu" u središte. Istodobno se uz periferiju naslage formira zamjetan prsten;

2+ - slabo pozitivan RPHA. Eritrociti tvore film na maloj površini donjeg dijela jažice, tvoreći gusti prsten sedimenta eritrocita s primjetnim prosvjetljenjem u sredini;

1+ - neodređeni RPHA, eritrociti tvore labav sediment na dnu jažice s nejasnim rubovima i blagim lumenom u sredini;

(–) - negativan RPHA, svi eritrociti leže na dnu jažice u obliku kompaktnog sedimenta ("gumbi" ili ringlets) na čistoj okolnoj pozadini (bez okolne granularne sedimentacije).

U inozemnoj praksi rezultati RPGA također se ocjenjuju kao reaktivni (u slučaju stvaranja aglutinata), slabo reaktivni (ako su tvorbe beznačajne) i nereaktivne (ako se aglutinacija ne opaža).

Obračun rezultata reakcije može se izvršiti automatski pomoću posebnih analizatora. Osim kvalitativne studije, svi testni sustavi omogućuju kvantitativnu analizu s određivanjem titra.

5. U kojim razdobljima bolesti je bolje koristiti RPHA

RPHA postaje pozitivan sredinom primarne menstruacije (7-8 tjedana od trenutka infekcije, 3-4 tjedna nakon pojave tvrdog šankra) i ostaje pozitivan godinama nakon liječenja.

Uz vrlo visoku razinu antitijela na treponemu u proučavanom serumu (što je najkarakterističnije za sekundarni sifilis) moguć je lažno negativan rezultat TPHA (tzv. fenomen „prozone“).

Specifična aglutininska protutijela otkrivaju se u krvi osoba koje su duže vrijeme bolovale od sifilisa, pa se RPGA ne može preporučiti za diferencijalnu dijagnozu reinfekcije ili za određivanje težine infektivnog procesa.

RPGA se ne koristi za kontrolu ozdravljenja, jer. može ostati pozitivan mnogo godina nakon oporavka. Istodobno, može se koristiti kao dodatna (RMP ili RPR) metoda u praćenju učinkovitosti liječenja, istražujući dinamiku smanjenja titra antitijela. Preduvjet za to je korištenje istog RPGA testnog sustava kao i pri prvom (prije tretmana) pregledu bolesnika, kao i studija u istom laboratoriju.

6. Osjetljivost i specifičnost RPHA

RPHA se smatra vrlo osjetljivim i specifičnim testom. Ova reakcija je vrijedan dijagnostički test kod svih oblika sifilisa, ali je posebno osjetljiva u uznapredovalim oblicima bolesti. Osjetljivost RPHA varira ovisno o stadiju bolesti. S primarnim sifilisom, osjetljivost RPHA je 76% (i viša), sa sekundarnim sifilisom - do 100%. S latentnim ranim - 97%, s kasnim sifilisom - 94%, sa specifičnošću od 98-100%. Manja osjetljivost kod svježih oblika bolesti posljedica je kasnijeg stvaranja aglutinina.

Prema Državnoj ustanovi "TsNIKVI Roszdrav", osjetljivost RPHA u dijagnozi različitih oblika sifilisa bila je 99,4%. Većina istraživača bilježi 98-99% specifičnosti RPHA.

Po osjetljivosti i specifičnosti RPHA nije inferioran, a u kasnim oblicima i kongenitalnom sifilisu čak nadmašuje RIF i RIBT.

7. Opseg primjene RPGA metode

TPHA se može koristiti i kao probirni i kao potvrdni test; može se koristiti u polukvantitativnoj varijanti s izračunom titra antitijela. Razvijena je kvantitativna metoda za postavljanje RPHA, mikrometoda, kao i automatizirana reakcija mikrohemaglutinacije.

8. Značajke, prednosti i nedostaci RPHA

Prema literaturi, RPGA dosljedno zauzima vodeću poziciju u kliničkoj praksi u većini zemalja svijeta. TPHA je najčešće korišteni test u klinikama za spolno prenosive bolesti u inozemstvu.

RPGA tehnika je jednostavna za izvođenje, ne zahtijeva posebnu opremu: za postavljanje je potrebna samo hemaglutinacijska ploča. Studij ne traje dugo; reakcija je vrlo osjetljiva i specifična. Apromacija metode u kliničkoj praksi pokazala je da je iznimno jednostavna, jeftina i osjetljiva. Kao i ELISA, RPHA je jednostavna za izvođenje, ne zahtijeva visokokvalificirano osoblje i posebnu opremu, a moguća je i automatizacija.

Prednosti RPGA testa:

• jednostavan za postavljanje i tumačenje,
• ne zahtijeva posebnu opremu,
• vrijeme za dobivanje rezultata - 45 minuta,
• pogodan za masovni probir (potrebno je samo 25 µl seruma u razrjeđenju 1:20),
• visok stupanj standardizacije,
• prisutnost internih kontrola,
• dugi rok trajanja
• prihvatljiva cijena
• mogućnost automatizacije računovodstva.

Također treba napomenuti nedostatke RPGA:

• mogućnost nespecifičnih reakcija u prisutnosti antieritrocitnih protutijela,
• nedostatak korelacije titra i stadija sifilisa,
• kasnija pozitivna reakcija u ranim stadijima sifilisa,
• mogućnost lažno pozitivnih reakcija kod osoba koje su uzimale alkohol, ovisnika o drogama,
• osjetljivost na vibracije i temperaturu u laboratoriju.

Prednosti RPGA u odnosu na RIBT i RIF su:

• korištenje industrijskih sustava za ispitivanje,
• mogućnost automatizacije reakcije,
• nema potrebe raditi sa živom blijedom treponemom,
• eliminira potrebu za vivarijem.

9. Izvori i uzroci pogrešaka u postavljanju RPHA, lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata

Reakcija pasivne hemaglutinacije je relativno jednostavna studija; pri njegovom izvođenju potrebno je pridržavati se svih preporuka proizvođača dijagnostikuma i pravila rada u kliničko-dijagnostičkom laboratoriju. Učinjene pogreške mogu dovesti do pojave i registracije lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata reakcije. Lažno pozitivni rezultati RPGA mogu biti posljedica utjecaja ljudskog faktora i bioloških čimbenika.

Mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati

• u proučavanju krvnih seruma bolesnika s nevenerijskim treponematozama,
• zbog reumatoidnog faktora
• zbog unakrsne reakcije protutijela s antigenom treponeme, koja nastaju tijekom različitih sistemskih ili lijekovima induciranih metaboličkih poremećaja,
• zbog abnormalne razine imunoglobulina;
• u novorođenčadi - zbog stvaranja u tijelu fetusa ili djeteta IgM protutijela na majčin IgG, što otežava tumačenje rezultata i dijagnozu kongenitalnog sifilisa.

Pogreške uzrokovane utjecajem faktora ljudskog sudjelovanja na studiju:

• kontaminirane mikropločice
• pogrešno pipetiranje
• vibracije u laboratoriju
• temperatura zraka u laboratoriju je izvan temperaturnog raspona: 18–25 stupnjeva

Najtipičnije tehničke pogreške u postavljanju RPGA, koje dovode do nepouzdanih rezultata, uključuju:

• netočno razrjeđivanje sastojaka,
• kršenje temperature,
• kršenje vremena inkubacije reagensa,
• kršenje uvjeta primjene reagensa na tabletu,
• neusklađenost pH otopina s potrebnim,
• kontaminacija laboratorijskog staklenog posuđa.

Sljedeće tehničke točke također mogu biti izvor pogrešaka pri postavljanju RPGA:

• isključenje iz formulacije reakcije kontrolnih krvnih seruma;
• neujednačena koncentracija eritrocita u dijagnostikumu zbog nedovoljnog miješanja prije upotrebe;
• kršenje rokova i uvjeta skladištenja dijagnostikuma i kontrolnih eritrocita; korištenje kompleta s isteklim rokom trajanja;
• korištenje kontaminiranih epruveta, vrhova pipeta, pipeta, imunoloških pločica, otopina pri postavljanju reakcija;
• netočnosti u početnom razrjeđivanju uzorka krvnog seruma;
• nedovoljna temeljitost u izvođenju uzastopnih dvostrukih razrjeđivanja;
• nepoštivanje temperaturnog režima i vremena inkubacije;
• prisutnost vanjskih vibracija i tresenje imunološke ploče tijekom inkubacije;
• kršenje metode postavljanja RPGA, izraženo u odbijanju provođenja studije s kontrolnim eritrocitima.

Korištenje krvne plazme koja sadrži antikoagulanse koji mogu uzrokovati nespecifičnu aglutinaciju eritrocita (RPHA) može dovesti do rezultata koji se ne mogu protumačiti.

Broj lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata manji je nego kod ostalih seroloških pretraga. LPR u okruženju RPHA su rijetki i mogući s treponematozama (zavijanje, bejel, pinta). Također, zabilježeni su lažno pozitivni rezultati (manje od 1% ukupno) u ovisnika o drogama, u bolesnika s infektivnom mononukleozom, boreliozom, gubom, s kolagenozom, cirozom jetre, limfosarkomom, te u trudnica.

Lažno negativni rezultati reakcije mogu biti posljedica natjecanja između IgM i IgG protutijela. Lažno negativni rezultati mogući su i kod pacijenata zaraženih HIV-om.

10. Modifikacije RPHA metode

Postoje mikro i makro modifikacije RPGA postavke, prva se češće koristi zbog ekonomičnosti, brzine postavljanja i uzimanja u obzir rezultata.

Osim toga, razvijen je automatski dijagnostički kompleks za analizu slike koji je omogućio kvantitativnu automatsku procjenu rezultata i eliminirao subjektivnost u interpretaciji dobivenih podataka. Hardversko-softverski kompleks prepoznaje sliku, obrađuje podatke i daje odgovor u relativnim jedinicama.

Čitači i automatski analizatori također se koriste za automatizaciju snimanja RPGA rezultata.

TPPA (Treponema pallidum particle aglutination) - test aglutinacije umjetnih čestica za otkrivanje antitijela na Treponema pallidum

Kratak opis TPPA testa

Trenutno se za dijagnosticiranje sifilisa koristi i modifikacija metode pasivne hemaglutinacije - TPRA (Treponema pallidum particle aglutination) u kojoj je antigen blijede treponeme fiksiran na česticama želatine. Budući da čestice umjetnog polimera nemaju vlastite antigene koji određuju biološku aktivnost, onda se setovi za serodijagnostiku sifilisa na temelju njih imaju razloga smatrati naprednijim. Korištenje biološki inertnih umjetnih čestica minimizira nespecifičnu aglutinaciju koja se obično viđa kod drugih nosača.

TPPA se koristi za serološku dijagnostiku antitijela na različite vrste i podvrste patogenih treponema. Ovaj test se može koristiti za otkrivanje antitijela na uzročnike sifilisa, pinte, bejela i freskanja.

Postupak proučavanja je vrlo jednostavan i ne zahtijeva posebnu opremu – koriste se standardne mikroploče u obliku slova "U". Test se temelji na aglutinaciji čestica želatine senzibiliziranih antigenima T. pallidum, antitijelima pronađenim u krvnom serumu pacijenta.

TPPA je potvrdni treponemski test koji se može prikladno koristiti i za mali broj uzoraka i za masovni probir. TPPA se u inozemstvu koristi kao potvrdni test i za zamjenu mikrohemaglutinacijskog testa MHA-TP (mikrohemaglutinacijski test za antitijela na T. pallidum).

Osjetljivost TPPA testa je između 85% i 100%, dok je specifičnost između 98% i 100%. Osjetljivost TPPA za primarni sifilis je 88%, za sekundarni i kasni latentni sifilis 98%-100%.

Ako se TPPA koristi za dijagnosticiranje sifilisa, antitijela na druge vrste treponema (kao što je T. pallidum endemicum, pertenu ili carateum) mogu uzrokovati lažno pozitivne rezultate. Postoji niz metoda za uklanjanje ovih protutijela iz uzoraka seruma prije početka testa.

Princip TPPA testa

TPPA je metoda pasivne aglutinacije za čestice želatine u ljudskom serumu ili plazmi. Serum koji sadrži protutijela na patogenu treponemu reagira s česticama želatine osjetljivim na antigen blijede treponema Nichols soja, podvrgnute ultrazvuku. Kao rezultat reakcije nastaje glatki film aglutiniranih želatinskih čestica u jažici mikrotitarske ploče.

Ako antitijela nisu prisutna, čestice se talože na dno jažice ploče, tvoreći kompaktni "gumb" neaglutiniranih čestica. Kontrolne jažice s neosjetljivim česticama želatine također bi trebale pokazivati ​​tako kompaktno "gumb" za svaki serum, tj. bez aglutinacije.

Primjena TPPA testa

TPRA je univerzalni test koji se jednako uspješno može koristiti i u obveznom preventivnom pregledu populacijskih skupina na sifilis (probir) i u specijaliziranim dermatovenerološkim ustanovama. Prednost TPPA testa je njegova visoka osjetljivost, koja nije inferiorna u odnosu na klasične testove koji su donedavno bili „zlatni standard“ za serodijagnostiku sifilisa. Ostale prednosti testa su visoka ponovljivost, kao i jednostavnost i brzina postavljanja reakcije.

TPPA test se koristi za potvrđivanje pozitivnih rezultata netreponemskih testova probira na sifilis, kao što je VDRL test, i za procjenu pacijenata s negativnim netreponemskim testovima, ali koji imaju znakove ili simptome koji upućuju na kasni sifilis. Ne preporučuje se korištenje TPPA kao jedinog probirnog testa za sifilis.

Osim toga, TPPA aglutinacijski test može se koristiti za ispitivanje uzoraka cerebrospinalne tekućine u dijagnozi neurosifilisa. U ovom slučaju, kao i kod drugih seroloških pretraga, interpretaciju rezultata treba provesti uz obveznu kombinaciju s drugim pokazateljima i simptomima bolesti.

Rezultati TPPA testa

Rezultat se ocjenjuje prema sustavu "plusova" - od (-) do (2+). Rezultati ispitivanja vidljivi su golim okom i tumače se na sljedeći način:

Stupanj aglutinacije	Rezultat testa	Tumačenje
Aglutinirane čestice ravnomjerno oblažu dno ploče	2+	Pozitivan
Značajan veliki prsten s neravnim vanjskim rubovima i perifernom aglutinacijom	1+	Pozitivan
Čestice tvore kompaktan prsten s razmakom u sredini i glatkom vanjske granice	±	slabo pozitivan
Čestice tvore kompaktan prsten u središtu bušotine s blagim razmakom u sredini i glatkom vanjskom granicom.	–	Negativan
Čestice tvore "gumb" u središtu rupe s glatkom vanjskom granicom	–	Negativan

Rezultati se bilježe kako bi se utvrdila usklađenost s gornjim opisom. Uzorke koji pokazuju neodređeni rezultat (±) treba ponovno ispitati. U slučaju da uzorak pokazuje neodređeni rezultat u nekoliko TPPA testova, preporuča se provesti istraživanje drugim metodama.

Rezultate analize ne treba promatrati zasebno. Na primjer, u ranoj fazi infekcije, broj antitijela je još uvijek premali, zbog čega TPPA i mnoge druge metode nemaju osjetljivost. Stoga, ako se sumnja na sifilis, čak i ako su rezultati testa negativni, uzorci se moraju ponovno pregledati. Za postavljanje dijagnoze potrebno je uzeti u obzir kliničke simptome koje bolesnik ima, anamnezu i druge podatke.

Kao i u TPHA testu, fenomen prozona i lažno negativan rezultat mogu se uočiti za TPPA ako uzorak seruma sadrži previsok titar protutijela.

ELISA - ELISA

Enzimski imunoesej (ELISA; Enzimski imunosorbentni test, ELISA) jedna je od mnogih metoda za serološku dijagnostiku zaraznih bolesti. Enzimski imunotest (ELISA) u serodijagnostici sifilisa je test za antitijela klasa M, G i A (IgM, IgG, IgA) protiv antigena blijede treponema. Moguće je provesti ELISA s cerebrospinalnom tekućinom.

Uvođenje u praksu enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) umjesto Wassermanove reakcije i drugih kardiolipinskih testova značajno je poboljšalo kvalitetu laboratorijske dijagnostike sifilisa. Značajna prednost ove metode je mogućnost automatizacije procesa istraživanja, čime se smanjuje utjecaj ljudskog faktora.

1. Povijest ELISA metode

Osnovne principe enzimskog imunotestiranja na površini čvrstog nosača razvili su E. Engvar i sur. (1971), B.Van Weeman i A.Schuurs (1971). Enzimski imunotest koji su razvili prvi su predložili za dijagnozu sifilisa 1975. godine J. Veldkamp i A. Visser, koji su cijenili potencijal ovog automatiziranog testa. ELISA se počela široko koristiti u dijagnostici sifilisa 1980-ih, kada su razvijeni i certificirani dijagnostički testovi i standardizirane metode ispitivanja. U SSSR-u su tehniku ​​ELISA za dijagnozu sifilisa razvili V.N. Bednova, A.V. Babiy i A.V. Kotrovsky (1982., 1983.).

2. Princip ELISA metode

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) prema mehanizmu reakcije blizak je RIF-u (otkrivaju se ista protutijela). Reakcija imunološkog enzima klasificira se kao imunološka reakcija koja se temelji na visoko specifičnoj interakciji antigena treponema pallidum s antitijelima bolesnika sa sifilisom.

U sifilidološkoj praksi uglavnom se koristi neizravna varijanta ELISA-e. Princip najčešće korištene varijante neizravne reakcije je sljedeći. Na površini jažica polistirenske ploče fiksirani su imunološki kompleksi koji nastaju tijekom interakcije antitijela bolesnika sa sifilisom s antigenima blijede treponema. Nakon toga se detektiraju u reakciji boje upotrebom specifičnih konjugata i odgovarajućih kromogenih aditiva supstrata.

Postupak za provođenje testa je sljedeći: pacijentov serum se stavlja na čvrstofazni nosač na koji je pričvršćen antigen. U prisutnosti antitijela u njemu, na površini nosača nastaje kompleks antigen-antitijelo. Za "manifestaciju" rezultata reakcije koriste se anti-specifična protutijela na ljudski Ig konjugirana s enzimskim markerima. U slučaju pozitivne reakcije, enzim vezan za kompleks antigen-antitijelo razgrađuje supstrat koji je dodan u sustav, što rezultira razvojem bojenja različitog intenziteta.

U reakciji se određivanje kompleksa AG i AT adsorbiranog na čvrstoj fazi provodi korištenjem antiglobulinskih protutijela obilježenih enzimom, prema reakciji boje enzima sa supstratom.

U reakciji se određivanje kompleksa antigena i antitijela adsorbiranih na čvrstoj fazi provodi pomoću enzimom obilježenih antiglobulinskih protutijela.

ELISA predstavlja mogućnost otkrivanja serumskih Ig različitih klasa. Na tržištu postoje sustavi koji vam omogućuju odvojeno određivanje IgM i IgG i ukupnih antitijela.

Specifični antigeni koji se koriste za ELISA mogu imati različito podrijetlo:

ultra-glasno- dobiveni su kao rezultat uništavanja bakterijske stanice T.pallidum ultrazvukom ili drugom metodom;

rekombinantna- dobiveni su tehnologijama genetskog inženjeringa uvođenjem u genom bakterijske stanice (npr. Escherichia coli E.Coli) gena odgovornog za sintezu određenog antigena T.pallidum, nakon čega slijedi rast bakterijske mase mikroorganizam koji proizvodi, uništavanje tih stanica, izolacija i pročišćavanje antigena;

peptid- dobiveno kao rezultat sekvencijalne kemijske sinteze antigenskih epitopa proteina T.pallidum.

Tijelo je u stanju formirati antitijela na gotovo svaki dio molekule antigena. U normalnom imunološkom odgovoru to se obično ne događa. Jedan ili više imunogenih peptida izoliranih iz proteinskog antigena imaju posebnu antigenost, a većina antitijela nastaje specifično za njih. Razvijaju najintenzivniji imunološki odgovor. Najinformativniji u ELISA-i pokazao je imunodominantna područja proteina blijede treponema s molekulskom težinom od 15 kD, 17 kD i 47 kD. Kao antigen korišten je deterdžentni ekstrakt ili sonikat patogenih treponema Nichols soja.

3. Način provođenja istraživanja metodom

Princip metode je identificirati specifični kompleks antigen-antitijelo adsorbiran na čvrstoj fazi (površina jažica plastične ploče) s antiglobulinskim protutijelima obilježenim enzimom (peroksidazom) pomoću reakcije u boji sa supstratom, koji je kvantificirano spektrofotometrijski.

Antigeni koji se koriste za preosjetljivost jažica polistirenske ploče mogu biti:

• lizat- dobiveno kao rezultat uništavanja blijede treponema ultrazvukom;
• peptid- dobiveni kao rezultat kemijske sinteze fragmenata proteina blijede treponeme i imaju antigensku reaktivnost sličnu izvornim proteinima patogena;
• rekombinantna- dobiveni metodama genetskog inženjeringa, noseći antigenske determinante identične blijedoj treponemi.

U sifilidološkoj praksi obično se koristi neizravna varijanta ELISA.

4. Računovodstvo rezultata

U ELISA-i, za vizualizaciju reakcije antigen-antitijelo, koristi se enzimska reakcija (alkalna fosfataza ili peroksidaza hrena) sa supstratom koji mijenja svoju boju. Intenzitet boje određuje pozitivnost reakcije (od "-" do "++++"). Rezultati ELISA-e mogu se procijeniti vizualno na sustavu od 4 točke ili instrumentalno u obliku digitalnih indikatora optičke gustoće dobivenih na posebnim čitačima (kao što je Multiscan) na valnoj duljini od 492 nm. Jer evaluacija rezultata se provodi spektrofotometrijski, što isključuje subjektivnu interpretaciju.

5. U kojim razdobljima bolesti je bolje koristiti

Uvjeti ELISA pozitivnosti - od 4. tjedna od infekcije. Rezultati ELISA (kao i RIF) postaju pozitivni u prvim danima primarne menstruacije ili na kraju inkubacije i ostaju pozitivni u svim razdobljima. ELISA je posebno vrijedna u ranoj dijagnostici sifilisa - pozitivni rezultati antitijela mogu se dobiti već na kraju inkubacije bolesti (tj. 4-6 tjedana nakon infekcije).

6. Osjetljivost i specifičnost

ELISA je vrlo osjetljiv i specifičan test, što je njegova prednost. ELISA u smislu mehanizma reakcije, osjetljivosti i specifičnosti je blizu RIF, tk. u obje reakcije sudjeluju ista antitijela. Većina istraživača bilježi visoku specifičnost i osjetljivost u svim fazama bolesti. Osjetljivost različitih varijanti ELISA, prema G. A. Dmitrievu, doseže 98-100%, a specifičnost je 96-100%. Prema TsNIKVI, osjetljivost ELISA za sifilis je 99,1% (Naredba br. 87 M3 Ruske Federacije).

Varijanta solid-phase ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) jedan je od najosjetljivijih seroloških testova, koji omogućuje detekciju 0,0005 µg/ml antitijela i 0,000005 µg/ml antigena.

7. Opseg metode

Metodu se preporučuje za pregled trudnica, kontakt osoba, darivatelja i predstavnika rizičnih skupina. ELISA se može koristiti i kao probirni i kao potvrdni test. U relativno kratkom vremenu svoje povijesti, ELISA je evoluirala iz indikativnog testa u potvrdni test. U dijagnozi sifilisa, test se također koristi kao potvrdni test za uzorke koji pokazuju pozitivne rezultate koristeći različite netreponemske testove i TPHA.

ELISA metoda se može koristiti kvantitativno uz izračun indeksa pozitivnosti, odnosno reaktivnosti, što vam omogućuje procjenu razine antitijela u uzorku.

Trenutno je u Rusiji primjena enzimskog imunotesta za dijagnozu sifilisa regulirana Naredbom Ministarstva zdravstva Ruske Federacije br. 87 od 26. ožujka 2001. "O poboljšanju serološke dijagnoze sifilisa" (Dodatak br. 1 "Postavljanje probirnih i dijagnostičkih testova za sifilis"). U narudžbi se planira zamijeniti RSK u kompleksu seroreakcija (SSR) s ELISA i RPHA.

8. Izvori i uzroci inscenacijskih pogrešaka, lažno pozitivnih i lažno negativnih

Enzimska imunoanaliza je složena višestupanjska studija, u kojoj je potrebno strogo slijediti sve preporuke proizvođača dijagnostičkih kompleta, pravila za podešavanje i konfiguraciju opreme koja se koristi u studiji.

Sljedeće točke mogu biti izvor pogrešaka prilikom postavljanja ELISA:

Ispitivanje reakcije hiperlipidemijskog, hemoliziranog krvnog seruma ili uzoraka sa znakovima rasta bakterija;

Nemojte prakticirati dvostruko ili više zamrzavanja uzorka biološkog materijala, ako je potrebno, ponovno ispitivanje, koristite serum iz duple epruvete;

Kršenje uvjeta skladištenja imunosorbenta i otopine za pranje; korištenje testnih kompleta kojima je istekao rok trajanja;

Primjena reakcijskih komponenti iz drugih dijagnostičkih kompleta;

Kršenje vremena faza reakcije;

Sušenje jažica imunološke ploče tijekom koraka reakcije;

Ponovno korištenje plastičnih posuda (plastičnih ladica) za pripremu mješavine kromogena i supstrata;

Neusklađenost s učestalošću mjeriteljske kontrole parametara rada korištenih uređaja (perilica i spektrofotometar);

Korištenje kontaminiranog laboratorijskog staklenog posuđa pri postavljanju reakcija: tikvice, mjerni cilindri, epruvete, pipete, vrhovi za pipete;

Nedovoljna temeljitost u obavljanju razrjeđenja uzoraka biološkog materijala;

Pogreške prilikom unošenja uzorka biološkog materijala u odgovarajuću jažicu tablete;

Pogreške prilikom prijenosa rezultata istraživanja u dnevnik registracije, protokol studije ili obrazac za odgovore.

Pažljivo provođenje preporuka uputa za korištenje dijagnostičkih testnih kompleta, redovita provjera točnosti dozatora za pipete i automatskih uređaja, korištenje internih pozitivnih i negativnih kontrola omogućuju dobivanje visoko ponovljivih ELISA rezultata.

9. Značajke, prednosti i nedostaci

ELISA se odnosi na moderne, obećavajuće metode serodijagnostike sifilisa zbog svoje jednostavnosti, ponovljivosti i dostupnosti. Detekcija antitijela ELISA-om idealna je dijagnostička metoda prikladna za istovremeno ispitivanje velikog broja uzoraka. Zbog svojih prednosti stekao je popularnost u svim zemljama.

Tehnologija ELISA istraživanja osigurava usklađenost sa svim preporukama proizvođača komercijalnih dijagnostičkih testnih kompleta i temeljitost postupka istraživanja. Za provođenje istraživanja u ELISA-i potrebno je kupiti dodatnu posebnu opremu. Tehnika postavljanja traje dulje u usporedbi s RMP, RPR i RPGA.

Prisutnost automatizacije niza faza ili cijelog procesa u cjelini omogućuje istovremeno ispitivanje velikog broja uzoraka biološkog materijala s visokim stupnjem standardizacije studije, minimizirajući subjektivni element u procjeni rezultata, mogućnost pohranjivanja fiksnih protokola studija, što omogućuje arhiviranje podataka studija i ponovno upućivanje na njih za retrospektivnu analizu.

prednosti:

• Omogućuje diferencirano i ukupno određivanje IgM i IgG protutijela na uzročnika sifilisa.
• visoka osjetljivost i specifičnost koja se približava 100%,
• reproduktivnost
• mogućnosti automatizacije

Prednosti ELISA-e uključuju visoku specifičnost (96-100%) i osjetljivost (98-100%) koju je primijetila većina istraživača.

Prisutnost automatizacije niza faza ili cijelog procesa u cjelini omogućuje istovremeno ispitivanje toka s velikim brojem uzoraka biološkog materijala uz visok stupanj standardizacije studije, minimizirajući subjektivni element u evaluaciji rezultata, mogućnost pohranjivanja fiksnih protokola studija koji omogućuju arhiviranje podataka studije i ponovni pristup njima radi retrospektivne analize.

Značajni nedostaci ručnih metoda, uključujući određivanje antitijela na antigene T. pallidum ELISA-om, su:

~ moguće pogreške osoblja tijekom studija (previd, nemar, kršenje tehnologije);

~ nemogućnost potpune standardizacije procesa istraživanja s ručnom verzijom ELISA-e;

~ povećan rizik od infekcije osoblja.

10. Modifikacije metode

Uz klasičnu neizravnu ELISA-u, poznata je i metoda. zarobljavanje ELISA. Predložili su ga 1989. O. E. Ijsselmudien i sur. za otkrivanje antitijela klase IgM na antigene Tr. pallidum. Metoda ima visoku specifičnost i osjetljivost.

Pročišćena protutijela na humane imunoglobuline klase M se sorbiraju na površini jažica tablete, a nakon inkubacije test seruma, svi IgM se vežu na nosač. Prisutnost među povezanim IgM specifičnim za antigene Tr. pallidum se otkriva pomoću Tr antigena. pallidum konjugiran s enzimom.

Ova metoda omogućuje otkrivanje antitijela ne samo klase IgM, već i klase IgG, IgA. Da bi se to učinilo, jažice ploča se senzibiliziraju afinitetnim pročišćenim antitijelima određene klase protiv ljudskih imunoglobulina. Istodobno se iz seruma hvataju protutijela ove klase, a otkrivanje antitijela specifičnih za treponeme provodi se njihovim kombiniranjem s konjugatom, koji je kombinacija treponemskog antigena s enzimom.

Primjena zarobljene ELISA-e smanjuje rizik od lažno pozitivnih reakcija posredovanih reumatoidnim faktorom krvi, unakrsne reakcije između imunoglobulina klasa M i G. Prilikom pregleda novorođenčadi, u ovom slučaju, lažno pozitivni rezultati testa povezani s otkrivanjem IgM usmjerenih protiv majčinski antitreponemski IgG su također isključeni.

Kao ELISA varijante u inozemstvu se široko koriste enzimski imunološki test (EIA) i sustav ICE sifilis. U potonjem, smjesa antitijela na IgM i IgG, kao i tri rekombinantna proteina T. pallidum, adsorbirana je u jažice ploče. Pozitivni rezultati se testiraju u istom sustavu ispitivanja u dva ponavljanja kako bi se dobio konačni rezultat.

U Rusiji je razvijen niz testnih sustava za serodijagnostiku sifilisa ELISA-om s domaćim reagensima. Ovi sustavi imaju visoku specifičnost i osjetljivost.

Osim navedenog, postoje i druge ELISA opcije, uključujući one koje omogućuju izravno otkrivanje patogena u krvi (izravna ELISA), dot-ELISA s reakcijom na nitrocelulozne trake, ELISA s kapilarnom krvlju, kao i imunoblotiranje, ili Western Blot, uz istodobno otkrivanje protutijela na različite komponente patogena.

Moderna poboljšana modifikacija ELISA-e je imunoblotiranje.

ICA (imunokemiluminiscentna analiza), ICL (imunokemiluminiscencija)

S razvojem laboratorijske dijagnostike u kontekstu modernizacije zdravstva u Ruskoj Federaciji, automatizacija laboratorijskih istraživanja ušla je u praksu laboratorija, što omogućuje standardizaciju analitičkih faza istraživanja. Time se poboljšava kvaliteta dijagnostike. Uvođenjem automatizacije počele su se koristiti nove visokotehnološke metode visoke osjetljivosti i specifičnosti, kao što je kemiluminiscencijski imunotest (CLIA)

Kemiluminiscencija je proces emisije fotona tijekom prijelaza elektronski pobuđenih proizvoda oksidativnih kemijskih reakcija u početno energetsko stanje. Tijekom reakcije kemiluminiscencije oslobađa se značajna količina energije, a kvantni prinos emitirane svjetlosti je prilično visok. Od svih ne-izotopskih metoda, kemiluminiscencija daje najveću osjetljivost. Za imunometrijske metode, osjetljivost kemiluminiscencije je za redove veličine veća od one kod radioimunotestiranja.

Metoda imunokemiluminiscencije (ICL) danas je našla svoju primjenu u dijagnostici tumorskih biljega, autoimunih bolesti, dijabetesa, kardijalnih biljega, hormona (štitnjače, nadbubrežne žlijezde, ženski i muški spolni hormoni), torch infekcija, virusnih hepatitisa, virusa herpes grupe.

Na temelju metode imunokemiluminiscencije razvijen je niz visokoosjetljivih i specifičnih (98-100%) testnih sustava za dijagnostiku sifilisa, koji se uglavnom koriste u inozemstvu.

U metodi se kao antigeni koriste rekombinantni lipoproteini dobiveni metodama genetskog inženjeringa, koji su potpuni analozi antigena T.pallidum.

Na temelju rezultata kliničke studije, ICA metoda je prepoznata i preporučena za korištenje u laboratorijskoj dijagnostici sifilisa u Ruskoj Federaciji kao probirni i potvrdni test ako laboratoriji imaju odgovarajuću opremu. ICA je 2012. godine uključena kao probirni i potvrdni test za dijagnozu sifilisa u Kliničke smjernice za vođenje bolesnika sa spolno prenosivim infekcijama i urogenitalnim infekcijama.

Dakle, korištenje visokotehnološke ICA, koja je uvođenjem automatizacije ušla u praksu svjetske i domaće laboratorijske dijagnostike, daje sljedeće prednosti:

• isključenje utjecaja subjektivnih čimbenika u analitičkoj fazi studije
• sigurnost osoblja pri izvođenju studija potencijalno zaraženog biološkog materijala
• povećanje brzine dobivanja rezultata od strane pacijenta
• standardizacija istraživanja i kontrola kvalitete istraživanja
• isporuku pouzdanih pouzdanih rezultata pacijentima
• visokokvalitetna klinička laboratorijska istraživanja.

Po osjetljivosti ICA metoda je usporediva s metodom radioimunotestiranja, a po jednostavnosti izvođenja, sigurnosti za osoblje i mnogim drugim parametrima je nadmašuje.

ICA metoda, koja ima visoku osjetljivost i specifičnost (98-100%), omogućuje kvantificiranje razine protutijela na uzročnika sifilisa, a može se koristiti za potvrdu sifilitičke infekcije i probir. Ograničenja upotrebe: ne može se koristiti za praćenje učinkovitosti terapije, može dati lažno pozitivan rezultat.

Imunokromatografija (ICH).

Relativno nove za uporabu u Ruskoj Federaciji su metode za otkrivanje antitijela specifičnih za treponemu temeljene na metodama imunokromatografije (ICH). Kao i u ICA metodi, kao antigeni se koriste rekombinantni lipoproteini dobiveni metodama genetskog inženjeringa (na primjer, Tp15, Tp17, Tp47 antigeni) i biosintetski TmpA peptid. Navedeni antigeni se također koriste u raznim kombinacijama kao dio imunosorbenata u ELISA-i i imunoblotingu.

ICG metoda omogućuje brzo određivanje sadržaja antitijela specifičnih za treponemu na uzročnika sifilisa u uzorcima seruma i pune krvi bez upotrebe posebne laboratorijske opreme i koristi se u pružanju primarne zdravstvene zaštite, uključujući epidemiološke indikacije.

Ograničenja upotrebe: ne može se koristiti za praćenje učinkovitosti terapije, može dati lažno pozitivan rezultat.

PBT (jednostavni brzi testovi uz krevet)

Relativno nedavno, u serodijagnostici sifilisa, počeo se razvijati smjer za razvoj takozvanih jednostavnih brzih testova (PBT), odnosno testova uz bolesnikov krevet (Point-of-care - ROC). Jednostavni brzi testovi uz krevet, odnosno imunokromatografski testovi, omogućuju brzo određivanje sadržaja antitijela specifičnih za treponemu na uzročnika sifilisa u uzorcima seruma i pune krvi bez upotrebe posebne laboratorijske opreme te se koriste u primarnoj zdravstvenoj zaštiti, uključujući za epidemiološke indikacije. Ograničenja upotrebe: ne može se koristiti za praćenje učinkovitosti terapije, može dati lažno pozitivan rezultat.

Ovi se testovi temelje na imunokromatografskoj detekciji antitijela na treponemske antigene blijede treponema i izvode se na trakama; u ovom slučaju mogu se koristiti i puna krv i serum (Herring A., Ballard R. et al, 2006.). Format testova omogućuje vam provođenje istraživanja u nedostatku posebne opreme i bez upotrebe električne energije. Međutim, zbog relativno niske osjetljivosti i specifičnosti, ovi testovi još nisu našli svoju široku primjenu u praksi.

Imunoblotiranje (Western Blot)

Posljednjih godina pojavile su se metode istraživanja usmjerene na otkrivanje i analizu sadržaja antitijela. za svaki antigen blijeda treponema odvojeno. Jedna od takvih metoda je metoda imunoblotinga (ili blotinga, imunoblotinga, Western blota), koja se koristi za određivanje IgG ili IgM protutijela na blijedu treponemu. Metoda imunoblotinga je modifikacija enzimskog imunoeseja - varijante ELISA-e.

Imunobloting je jedna od najsuvremenijih metoda serodijagnostike sifilisa i aktivno se koristi u inozemstvu. Ime je dobio ("Western blotting") kao duhovit odgovor na nazive tehnika detekcije DNK ("Southern Blotting") i RNA ("Northern Blotting").

1. Povijest metode

Imunoblotiranje (Western blot) koristi se za određivanje IgG ili IgM antitijela na antigene blijede treponema (Herremans M. i sur., 2007.).

2. Klasični imunoblot

Klasični imunoblot(Western Blot analiza) kombinira enzimski imunotest i korištenje elektroforetske metode. Proteinski antigeni uzročnika sifilisa prethodno se odvajaju elektroforezom i prenose na nosač - nitroceluloznu membranu (traku). Ovaj prijenos naziva se blotting. Zatim se ovaj nosač s odvojenim točkama (blotovima) tretira test serumom i antitijelima na IgG ili IgM obilježenim enzimima ili radioaktivnim tvarima. Metoda uključuje korištenje prirodnih ili rekombinantnih proteina treponema.

elektroforeza je odvajanje nabijenih spojeva na temelju njihove mobilnosti u elektroforetskom polju. Kada se u nekom mediju primijeni razlika potencijala, pozitivno nabijene molekule kreću se prema negativno nabijenoj elektrodi, a negativno nabijene molekule prema pozitivnoj elektrodi.

Većina globularnih proteina sastavljena je na način da se većina nabijenih skupina, odnosno hidrofilnih, nalazi na površini proteina, dok su nenabijeni, hidrofobni ostaci uronjeni unutar globule. U električnom polju, u skladu sa svojim nabojem, proteini migriraju prema suprotno nabijenoj elektrodi.

Elektroforetsko odvajanje proteina provodi se u mediju sintetičkog gela na bazi poliakrilamida. Za odvajanje proteina prema njihovoj molekularnoj težini, prije elektroforeze, proteinska smjesa se predinkubira u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata (SDS).

Detaljne studije stranih znanstvenika Webera i Osborna (1969.) pokazale su da je nakon takvog tretmana jedini čimbenik koji može utjecati na mobilnost proteina u poliakrilamidnom gelu (PAAG) veličina proteina, odnosno njegova molekularna težina. To je omogućilo primjenu metode elektroforeze u SDS-PAGE u prisutnosti SDS-a za prilično precizno određivanje molekularne težine proteina i peptida. U stranoj literaturi ova metoda je nazvana SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis).

Profil reaktivnosti u klasičnom WB testu s prirodnim antigenima (metoda elektroforeze u poliakrilamidnom gelu s natrijevim dodecil sulfatom). (1) - kontrolni pozitivan rezultat, (2) - kontrolni negativan rezultat, (3-6) - klinički uzorci.

U testovima na sifilis ovom metodom, prethodno pročišćeni i uništeni do sastavnih dijelova, blijeda treponema se podvrgava elektroforezi u poliakrilamidnom ili agaroznom gelu. Istodobno, antigeni uključeni u njegov sastav odvojeni su molekularnom težinom.

Zatim se vertikalnom elektroforezom antigeni prenose na traku nitroceluloze, koja sada sadrži nevidljivi spektar antigenskih traka karakterističnih za blijedu treponemu.

Tijekom analize ispitni materijal (serum, krvna plazma pacijenta itd.) nanosi se na nitroceluloznu traku (traku). Ako u uzorku postoje specifična antitijela, tada se u procesu inkubacije snažno vežu na antigene trake koje im striktno odgovaraju (komplementarne) i tvore kompleks "antigen-antitijelo".

Nakon uklanjanja nevezanih imunoglobulina tijekom pranja trake slijedi inkubacija s konjugatom - enzimom obilježenim protutijelima na humane imunoglobuline (antitijela na humani IgG ili IgM), pri čemu se antitijela označena enzimom vežu na postojeće antigen-antitijelo. kompleksa na površini membrane.

Nakon uklanjanja nevezanog konjugata tijekom inkubacije s otopinom supstrata, enzim stupa u interakciju sa supstratom, što rezultira reakcijom u boji - bojenjem dijelova membrane (u obliku traka) gdje se nalaze pojedinačni antigeni blijede treponeme, antitijela na koji su bili u test serumu. Intenzitet bojenja ovisi o količini vezanih antitijela iz seruma. Rezultat reakcije se vizualno procjenjuje.

Prisutnost traka u određenim područjima nitrocelulozne ploče potvrđuje prisutnost u ispitivanom serumu antitijela na strogo definirane antigene blijede treponema.

Imunodeterminante 15, 5, 17, 44,5, 47 kD određene ovom metodom imaju dijagnostički značaj kod sifilisa. Ig G imunobloting je po osjetljivosti i specifičnosti sličan RIF-u s apsorpcijom (RIF abs). Ig M-imunobloting može poslužiti kao dijagnostički test za kongenitalni sifilis.

3. Imunoblot u formatu linearne imunoanalize

Linearni imunotest (linijski imunotest, LIA) omogućuje istovremeno određivanje antitijela na blijede antigene treponema u ljudskom serumu ili plazmi. Antigeni se prethodno nanose na test trake (trake), koje se isporučuju kao dio komercijalnih dijagnostičkih kompleta.

Trake su izrađene od nitrocelulozne membrane, poliamidne membrane s plastičnom podlogom ili najlonske membrane s plastičnom podlogom. Tijekom proizvodnje, nekoliko diskretnih antigena se stavlja na test traku kao zasebne antigenske linije. Osim ovih antigena sifilisa, na svaku stazu se primjenjuju još četiri kontrolne linije: streptavidin i kontrole (3+, 1+ i ± linija presjeka).

Za trakice se koriste umjetni antigeni dobiveni genetskim inženjeringom – rekombinantni proteini ili sintetski polipeptidni konstrukti. Radi se o analozima površinskih antigena blijede treponeme - TpN15, TpN17, TpN47 i TmpA s molekulskom težinom od 15, 17, 47 kDa i 44,5 (TmpA), gdje je kDa=kiloDaltona. Uz njihovu pomoć određuju se serumska protutijela na različite imunodominantne komponente patogena.

Inkubacija ispitnog uzorka odvija se u kiveti, gdje se također postavlja indikatorska traka. Protutijela na T. pallidum određuju se vezanjem na antigene otisnute na test trakama. Ako u uzorku postoje antitijela specifična za T. pallidum, ona stvaraju veze s pojedinačnim linijama antigena. Kada protutijela sadržana u test serumu stupe u interakciju s diskretnim antigenima T. pallidum postavljenim na test traku, nastaje kompleks antigen-antitijelo u obliku vizualno uočljivih traka u boji.

Uzimajući u obzir rezultate imunoblotinga, reaktivnost seruma na svaki od antigena procjenjuje se zasebno. Ukupni pozitivan odgovor se izdaje kada se rezultat dobije istovremeno s dva ili tri prikazana antigena.

Postupci istraživanja provode se ručno ili na posebnom analizatoru, uz interpretaciju rezultata pomoću specijaliziranog računalnog programa za zarazne bolesti.

Zbog visokog stupnja pročišćavanja rekombinantnih antigena i istovremenog otkrivanja antitijela na najimunogenije determinante uzročnika sifilisa, metoda ima visoku osjetljivost i specifičnost.

4. Računovodstvo rezultata

Za očitavanje intenziteta bojenja antigenskih traka na trakama razvijeni su fotometri čiji se rad temelji na refleksiji signala, što eliminira subjektivnu procjenu i pruža potencijalnu priliku za automatizaciju.

5. U kojim razdobljima bolesti je bolje koristiti

Testovi pomoću Western blot metode mogu otkriti specifična antitijela na antigene Treponema pallidum u vrlo ranoj fazi bolesti. Najznačajnija u dijagnozi sifilisa su antitijela na antigene blijede treponema TpN15, TpN17, TmpA i TpN47. Ovi antigeni su membranski proteini s molekularnom težinom od 15, 17, 44,5 i 47 kDa, redom.

Kada se treponema pallidum unese u ljudsko tijelo, antisifilitička antitijela se pojavljuju ovim redoslijedom: prvo se razvija imunološki odgovor na antigene TpN17, zatim na TpN47, nakon TpN15 i kasnije od svih TmpA. Uzimajući u obzir rezultate ispitivanja, procjenjuje se reaktivnost seruma na svaki od njih posebno. Na primjer, kada u linearnom mrlju postoji reaktivnost samo na antigensku liniju TpN17 i TpN47, to znači da je bolest u ranoj fazi. Što više antigenskih linija postaje reaktivno, infekcija dalje napreduje. U liječenju sifilisa, obrazac reaktivnosti u ovom testu se mijenja.

Određivanje IgM na proteine ​​s molekulskom težinom od 15,17, 41, 47 kDa omogućuje identifikaciju 29,2% pacijenata sa sekundarnim sifilisom, 12,5% s ranim latentnim sifilisom i 8,0% sa serorezistentnim. Potragu za IgG na iste molekule karakterizira osjetljivost od 61,6% za serorezistentni i 100% za sekundarni i rani latentni sifilis.

6. Osjetljivost i specifičnost

Prema literaturi, osjetljivost i specifičnost testa su vrlo visoke - 99,6-100% odnosno 99,3-99,5%. U klasičnoj metodi to se postiže elektroforetskim odvajanjem proteina, gliko- i lipoproteina i maksimalnom specifičnošću detekcije imunoloških seruma ili monoklonskih protutijela. U optimalnim uvjetima, imunobloting može otkriti antigen u količinama manjim od 1 ng u testnom volumenu.

Osjetljivost linearne mrlje je također 99,6%, a specifičnost između 99,3% i 99,5%.

Prema riječima stručnjaka, imunobloting s rekombinantnim visoko specifičnim antigenima sličan je osjetljivosti i specifičnosti na RIF abs.

Prema podacima iz inozemne literature i rezultatima studije na TsNIKVI, metoda imunoblotinga ima visoku osjetljivost (98,8-100%) i specifičnost (97,1-100%) u dijagnozi sifilisa.

7. Opseg metode

Imunoblotiranje (imunoblot) je vrlo specifična i vrlo osjetljiva referentna metoda. Visoka osjetljivost i specifičnost dopuštaju da se ova metoda smatra potvrdnim testom za sifilis. Metoda se može koristiti za potvrdu dijagnoze, kao i ako drugi treponemski testovi daju upitne i proturječne rezultate. Western blotting može potvrditi dijagnozu kod pacijenata s pozitivnim ili neodreñenim rezultatima testova, uključujući one dobivene korištenjem TPHA ili ELISA.

8. Izvori i uzroci inscenacijskih pogrešaka, lažno pozitivnih i lažno negativnih

Lažno pozitivni rezultati su vrlo rijetki. Lažno negativni rezultati također su prilično rijetki i opažaju se u bolesnika s imunodeficijencijama - češće kod osoba zaraženih HIV-om i s učinkom dijagnostičkog "prozora" zbog kašnjenja u sintezi antitijela, kao i grešaka u fazi stadija.

Korištenje suvremenih sustava ispitivanja diktira točno poštivanje svih zahtjeva kako za materijal tako i za izvedbu reakcije. U osnovi, izvor pogrešaka je kršenje redoslijeda i tehnologije studije (osobito za klasični Western blot), nepoštivanje preporuka proizvođača test kitova. . Pogreške se mogu napraviti i u prikupljanju, dostavi, pohranjivanju uzoraka krvnog seruma, kao i u obavljanju pretraga. Osim zaraženih uzoraka, drugi mogući uzroci uključuju korištenje testnih kompleta s isteklim rokom trajanja i pogreške u analizi rezultata ispitivanja.

9. Značajke, prednosti i nedostaci

Jedinstvenost imunoblota leži u visokom sadržaju informacija i pouzdanosti rezultata.

Test ne zahtijeva visoko pročišćene antigene, referentne i kontrolne serume. Identifikacija cilja protutijela temelji se na molekularnoj težini proteina s kojim reagiraju protutijela iz seruma pacijenta. U jednoj reakciji može se otkriti vezanje protutijela na nekoliko antigena, od kojih se svaki može točno okarakterizirati. Zbog toga imunoblotiranje ima niz prednosti u odnosu na druge metode detekcije antitijela, čiji rezultati ovise o standardizaciji, osjetljivosti, kvaliteti supstrata, nestabilnosti ili netopivosti pojedinih antigena.

Metoda je lako reproducibilna, relativno jednostavna za izvođenje i interpretaciju rezultata, omogućuje određivanje spektra protutijela na nekoliko antigena T. pallidum odjednom i procjenu doprinosa protutijela različite specifičnosti ukupnoj reakciji.

Korištenje visoko pročišćenih rekombinantnih i peptidnih antigena minimizira nespecifičnu reaktivnost seruma. Korištenjem metode moguće je izbjeći radno intenzivne i subjektivne metode koje su opasne za istraživača (transplantacija sojeva G. pallidum, rad s patogenom T. pallidum pri postavljanju reakcije). To određuje prednost metode imunoblotinga u odnosu na druge treponemske testove (RIF i posebno RIBT) za dijagnozu sifilisa.

10. Modifikacije metode

Postoji nekoliko komercijalnih testnih sustava temeljenih na ovoj metodi. Neki od njih su u formatu western blot, sastoje se od traka na koje se prenose proteinske komponente T. pallidum, prethodno razdvojene elektroforezom u poliakrilamidnom gelu.

Drugi su u formatu linearna mrlja, sastoje se od traka na kojima su adsorbirani rekombinantni i sintetski polipeptidi u obliku diskretnih linija - analoga površinskih antigena T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 i TmpA.

Western blot rezultate je teže protumačiti jer trake pokazuju širok raspon protutijela, od kojih su mnoga specifična za skupinu. Nasuprot tome, tumačenje rezultata linearnog mrlja je jednostavno; osim toga, dodatne kontrolne linije otisnute na traci omogućuju polukvantitativnu procjenu razine antitijela na četiri antigena T. pallidum.

xMAP tehnologija

xMAP je najsuvremenija tehnologija koja omogućuje provođenje multiparametarskih studija simultanim otkrivanjem više analita u jednom biološkom uzorku. Kao čvrsta faza koriste se obojene mikrosfere obložene reagensima za hvatanje (oligonukleotidi, antitijela, antigeni).

Ispitni uzorak se dodaje u otopinu koja sadrži mikrosfere. Analiti detektirani u uzorku vežu se na odgovarajuću mikrosferu, nakon čega se otopini dodaje sredstvo za detekciju (detekcija antitijela, fluorescentna oznaka). Za detekciju analita koji se treba odrediti koristi se sustav od dva lasera koji omogućuje i kvalitativnu procjenu prisutnosti analita u uzorku (za to se koristi crveni laser koji klasificira mikrosfere po boji) i kvantitativnu procjenu sadržaja analita u uzorku (za to se koristi zeleni laser).

Studija se provodi automatski na analizatorima kao što su Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) opremljenim softverom.

Izvedba xMAP tehnologije značajno nadmašuje performanse klasičnog enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) sa značajno manjom količinom biomaterijala.

xMAP tehnologija, koja ima visoku analitičku osjetljivost, trenutno se koristi za rješavanje širokog spektra kliničkih problema. Uz njegovu pomoć, u jednom uzorku biološkog materijala, provodi se simultana detekcija poznatih oncomarkera, kardijalnih biljega, markera akutne faze i dijabetes melitusa, širokog spektra citokina, kemokina i faktora rasta. Istodobna detekcija više analita u jednom biološkom uzorku može značajno smanjiti vrijeme pregleda bolesnika. Do danas je razvijen niz testnih sustava za otkrivanje protutijela na patogene spolno prenosivih bolesti, posebno na sifilitičnu infekciju, koristeći xMAP metodu.

MEDICINSKI CENTAR"Na Samotechnaya"

Prijem po dogovoru! Subota nedjelja.

Sifilis je zarazna bolest koja se može prenijeti spolnim kontaktom. Uzročnik bolesti je bakterija poput blijede treponeme (spirohete), koja zahvaća unutarnje organe, sluznicu i kožu.

Za otkrivanje bolesti koriste se krvne pretrage, au nekim slučajevima i cerebrospinalna tekućina. Rezultati su označeni plusevima ili se koriste križići u količini od 1 do 4.

Sifilis četiri križa smatra se najopasnijim stadijem za osobu. Tumačenje testova i dijagnozu određuje isključivo liječnik.

Četiri stadija bolesti i njihove karakteristike

Definicija spolno prenosive bolesti provodi se proučavanjem krvi na prisutnost treponema.

Ova metoda prepoznavanja sifilisa pomoću serološke reakcije je najčešća od mnogih pretraga.

Imunolog je stvorio poseban sustav za karakterizaciju bolesti, u kojem križići označavaju količinu antitijela. Važno je znati da oni nisu u samoj bolesti, ali postoje treponemi, čirevi i sifilički osip.

Povećanje titra antitijela ukazuje na aktivnu reprodukciju patogena, a križanja su sadržana u bilo kojoj analizi s pozitivnom procjenom prisutnosti antitijela. Razmotrite faze bolesti i njihove značajke.

Sifilis jedan križ

Ako postoje križevi, sifilis je pozitivan, ali postoje sumnje čak i kada se promatraju antitijela u krvi za borbu protiv bolesti.

Stoga liječnici takav rezultat ispitivanja nazivaju sumnjivim. Često rezultat testa može značiti drugu bolest.

Rezultat 1+ znači da je prošlo malo vremena od faze infekcije. Plus može biti prisutan nakon potpunog liječenja, kada su antitijela preživjela.

Sifilis dva križa

Dva križa znače pozitivan rezultat, što ukazuje na prisutnost treponema u krvi.

Povećanje titra ukazuje na nisku koncentraciju u krvi. Dakle, trebate ispitati bakteriju kako biste potvrdili zaključak 2 plus prije početka terapije.

Sifilis tri križa

Test krvi s ocjenom od tri križa ukazuje na pozitivan rezultat i ne može se pobiti. Ponovljena studija krvi samo potvrđuje dijagnozu 3. križa, što je tipično za bolest u II fazi razvoja.

Sifilis četiri križa

Najnepovoljniji zaključak je rezultat 4 križanja. Ali to uopće ne znači da se bolest ne može izliječiti.

Ovu fazu karakterizira primjetan osip, gubitak kose, groznica. Broj antitijela je na visokoj razini, tako da je zaključak nesumnjiv.

Kako se provodi pregled?

Prepoznavanje sifilisa provodi se u dvije faze, počevši od pregleda pacijenta, završavajući proučavanjem krvi na antitijela.

Liječnik pregledava pacijenta, dok već utvrđuje vjerojatnost prisutnosti bolesti:

• otkrivanje ulkusa na genitalijama ili u usnoj šupljini;
• dermatološki osipi, pečati;
• ćelavost u glavi.

Liječnik pojašnjava informacije od pacijenta, na temelju pitanja o prisutnosti sumnjivog spolnog odnosa ili liječenju spolno prenosive bolesti.

Pregledi u laboratoriju

Danas se studija o otkrivanju križa sifilisa 4 može uzeti na mnogo načina, a najpoznatiji su predstavljeni u nastavku:

• RPR je test kojim se u krvi utvrđuju antitijela na fosfolipide citoplazmatske membrane;
• RIF (imunofluorescencijska reakcija) je osjetljivija reakcija, jer već u prvoj fazi pokazuje pozitivan rezultat u 80% bolesnika;
• RW (metoda njemačkog imunologa Wassermanna) je brza i pouzdana metoda istraživanja koja vam omogućuje provođenje pregleda i propisivanje učinkovitih lijekova;
• enzimski imunološki test krvi;
• reakcija se temelji na fenomenu imobilizacije bakterija antitijelima kao što su imobilizini;
• pasivna hemaglutinacija pokazuje prisutnost i količinu antitijela.

Do danas se sifilis može liječiti u bilo kojoj fazi. Ali puno je lakše tolerirati liječenje kod prvih manifestacija bolesti, kada infekcija nije zahvatila cijelo tijelo.

Termin liječenja i lijekove propisuje venerolog na temelju individualnih karakteristika ljudskog tijela i stadija lezije.

Ne zaboravite da je najbolja prevencija sifilisa blizak odnos s redovitim partnerom, u čije ste zdravlje potpuno sigurni.

RPHA analiza je tehnika koja je jedna od najvažnijih među ostalim krvnim pretragama. Uz pomoć njega možete odrediti razvoj neugodnih bolesti crijevno-zarazne prirode. Ali često se analiza koristi za otkrivanje sifilisa. Studija ima visoku točnost i pouzdanost.

RPHA označava reakciju pasivne hemaglutinacije.

RPHA se temelji na fenomenu aglutinacije eritrocita, u kojem se antigeni - RPHA reagensi - adsorbiraju na površini kada im se doda krvni serum bolesnika sa sifilisom.

Nakon što se serum osobe zaražene sifilisom spoji s RPHA reagensom, dolazi do aglutinacije (pričvršćivanja ili lijepljenja) eritrocita i oni se talože. Stupanj adhezije izravno ovisi o nakupljanju i gustoći antitijela u krvnom serumu, iz tog razloga RPGA pomaže ne samo u otkrivanju prisutnosti antitijela, već iu identifikaciji njihovog broja.

Rezultat je podijeljen na primarnu i sekundarnu infekciju, izraženu u manifestaciji različitih antitijela. U primarnom se aktivira IgM, u sekundarnom IgG. Točnost studije do druge faze postaje još konkretnija. Ako je u prvoj fazi oko 96%, onda u drugoj može doseći i do 99%.

Analiza je dobra kao neovisna studija, ali ju je bolje koristiti kao potvrdnu metodu nakon pozitivne nespecifične studije.

Zbog svoje visoke točnosti ova se analiza sve više koristi za potvrđivanje ili opovrgavanje nastanka lezije sifilisa kod bolesnika.

Također, radi veće pouzdanosti, nakon RPHA, može se provesti još jedan potvrdni test, na primjer, "treponemski" enzimski imunotest.

Općenito, dijagnostika se uvijek provodi na složen način, ne koristeći samo jednu vrstu pregleda, već kombinirajući različite komplementarne metode.

Postavite svoje pitanje doktoru kliničke laboratorijske dijagnostike

Anna Poniaeva. Završila je Medicinsku akademiju u Nižnjem Novgorodu (2007.-2014.) i specijalizaciju iz kliničke i laboratorijske dijagnostike (2014.-2016.).

Mali minus ili, bolje rečeno, značajka analize je njezina osjetljivost čak i nakon izlječenja bolesti. Rezultat ostaje pozitivan tijekom cijelog života osobe koja je imala sifilis. Iz tog razloga, RPHA se ne koristi za dijagnosticiranje rane ili kasne bolesti. Također je nemoguće koristiti ovu analizu za određivanje učinkovitosti liječenja.

Uz svaki pozitivan rezultat, postoji sumnja na infekciju. Ali ponekad se može pojaviti lažno pozitivna reakcija. Istina, njegova kvantitativna prisutnost obično ne prelazi 3% i uzrokovana je nizom neinfektivnih razloga.