Bērnu veselība. Viss par narkotikām Kas ir cilvēka alfa 2b interferons

21.04.2020

Klīniskajos pētījumos, kas veikti ar plašu indikāciju klāstu un ar plašu devu diapazonu (no 6 miljoniem SV / m2 nedēļā matainu šūnu leikēmijas gadījumā; līdz 100 miljoniem SV / m2 nedēļā melanomas gadījumā), visbiežāk novērotās blakusparādības bija drudzis, nogurums, galvassāpes, mialģija. Drudzis un nogurums mazinājās 72 stundu laikā pēc zāļu lietošanas pārtraukšanas. Kaut arī drudzis var būt viens no gripai līdzīga sindroma simptomiem, ko bieži novēro, ārstējot ar interferonu, jāveic pārbaudes, lai izslēgtu citus. iespējamie iemesli pastāvīgs drudzis.
Turpmāk norādīto drošības profilu ieguva no 4 klīniskie pētījumi pacientiem ar hronisku C hepatītu, kuri Intronu A saņēma 1 gadu monoterapijā vai kombinācijā ar ribavirīnu. Visi pacienti 3 reizes nedēļā saņēma 3 miljonus SV Intron A.
2. tabulā parādīti nevēlami notikumi, kuru biežums bija lielāks vai vienāds ar 10% pacientiem, kuri iepriekš nebija ārstēti un vienu gadu saņēma Intron A (vai Intron A kombinācijā ar ribavirīnu). Kopumā ziņotās blakusparādības bija vieglas vai vidēji smagas.
2. tabula.

Blakusparādības	A introns (n \u200b\u200b\u003d 806)	Introns A + ribavirīns (n \u200b\u200b\u003d 1010)
Vietējās reakcijas
Iekaisuma reakcijas injekcijas vietā	9–16%	6–17%
Citas reakcijas injekcijas vietā	5–8%	3–36%
Vispārīgas reakcijas
Galvassāpes	51–64%	48–64%
Nogurums	42–79%	43–68%
Drebuļi	15–39%	19–41%
Drudzis	29–39%	29–41%
Gripai līdzīgs sindroms	19–37%	18–29%
Astēnija	9–30%	9–30%
Svara zudums	6–11%	9–19%
Kuņģa-zarnu trakta reakcijas
Slikta dūša	18–31%	25–44%
Anoreksija	14–19%	19–26%
Caureja	12–22%	13–18%
Vēdersāpes	9–17%	9–14%
Vemšana	3–10%	6–10%
Skeleta-muskuļu sistēmas reakcijas
Mialģija	41–61%	30–62%
Artralģija	25–31%	21–29%
Kaulu un muskuļu sāpes	15–20%	11–20%
CNS reakcijas
Depresija	16–36%	25–34%
Uzbudināmība	13–27%	18–34%
Bezmiegs	21–28%	33–41%
Trauksme	8–12%	8–16%
Koncentrēšanās spējas pasliktināšanās	8–14%	9–21%
Emocionālā labilitāte	8–14%	5–11%
Ādas reakcijas
Alopēcija	22–31%	26–32%
Nieze	6–9%	18–37%
Sausa āda	5–8%	5–7%
Izsitumi	10–21%	15–24%
Elpošanas reakcijas
Faringīts	3–7%	7–13%
Klepus	3–7%	8–11%
Aizdusa	2–9%	10–22%
Citi
Reibonis	8–18%	10–22%
Vīrusu infekcija	0–7%	3–10%

Nevēlamās blakusparādības, kas novērotas pacientiem ar vīrusu hepatītu C, atbilst tām, kas novērotas, lietojot Intron A citām indikācijām ar nedaudz no devas atkarīgu attīstības biežuma palielināšanos.
Lietojot Intron A citām indikācijām (klīniskos un neklīniskos pētījumos), reti (| 1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
No ķermeņa kopumā.Ļoti reti - sejas tūska.
Ir ziņots par astēniskiem apstākļiem (astēnija, savārgums un nogurums), dehidratāciju, sirdsklauves, psoriāzi, sēnīšu infekciju un bakteriālu infekciju (ieskaitot sepsi).
No imūnsistēmas.Ļoti reti sarkoidoze vai tās pasliktināšanās.
Lietojot alfa interferonus, ziņots par dažādu autoimūnu un imūno mediētu traucējumu, tostarp idiopātiskas vai trombotiskas trombocitopēniskas purpuras, attīstību. reimatoīdais artrīts, sistēmiskā sarkanā vilkēde, vaskulīts un Vogt-Koyanagi-Harada sindroms.
Ir ziņots par akūtu paaugstinātas jutības reakciju gadījumiem, ieskaitot nātreni, angioneirotisko tūsku alerģiska tūska un anafilakse.
No sāniem sirds un asinsvadu sistēmas: reti - aritmija (parasti novērota pacientiem ar iepriekšējām sirds un asinsvadu sistēmas slimībām vai ar iepriekšēju kardiotoksisku terapiju), pārejoša atgriezeniska kardiomiopātija (atzīmēta pacientiem bez apgrūtinātas sirds un asinsvadu sistēmas vēstures); ļoti reti - arteriāla hipotensija, miokarda išēmija un miokarda infarkts.
No centrālās nervu sistēmas un perifērās nervu sistēmas.Reti - tieksme uz pašnāvību; ļoti reti - agresīva uzvedība, tostarp vērsta pret citiem cilvēkiem, pašnāvības mēģinājumi, pašnāvība, psihoze (ieskaitot halucinācijas), apziņas traucējumi, neiropātija, polineuropātija, encefalopātija, smadzeņu asinsvadu išēmija, smadzeņu asinsvadu asiņošana, perifēra neiropātija, krampji.
No dzirdes orgāna.Ļoti reti - dzirdes traucējumi.
No endokrīnās sistēmas.Reti - diabēts, esošā cukura diabēta kursa pasliktināšanās.
No kuņģa-zarnu trakta.Ļoti reti - pankreatīts, palielināta ēstgriba, smaganu asiņošana, kolīts.
No aknām un žults ceļu.Ļoti reti - hepatotoksicitāte (ieskaitot nāvi).
Izmaiņas zobos un periodontijā. Pacientiem, kuri saņem kombinētu terapiju ar Nitron A un ribavirīnu, tika novērotas patoloģiskas izmaiņas zobos un periodontijā. Sausa mute ar ilgstošu kombinētu terapiju ar ribavirīnu un Intronu A var sabojāt zobus un mutes gļotādu. Pacientiem zobus jātīra 2 reizes dienā un regulāri jāveic zobu pārbaudes. Turklāt dažiem pacientiem var rasties vemšana.
No vielmaiņas puses.Reti - hiperglikēmija, hipertrigliceridēmija.
No balsta un kustību aparāta.Reti - rabdomiolīze (dažreiz smaga), krampji kājās, muguras sāpes, miozīts.
No ādas.Ļoti reti - multiformā eritēma, Stīvensa-Džonsona sindroms, toksiska epidermas nekrolīze, nekroze injekcijas vietā.
No elpošanas sistēmas.Reti pneimonija; ļoti reti - plaušu infiltrāti, pneimonīts.
No urīnceļu sistēmas.Ļoti reti - nefrotiskais sindroms, nieru disfunkcija, nieru mazspēja.
No asinsrades sistēmas.Ļoti reti, lietojot Intron A atsevišķi vai kombinācijā ar ribavirīnu, tika konstatēta aplastiska anēmija un pilnīga sarkano kaulu smadzeņu aplazija.
No redzes orgāna puses.Reti - asiņošana tīklenē, fokālās izmaiņas dibenā, tīklenes artēriju un vēnu tromboze, redzes asuma samazināšanās, redzes lauku samazināšanās, redzes neirīts, redzes nerva galvas tūska.
Klīniski būtiskas izmaiņas laboratorijas parametri.(biežāk novēro, izrakstot zāles devās, kas pārsniedz 10 miljonus SV / dienā) - granulocītu un leikocītu skaita samazināšanās, hemoglobīna un trombocītu skaita samazināšanās, sārmainās fosfatāzes, LDH aktivitātes palielināšanās, kreatinīna un urīnvielas slāpekļa koncentrācija serumā. ALT un ACT aktivitātes palielināšanās asins plazmā tiek atzīmēta kā patoloģiska, ja to lieto visām indikācijām, izņemot hepatītu, kā arī dažiem pacientiem ar hronisku B hepatītu, ja nav HBV DNS.
Ja Intron A lietošanas laikā kādai indikācijai rodas nevēlamas blakusparādības, jums jāsamazina deva vai uz laiku jāpārtrauc ārstēšana, līdz nevēlamās blakusparādības tiek novērstas. Ja, lietojot atbilstošu devu režīmu, vai slimība progresē, rodas pastāvīga vai atkārtota nepanesamība, Intron A terapija ir jāatceļ.

Klīniskā farmakoloģija
Farmakoloģiskā darbība - pretvīrusu, pretaudzēju un imūnmodulējoša.

Tas ir ļoti attīrīts rekombinantais proteīns ar molekulmasu 19 300 daltoni. Iegūts no E. coli klona, \u200b\u200bhibridizējot baktēriju plazmīdu ar cilvēka leikocītu gēnu, kas kodē interferona sintēzi. Atšķirībā no interferona, alfa-2a 23. pozīcijā ir arginīns. Tam ir pretvīrusu iedarbība, kas ir saistīta ar mijiedarbību ar specifiskiem membrānas receptoriem un RNS sintēzes un galu galā olbaltumvielu indukciju. Savukārt pēdējie traucē normālu vīrusa reprodukciju vai tā izdalīšanos. Tam ir imūnmodulējoša aktivitāte, kas saistīta ar fagocitozes aktivizēšanu, antivielu un limfokīnu veidošanās stimulēšanu. Piemīt antiproliferatīva iedarbība uz audzēja šūnām.
- Farmakokinētika
  Ar i / m ievadīšanu 70% nonāk sistēmiskā cirkulācijā. Tas biotransformējas galvenokārt nierēs un nelielā mērā aknās. Alfa-2b interferonu izdalās caur nierēm.

Lietošanas indikācijas
- Hronisks B hepatīts
- Hronisks C hepatīts
- Sēņu mikoze.
- Primārā T-šūnu limfosarkoma.
- Matainu šūnu leikēmija.
- Multiplā mieloma (vispārinātas formas).
- Hroniska mieloīdā leikēmija.
- Ļaundabīga melanoma.
- Pūšļa vēzis (atrodas virspusēji).
- Bazālo šūnu karcinoma.
- Norādīta kondilomatoze.
- Kapoši sarkoma (ieskaitot AIDS).
- Ne-Hodžkina limfomas (kā daļa no kombinētās terapijas).

Lietošanas metode un devas
Individuāli, atkarībā no indikācijām un ārstēšanas režīma.
- Ar matainu šūnu leikēmiju
  Pieaugušie intramuskulāri vai subkutāni ievada 2 miljonus SV / m 2 3 reizes nedēļā.
- Ar Kapoši sarkomu
  30 miljoni SV / m 2 3 reizes nedēļā.

Kontrindikācijas
- Smagas sirds un asinsvadu slimības.
- Smaga aknu un / vai nieru disfunkcija.
- Epilepsija un / vai nopietni centrālās nervu sistēmas funkcionālie traucējumi.
- Hronisks hepatīts ar aknu cirozes draudiem.
- Aknu slimība dekompensācijas fāzē.
- Hronisks hepatīts ar vai pēc iepriekšējas terapijas ar imūnsupresantiem (izņemot stāvokli pēc īslaicīgas kortikosteroīdu terapijas atcelšanas)
- Autoimūns hepatīts.
- Autoimūno slimību vēsture.
- Imūnsupresīvi transplantāta recipienti.
- Iepriekšējās vairogdziedzera slimības.
- Paaugstināta jutība pret alfa-2b interferonu.

Lietošana grūtniecības un zīdīšanas laikā
Lietošana grūtniecības laikā ir iespējama gadījumos, kad paredzamais ieguvums mātei atsver iespējamo risku auglim. Sievietēm reproduktīvā vecumā, lietojot alfa-2b interferonu, jālieto drošas kontracepcijas metodes.

Ja nepieciešams, lietošanu laktācijas laikā vajadzētu izlemt par pārtraukšanu zīdīšana.

Mijiedarbība
Interferoni var pastiprināt to zāļu neirotoksisko, mielotoksisko vai kardiotoksisko iedarbību, kuras tika izrakstītas agrāk vai vienlaikus ar tām.

Īpaši nosacījumi
Nevajadzētu lietot pacientiem ar psihiski traucējumi anamnēzē. Lietojiet piesardzīgi pacientiem ar plaušu slimību (ieskaitot hronisku obstruktīvu plaušu slimību) anamnēzē, cukura diabētu ar tendenci uz ketoacidozi, paaugstinātu asins recēšanu (ieskaitot anamnēzē tromboflebītu un plaušu emboliju), smagas mielodepresijas stāvokļi.

Pirms ārstēšanas uzsākšanas un sistemātiski ārstēšanas laikā jāveic aknu funkcijas, perifēro asiņu modeļu, asins bioķīmisko parametru, kreatinīna kontrole. Ārstēšanas laikā jāveic pietiekama ķermeņa mitrināšana. Pacientiem ar hronisku C hepatītu ārstēšanas laikā jāuzrauga vairogdziedzeri stimulējošā hormona līmenis.

Hroniska B hepatīta gadījumā, ko papildina sintētiskas aknu funkcijas samazināšanās (kas izpaužas kā albumīna līmeņa pazemināšanās vai protrombīna laika palielināšanās), jānovērtē paredzamais ieguvums un iespējamais risks terapija. Lietošana vienlaikus ar psoriāzi ir pamatota gadījumos, kad paredzamais terapijas ieguvums atsver iespējamo risku. Ar vienlaicīgu cukura diabētu vai arteriālu hipertensiju pirms ārstēšanas un tās laikā ir nepieciešama fundūza pārbaude. Ja anamnēzē ir hroniska sirds mazspēja, miokarda infarkts un / vai iepriekšējas vai esošas aritmijas, ārstēšana ar alfa-2b interferonu jāveic stingrā ārsta uzraudzībā.
- Ietekme uz spēju vadīt transportlīdzekļus un izmantot mehānismus
  Ietekme uz spēju vadīt transportlīdzekļus un vadības mehānismus Terapijas sākumā jums vajadzētu atturēties no potenciālā bīstamas sugas darbības, kurām nepieciešama pastiprināta uzmanība, ātras psihomotorās reakcijas līdz alfa-2b-interferona darbības stabilizācijas periodam.
Alfa-2b-interferons injekciju pulvera un injekciju šķīduma veidā ir iekļauts VED sarakstā.

Izdalīšanas forma, sastāvs un iepakojums

Injekcija caurspīdīgs, bezkrāsains.

Palīgvielas:

0,5 ml - ampulas (5) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
0,5 ml - ampulas (5) - kontūrveida šūnu iepakojumi (2) - kartona iepakojumi.
0,5 ml - pudeles (1) - kartona iepakojumi.
0,5 ml - pudeles (5) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
0,5 ml - stikla šļirces (1) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
0,5 ml - stikla šļirces (1) - kontūrveida šūnu iepakojumi (3) - kartona iepakojumi.
0,5 ml - stikla šļirces (3) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
0,5 ml - stikla šļirces (3) - kontūrveida šūnu iepakojumi (3) - kartona iepakojumi.

Injekcija caurspīdīgs, bezkrāsains.

Palīgvielas: nātrija acetāts, nātrija hlorīds, etilēndiamīna tetraetiķskābes dinātrija sāls, tween-80, dekstrāns 40, ūdens d / i.

1 ml - ampulas (5) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
1 ml - ampulas (5) - kontūrveida šūnu iepakojumi (2) - kartona iepakojumi.
1 ml - pudeles (1) - kartona iepakojumi.
1 ml - pudeles (5) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
1 ml - stikla šļirces (1) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
1 ml - stikla šļirces (1) - kontūrveida šūnu iepakojumi (3) - kartona iepakojumi.
1 ml - stikla šļirces (3) - kontūrveida šūnu iepakojumi (1) - kartona iepakojumi.
1 ml - stikla šļirces (3) - kontūrveida šūnu iepakojumi (3) - kartona iepakojumi.

Klīniskā un farmakoloģiskā grupa

Interferons. Pretaudzēju, pretvīrusu un imūnmodulējošas zāles

farmakoloģiskā iedarbība

Interferons. Altevir ® piemīt pretvīrusu, imūnmodulējoša, antiproliferatīva un pretaudzēju iedarbība.

Alfa-2b interferons, mijiedarbojoties ar specifiskiem receptoriem uz šūnas virsmas, sāk sarežģītu izmaiņu ķēdi šūnā, ieskaitot vairāku specifisku citokīnu un enzīmu sintēzes indukciju, izjauc vīrusa RNS un vīrusa proteīnu sintēzi šūnā. Šo izmaiņu rezultāts ir nespecifiska pretvīrusu un antiproliferatīvā aktivitāte, kas saistīta ar vīrusa replikācijas novēršanu šūnā, šūnu proliferācijas kavēšanu un interferona imūnmodulējošu iedarbību. Alfa-2b interferons stimulē antigēna parādīšanās procesu imūnkompetentām šūnām, spēj stimulēt makrofāgu fagocitāro aktivitāti, kā arī T šūnu un "dabisko slepkavu šūnu" citotoksisko aktivitāti, kas iesaistītas pretvīrusu imunitātē.

Novērš šūnu, īpaši audzēja šūnu, vairošanos. Tam ir nomācoša ietekme uz dažu onkogēnu sintēzi, kas izraisa audzēja augšanas kavēšanu.

Farmakokinētika

Iesūkšana

Lietojot alfa-2b interferonu s / c vai i / m, tā biopieejamība svārstās no 80% līdz 100%. Pēc alfa-2b interferona ieviešanas T max asins plazmā ir 4-12 stundas, T 1/2 - 2-6 stundas.16-24 stundas pēc ievadīšanas rekombinantais interferons netiek konstatēts asins serumā.

Vielmaiņa

Metabolisms tiek veikts aknās.

Alfa interferoni spēj izjaukt oksidatīvos vielmaiņas procesus, samazinot citohroma P450 sistēmas aknu mikrosomu enzīmu aktivitāti.

Izstāšanās

To izdalās galvenokārt caur nierēm glomerulārās filtrācijas ceļā.

Norādes par zāļu lietošanu

Kompleksās terapijas ietvaros pieaugušajiem:

- ar hronisku vīrusu hepatītu B bez aknu cirozes pazīmēm;

- ar hronisku vīrusu hepatītu C, ja nav simptomu aknu mazspēja (monoterapija vai kombinēta terapija ar ribavirīnu);

- ar balsenes papilomatozi;

- ar dzimumorgānu kondilomām;

- ar matainu šūnu leikēmiju, hronisku mieloīdo leikēmiju, ne-Hodžkina limfomu, melanomu, multiplo mielomu, Kapoši sarkomu uz AIDS fona, progresējošu nieru vēzi.

Devas režīms

Lietojiet s / c, i / m un i / v. Ārstēšana jāsāk ārstam. Pēc tam ar ārsta atļauju pacients var pats injicēt uzturošo devu (gadījumos, kad zāles tiek nozīmētas s / c vai i / m).

Hronisks B hepatīts: Altevir ® ievada subkutāni vai intramuskulāri 5-10 miljonu SV devā 3 reizes nedēļā 16-24 nedēļas. Ārstēšana tiek pārtraukta pēc 3-4 mēnešu lietošanas, ja nav pozitīvas dinamikas (saskaņā ar B hepatīta vīrusa DNS pētījumu).

Hronisks C hepatīts: Altevir ® ievada subkutāni vai intramuskulāri 3 miljonu ME devā 3 reizes nedēļā 24-48 nedēļas. Pacientiem ar atkārtotu slimības gaitu un pacientiem, kuri iepriekš nav saņēmuši ārstēšanu ar alfa-2b-interferonu, ārstēšanas efektivitāte tiek palielināta, ja tiek kombinēta terapija ar ribavirīnu. Kombinētās terapijas ilgums ir vismaz 24 nedēļas. Terapija Altevir jāveic 48 nedēļas pacientiem ar hronisku C hepatītu un vīrusa 1. genotipu ar lielu vīrusu slodzi, kuriem līdz pirmo 24 ārstēšanas nedēļu beigām C hepatīta vīrusa RNS asins serumā nav konstatēta.

Balsenes papilomatoze: Altevir ® ievada subkutāni 3 miljonu SV / m 2 devā 3 reizes nedēļā. Ārstēšana sākas pēc audzēja audu ķirurģiskas (vai lāzera) noņemšanas. Devu izvēlas, ņemot vērā zāļu panesamību. Lai sasniegtu pozitīvu atbildi, var būt nepieciešama ārstēšana 6 mēnešu laikā.

Matainu šūnu leikēmija: Ieteicamā Altevir deva subkutānai ievadīšanai pacientiem pēc splenektomijas vai bez tās ir 2 miljoni SV / m 3 3 reizes nedēļā. Vairumā gadījumu viena vai vairāku hematoloģisko parametru normalizēšanās notiek pēc 1-2 ārstēšanas mēnešiem, ir iespējams palielināt ārstēšanas ilgumu līdz 6 mēnešiem. Šis devu režīms ir pastāvīgi jāievēro, ja vien nav straujas slimības progresēšanas vai smagas zāļu nepanesības simptomu rašanās.

Hroniska mieloīdā leikēmija: ieteicamā Altevir deva monoterapijā ir 4-5 miljoni SV / m 2 dienā s / c dienā. Lai uzturētu leikocītu skaitu, var būt nepieciešama deva 0,5-10 miljoni SV / m 2. Ja ārstēšana ļauj kontrolēt leikocītu skaitu, tad, lai saglabātu hematoloģisko remisiju, zāles jālieto maksimāli pieļaujamajā devā (4-10 miljoni SV / m 2 dienā). Zāles jāpārtrauc pēc 8-12 nedēļām, ja terapija neizraisīja daļēju hematoloģisku remisiju vai klīniski nozīmīgu leikocītu skaita samazināšanos.

Ne-Hodžkina limfoma: Altevir ® lieto kā palīgterapiju kombinācijā ar standarta ķīmijterapijas shēmām. Zāles tiek ievadītas subkutāni ar devu 5 miljoni SV / m 2 3 reizes nedēļā 2-3 mēnešus. Deva jāpielāgo atkarībā no zāļu panesamības.

Melanoma: Altevir ® tiek izmantots kā palīgterapija pacientiem ar augstu atkārtošanās risku pieaugušajiem pēc audzēja noņemšanas. Altevir ® tiek ievadīts intravenozi devā 15 miljoni SV / m 2 5 reizes nedēļā 4 nedēļas, pēc tam subkutāni 10 miljonu SV / m2 devā 3 reizes nedēļā 48 nedēļas. Deva jāpielāgo atkarībā no zāļu panesamības.

Multiplā mieloma: Altevir ® tiek nozīmēts stabilas remisijas sasniegšanas periodā ar devu 3 miljoni SV / m 2 3 reizes nedēļā n / c.

Kapoši sarkoma ar AIDS: optimālā deva nav noteikta. Zāles var lietot devās 10-12 miljoni SV / m2 / dienā s / c vai i / m. Slimības stabilizācijas vai atbildes reakcijas gadījumā terapija tiek turpināta, līdz notiek audzēja regresija vai nepieciešama zāļu atcelšana.

Nieru vēzis:optimālā deva un režīms nav noteikts. Zāles ieteicams lietot subkutāni devās no 3 līdz 10 miljoniem SV / m 2 3 reizes nedēļā.

Šķīduma pagatavošana intravenozai ievadīšanai

Nepieciešamās devas pagatavošanai nepieciešamo Altevir šķīduma tilpumu savāc, pievieno 100 ml sterila 0,9% nātrija hlorīda šķīduma un injicē 20 minūšu laikā.

Blakusefekts

Vispārīgas reakcijas: ļoti bieži - drudzis, vājums (ir atkarīgas no devas un atgriezeniskas reakcijas, izzūd 72 stundu laikā pēc ārstēšanas pārtraukuma vai tā pārtraukšanas), drebuļi; retāk slikta pašsajūta.

No centrālās nervu sistēmas puses: ļoti bieži - galvassāpes; retāk - astēnija, miegainība, reibonis, aizkaitināmība, bezmiegs, depresija, domas par pašnāvību un mēģinājumi; reti - nervozitāte, trauksme.

No balsta un kustību aparāta: ļoti bieži - mialģija; retāk - artralģija.

No gremošanas sistēmas:ļoti bieži - samazināta ēstgriba, slikta dūša; retāk - vemšana, caureja, sausa mute, garšas izmaiņas; reti - sāpes vēderā, dispepsija; iespējams atgriezeniska aknu enzīmu aktivitātes palielināšanās.

No sirds un asinsvadu sistēmas puses: bieži - asinsspiediena pazemināšanās; reti - tahikardija.

Dermatoloģiskas reakcijas: retāk - alopēcija, pastiprināta svīšana; reti - izsitumi uz ādas, nieze.

No asinsrades sistēmas: iespējama atgriezeniska leikopēnija, granulocitopēnija, pazemināts hemoglobīna līmenis, trombocitopēnija.

Citi: reti - svara zudums, autoimūns tireoidīts.

Kontrindikācijas zāļu lietošanai

- smagas sirds un asinsvadu slimības anamnēzē (nekontrolēta hroniska sirds mazspēja, nesens miokarda infarkts, smagas sirds aritmijas);

- smaga nieru un / vai aknu mazspēja (ieskaitot tos, ko izraisa metastāžu klātbūtne);

- epilepsija, kā arī smagas centrālās nervu sistēmas disfunkcijas, īpaši izteiktas ar depresiju, domām par pašnāvību un mēģinājumiem (arī vēsturē);

- hronisks hepatīts ar dekompensētu aknu cirozi un pacientiem, kuri saņem vai nesen saņem ārstēšanu ar imūnsupresantiem (izņemot pabeigtu īslaicīgu GCS ārstēšanas kursu);

- autoimūns hepatīts vai citādi autoimūna slimība;

- ārstēšana ar imūnsupresantiem pēc transplantācijas;

- vairogdziedzera slimība, kuru nevar kontrolēt ar parastām terapeitiskām metodēm;

- dekompensētas plaušu slimības (ieskaitot HOPS);

- dekompensēts cukura diabēts;

- hiperkoagulācija (ieskaitot tromboflebītu, plaušu emboliju);

- smaga mielodepresija;

- grūtniecība;

- laktācijas periods (zīdīšana);

- paaugstināta jutība pret zāļu sastāvdaļām.

Zāles lietošana grūtniecības un zīdīšanas laikā

Zāles ir kontrindicētas grūtniecības un zīdīšanas laikā (zīdīšanas laikā).

Pieteikums par aknu funkcijas pārkāpumiem

Pieteikums nieru darbības traucējumiem

Zāles ir kontrindicētas smagas nieru un / vai aknu mazspējas gadījumā (ieskaitot tās, ko izraisa metastāžu klātbūtne).

Speciālas instrukcijas

Pirms ārstēšanas ar Altevir hroniska vīrusu hepatīta B un C gadījumā ieteicams veikt aknu biopsiju, lai novērtētu aknu bojājuma pakāpi (aktīva iekaisuma procesa un / vai fibrozes pazīmes). Hroniska C hepatīta ārstēšanas efektivitāte palielinās, kombinējot Altevir un ribavirīnu. Altevir lietošana nav efektīva dekompensētas aknu cirozes vai aknu komas attīstībā.

Ja ārstēšanas laikā ar Altevir rodas blakusparādības, zāļu deva jāsamazina par 50% vai zāles jāpārtrauc uz laiku, līdz tās izzūd. Ja blakus efekti saglabājas vai atkal parādās pēc devas samazināšanas vai tiek novērota slimības progresēšana, tad ārstēšana ar Altevir jāpārtrauc.

Ja trombocītu skaits samazinās zem 50x10 9 / l vai granulocītu skaits ir mazāks par 0,75x10 9 / l, ieteicams pēc 1 nedēļas samazināt asinsspiedienu Altevir devu ar asins analīzes kontroli. Ja šīs izmaiņas saglabājas, zāles jāatceļ.

Ja trombocītu skaits samazinās zem 25x10 9 / l vai granulocītu skaits ir mazāks par 0,5x10 9 / l, ieteicams pārtraukt zāļu Altevir lietošanu ar asins analīzes kontroli pēc 1 nedēļas.

Pacientiem, kuri saņem alfa-2b interferona preparātus, asins serumā var noteikt antivielas, kas neitralizē tā pretvīrusu aktivitāti. Gandrīz visos gadījumos antivielu titri ir zemi, to izskats neizraisa ārstēšanas efektivitātes samazināšanos vai citu autoimūnu traucējumu rašanos.

Pārdozēšana

Dati par Altevir ® pārdozēšanu nav sniegti.

Zāļu mijiedarbība

Zāļu mijiedarbība starp Altevir un citām zālēm nav pilnībā izpētīta. Altevir jālieto piesardzīgi vienlaikus ar miega zālēm un nomierinoši līdzekļi, narkotiskie pretsāpju līdzekļi un zāles, kurām, iespējams, ir mielodepresants.

Ar vienlaicīgu Altevir un teofilīna iecelšanu ir jāuzrauga tā koncentrācija asins serumā un, ja nepieciešams, jāmaina devu režīms.

Lietojot Altevir kombinācijā ar ķīmijterapeitiskām zālēm (citarabīnu, ciklofosfamīdu, doksorubicīnu, tenipozīdu), palielinās toksiskās iedarbības risks.

Aptieku izsniegšanas noteikumi

Zāles ir pieejamas pēc receptes.

Uzglabāšanas apstākļi un periodi

Zāles jāuzglabā bērniem nepieejamā vietā saskaņā ar SP 3.3.2-1248-03 temperatūrā no 2 ° līdz 8 ° C; nesasalst. Derīguma termiņš ir 18 mēneši.

Pārvadāšana temperatūrā no 2 ° līdz 8 ° С; nesasalst.

Izgudrojums attiecas uz gēnu inženieriju, biotehnoloģiju, medicīnu, farmakoloģiju. Jauna rekombinantā daudzkopiju plazmīda DNS pSX50, kas kodē cilvēka leikocītu alfa-2b interferona sintēzi, kuras ekspresiju kontrolē laktozes un triptofāna promotori un transkripcijas terminators. Saņēmēja E. coli BL21 celma šūnu transformācijas rezultātā ar rekombinanto plazmīdu DNS pSX50 tika iegūts E. coli SX50 celms - rekombinantā cilvēka leikocītu alfa-2b interferona ražotājs ar produktivitāti līdz 0,9-1,0 g alfa-2b interferona no 1 litra barotnes. Rekombinantā alfa-2b interferona iegūšanas metode ir balstīta uz izveidotā rekombinantā E. coli SX50 celma izmantošanu un nodrošina tā dziļu kultivēšanu barības vidē ar samazinātu triptofāna saturu, nepārtraukti pievienojot barības vielu substrātus biosintēzes laikā, mikroorganismu šūnu mehāniskai iznīcināšanai augstā spiedienā, agregētā proteīna izšķīdināšanai koncentrēts guanidīna hidrohlorīda šķīdums, kam seko interferona renaturācija fizioloģiskos buferšķīdumos haotropisku vielu klātbūtnē un tā attīrīšana, izmantojot trīspakāpju interferona attīrīšanu uz sveķiem, piemēram, ar Cu +2 joniem imobilizētu helātu Sepharose Fast Flow, jonu apmaiņas hromatogrāfiju uz jonu apmaiņas sveķiem, piemēram, CM Flow un Seph gel. filtrēšanas hromatogrāfija uz Superdex 75 tipa sveķiem. Metode ļauj iegūt interferona vielu ar tīrības pakāpi, kas pārsniedz 99%, pēc elektroforēzes datiem reducējošos un nesamazinošos apstākļos krāsojot želejas ar sudrabu un vairāk nekā 98% saskaņā ar RF HPLC un bez pirogēniem (LAL tests) vismaz 400-800 mg daudzumos no 1 litra kultūras barotnes. 3 n. un 3 cp f-kristāli, 6 ill.

RF patenta 2242516 rasējumi

Izgudrojums attiecas uz gēnu inženieriju zāles, kas iegūts biotehnoloģiski, proti, cilvēku rekombinantā leikocītu alfa-2b interferona (turpmāk - interferons) rūpnieciskas ražošanas metodēm, kā arī rekombinantiem celmiem, kas ražo Escherichia coli (E. coli), un plazmīdu DNS, kas kodē interferona sintēzi.

Interferoni ir olbaltumvielu molekulas ar molekulmasu no 15 000 līdz 21 000 daltonu, ko ražo un izdala šūnas, reaģējot uz vīrusu infekciju vai citiem patogēniem. Ir trīs galvenās interferonu grupas: alfa, beta un gamma. Šīs grupas pašas par sevi nav viendabīgas un tajās var būt vairākas dažādas interferona molekulārās sugas. Tādējādi ir identificētas vairāk nekā 14 alfa interferona ģenētiskās šķirnes, kas interesē un plaši izmanto medicīnā kā pretvīrusu, antiproliferatīvus un imūnmodulējošus līdzekļus.

Zināmas metodes cilvēka leikocītu interferona ražošanai no leikocītiem ziedoja asinis cilvēka izraisīti vīrusi un citi induktori (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Šo interferonu ražošanas metožu galvenais trūkums ir gala produkta inficēšanās ar cilvēka vīrusiem, piemēram, B un C hepatīta, imūndeficīta vīrusa utt.

Pašlaik interferona iegūšanas metode mikrobioloģiskās sintēzes ceļā tiek atzīta par daudzsološāku, kas ļauj no salīdzinoši lētām izejvielām iegūt mērķa produktu ar ievērojami lielāku ražu. Šajā gadījumā izmantotās pieejas ļauj izveidot strukturālā gēna variantus, kas ir optimāli baktēriju ekspresijai, kā arī regulējošos elementus, kas kontrolē tā ekspresiju.

Kā sākuma mikroorganismi tiek izmantoti dažādi Pichia pastoris, Pseudomonas putida un Escherichia coli celmu konstrukcijas.

Trūkums, lietojot P. pastoris kā interferona ražotāju (JN Garsija, JA Aguiar et al. // Cilvēka IFN-2b augsta līmeņa ekspresija Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995), ir ārkārtīgi sarežģīti šāda veida rauga fermentācijas apstākļi, nepieciešamība biosintēzes procesā stingri uzturēt induktora, jo īpaši metanola, koncentrāciju. Trūkums, lietojot Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) ir fermentācijas procesa sarežģītība zemā izteiksmes līmenī (10 mg interferona uz 1 litru kultūras barotnes). Produktīvāka ir Escherichia coli celmu izmantošana (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3, 9. papildinājums): S9-41-S9-51).

Ir zināms liels skaits plazmīdu un E. coli celmu, kuru pamatā ir interferons: E. coli celmi ATCC 31633 un 31644 ar plazmīdām Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 vai Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli celms pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli celms pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli SG 20050 celms ar plazmidu p280 / 21FN (Kravchenko V.V. et al. Bioorganic chemistry, 1987, 13. izdevums, 9. nr., 1186-1193 lpp., E. coli SG 20050 celms ar plazmīdu pINF14 (SU 1703691), E. coli SG 20050 celms ar plazmīdu pINF16 (RU 2054041) un cits Tehnoloģiju trūkums, pamatojoties uz šo celmu izmantošanu, ir to nestabilitāte, kā arī nepietiekama interferona ekspresija.

Paralēli izmantoto celmu īpašībām procesa efektivitāte lielā mērā ir atkarīga no tehnoloģijas, ko izmanto interferona izolēšanai un attīrīšanai.

Zināma metode interferona ražošanai, ieskaitot Ps šūnu kultivēšanu. putida, biomasas iznīcināšana, apstrāde ar polietilēnimīnu, frakcionēšana ar amonija sulfātu, hidrofobā hromatogrāfija uz fenilsilohroma C-80, lizāta pH frakcionēšana, tā koncentrēšana un diafiltrēšana, jonu apmaiņas hromatogrāfija uz celulozes DE-52, eluēšana pH gradientā, jonu apmaiņas eluents uz celulozes -52, koncentrācija, izlaižot caur filtrēšanas kaseti, un želejas filtrēšana uz Sephadex G-100 (SU 1640996). Šīs metodes trūkums papildus sarežģītai daudzpakāpju fermentācijai ir daudzpakāpju process galaprodukta iegūšanā.

Ir arī zināma interferona ražošanas metode, ieskaitot E. coli celma SG 20050 / pIF16 kultivēšanu LB-buljonā kolbās termostata kratītājā, biomasas centrifugēšanu, mazgāšanu ar buferšķīdumu un ultraskaņu šūnu iznīcināšanai. Iegūto lizātu centrifugē, mazgā ar 3M urīnvielas šķīdumu buferšķīdumā, izšķīdina guanidīna hlorīda šķīdumā buferšķīdumā, ar ultraskaņu, centrifugē, oksidatīvā sulfitolīze, dialīze pret 8 M urīnvielu, renaturācija un galīgā divpakāpju hromatogrāfija ar CM-52 celulozi un Sephadec G-50 ( RU 2054041). Šīs metodes trūkumi ir tās salīdzinoši zemais produktivitāte galvenajos izolācijas un attīrīšanas procesa posmos. Tas jo īpaši attiecas uz produkta ultraskaņas apstrādi, dialīzi un oksidatīvo sulfitolīzi, kas izraisa interferona ražas nestabilitāti, kā arī uz to, ka šo metodi nav iespējams izmantot interferona rūpnieciskai ražošanai.

Kā tuvāko analogu (prototipu) var norādīt metodi cilvēka leikocītu interferona ražošanai, kas sastāv no rekombinantā E. coli celma kultivēšanas, iegūtās biomasas sasaldēšanas temperatūrā, kas nav augstāka par -70 ° C, atkausēšana, mikroorganisma šūnu iznīcināšana ar lizocīmu, DNS un RNS atdalīšana, ieviešot DNāzes lizātā un izolētās nešķīstošās interferona formas attīrīšana, mazgājot ar buferšķīdumu ar mazgāšanas līdzekļiem, interferona nogulsnes izšķīdinot guanidīna hidrohlorīda šķīdumā, renaturējot un attīrot vienā posmā ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju. Kā ražotājs tiek izmantots E. coli SS5 celms, kas iegūts, izmantojot rekombinanto plazmidu pSS5, kas satur trīs promoterus: Plac, Pt7 un Ptrp un alfa interferona gēnu ar ieviestām nukleotīdu aizstājējām.

Interferona ekspresiju ar E. coli SS5 celmu, kas satur šo plazmīdu, kontrolē trīs promoteri: Plac, Pt7 un Ptrp. Interferona ekspresijas līmenis ir aptuveni 800 mg uz 1 litru šūnu suspensijas (RU 2165455).

Šīs metodes trūkums ir zemā izgatavojamība, izmantojot fermentu šūnu iznīcināšanu, mikroorganisma DNS un RNS un interferona vienpakāpes hromatogrāfisko attīrīšanu. Tas izraisa interferona izdalīšanās procesa nestabilitāti, noved pie tā kvalitātes pasliktināšanās un ierobežo iespēju iepriekš minēto shēmu izmantot interferona rūpnieciskai ražošanai. Šīs plazmīdas un uz tās balstītā celma trūkumi ir spēcīga T7 fāga neregulēta promotora izmantošana E. coli BL21 (DE3) celmā, kurā T7 RNS polimerāzes gēns atrodas zem lac operona promotera un kurš vienmēr "plūst". Līdz ar to šūnā nepārtraukti notiek interferona sintēze, kas noved pie plazmīdas disociācijas un celma šūnu dzīvotspējas samazināšanās, kā rezultātā - interferona ražas samazināšanās.

Šī izgudrojuma mērķis ir konstruēt rekombinanto rūpniecisko E. coli ražotāja celmu, izmantojot jaunu rekombinanto plazmīdu DNS ar augstu interferona biosintēzes līmeni, un izstrādāt efektīvu rūpniecisku tehnoloģiju interferona vielas ražošanai medicīniskiem mērķiem, kas pēc kvalitātes atbilst interferona alfa-2b vielas "Eiropas Farmakopejai".

Šī problēma tika atrisināta, izveidojot rekombinanto plazmīdu DNS pSX50 un Escherichia coli SX50 celmu, kas tika deponēts Federatīvās Valsts vienotā uzņēmuma GosNII Genetics rūpniecisko celmu Viskrievijas kolekcijā ar numuru VKPM B-8550,

kā arī metode rekombinantā alfa-2b interferona ražošanai, pamatojoties uz rekombinantā E. coli SX50 celma izmantošanu un nodrošinot tā dziļu kultivēšanu barības barotnē ar samazinātu triptofāna saturu, nepārtraukti pievienojot barības vielu substrātus biosintēzes laikā, mehāniski iznīcinot mikroorganismu šūnas augstā spiedienā, izšķīdinot agregētos olbaltumviela koncentrētā guanidīna hidrohlorīda šķīdumā, kam seko interferona renaturācija fizioloģiskos buferšķīdumos haotropisku vielu klātbūtnē un interferona trīs pakāpju hromatogrāfiska attīrīšana uz helātu veidojošās Sepharose Fast Flow sveķiem, imobilizētiem ar Cu +2 joniem, jonu apmaiņas hromatogrāfija uz jonu apmaiņas sveķiem, piemēram, CM Flow gelation Sephar hromatogrāfija uz Superdex 75 sveķiem.

Saskaņā ar izgudrojumu ir sniegta jauna rekombinantā daudzkopiju plazmīda DNS pSX50, kas kodē cilvēka leikocītu alfa-2b interferona sintēzi, kuras ekspresiju kontrolē laktozes un triptofāna promotori un transkripcijas terminators. PSX50 plazmidā ir 3218 bāzes pāri (bp), un to raksturo šādi fragmenti:

Secība no 1 nukleotīda līdz 176 nukleotīdam (nt) ietver 176 bp lielu DNS fragmentu, kas satur triptofāna promotoru (P trp);

Secība no 177 n. līdz 194 N. ietver sintētisku DNS fragmentu 18 bp, kas satur Shine Delgarno secību un ir atbildīgs par tulkošanas ierosināšanu;

Mantošana no 195. gada AD līdz 695 N. ietver 501 bp lielu DNS fragmentu, kas satur interferona gēna secību ar šādām nukleotīdu aizvietotājām: 37. pozīcijā izmaiņas no A uz C, 39. pozīcijā, izmaiņas no G uz T, 40. pozīcijā, izmaiņas no A uz C, 42. pozīcijā, izmaiņas no G uz T , 67. pozīcijā, aizstājot A ar C, 69. pozīcijā aizstājot G ar T, 70. pozīcijā A aizstājot ar C, 72. pozīcijā A aizstājot ar T, 96. pozīcijā G aizstājot ar A, 100. pozīcijā A aizstājot ar C, c 102. pozīcijā mainiet A uz T, pozīcijā 114 mainiet A uz C, 120. pozīcijā mainiet C uz G, 126. pozīcijā mainiet G uz A, 129. pozīcijā mainiet G uz A, 330. pozīcijā mainiet C uz G, 339. pozīcijā G aizstāšana ar A, 342. pozīcijā G aizstāšana ar A, 487. pozīcijā A aizstāšana ar C, 489. pozīcijā A aizstāšana ar T, 495. pozīcijā G aizstāšana ar A;

Secība no 696 n. līdz 713 N. ietver sintētisku DNS fragmentu 18 bp, kas satur sintētisku polilinkeru;

Secība no 714 n. līdz 1138. g iekļauj plazmas pKK223-3 DNS fragmentu ar 4129 nt. līdz 4553 N. izmērs 425 bp, kas satur stingras transkripcijas terminatora rrnBT 1 T 2 secību;

Secība no 1139. gada AD līdz 1229 AD ietver plazmīdas pUC19 DNS fragmentu ar 2487 nt. līdz 2577 n. 91 bp izmērs, kas satur gēna β-laktomāzes promotoru (gēnu rezistence pret ampicilīnu - Amp R);

Secība no mūsu ēras 1230. gada līdz 2045. gadam n. ietver plazmas pUC4K DNS fragmentu ar 720 nt. līdz 1535. g lielums 816 bp, kas satur kan gēna strukturālo reģionu;

Secība no 2046 AD līdz 3218 n. ietver plazmīdas pUC19 DNS fragmentu no 1625 līdz 453 nt. 1173 bp izmērs, kas satur secību, kas ir atbildīga par plazmīdas (ori) un lac promotera (Plac) replikāciju.

1.-5. Attēlā parādīta pSX50 plazmīdas uzbūves shēmas un fiziskā karte.

6. attēlā parādīta visa pSX50 plazmīda nukleotīdu secība.

Escherichia coli SX50 celms tika iegūts, pārveidojot Escherichia coli BL21 šūnas ar pSX50 plazmīdu, izmantojot tradicionālo gēnu inženierijas tehnoloģiju. E. Coli SX50 celmu raksturo šādas īpašības.

Kultūras un morfoloģiskās īpašības

Šūnas ir mazas, taisnas, sabiezinātas stieņa formas, gramnegatīvas, nesportiskas. Šūnas labi aug uz vienkāršas barības vielas. Augot uz Difco agara, veidojas apaļas, gludas, izliektas, duļķainas, spīdīgas, pelēkas kolonijas ar gludām malām. Augot šķidrā vidē (minimālā vidē ar glikozi vai LB buljonā), tie veido intensīvu, vienmērīgu dūmaku.

Fizikāli bioloģiskās pazīmes

Aerobe. Augšanas temperatūras diapazons ir 4-42 ° C ar optimālo pH 6,5-7,5.

Kā slāpekļa avotu izmanto gan minerālsāļus amonija un nitrāta formā, gan organiskos savienojumus aminoskābju, peptona, triptona, rauga ekstrakta utt.

Kā oglekļa avots tiek izmantotas aminoskābes, glicerīns, ogļhidrāti. Antibiotiku rezistence. Šūnas parāda izturību pret kanamicīnu (līdz 100 μg / ml).

Escherichia coli 8X50 celms ir interferona ražotājs.

Barotnes metode, apstākļi un sastāvs celma uzglabāšanai

L-arape, pievienojot kanamicīnu 20 μg / ml koncentrācijai zem eļļas, L-buljonā, kas satur 15% glicerīna un atbilstošās antibiotikas ampulās mīnus 70 ° C temperatūrā, liofilizētā stāvoklī ampulās plus 4 ° C temperatūrā.

Escherichia coli SX50 celmu Bergi's Identifier (1974) identificē kā Escherichia coli sugas celmu.

Alfa-2b interferona rūpnieciskās ražošanas metode

Piedāvātās metodes iezīme ir tehnoloģijas attīstība, kas ļauj izolēt interferonu no nešķīstošās formas, kas uzkrājas fermentācijas laikā, kas ļauj ievērojami vienkāršot izolēšanas procesa tehnoloģisko shēmu un palielināt mērķa produkta ražu.

Metode sastāv no Escherichia coli SX50 celma kultivēšanas barības vidē ar pastāvīgu barības vielu substrātu, vēlams glikozes un rauga ekstrakta, pievienošanu biosintēzes procesā, vēlams ar samazinātu triptofāna saturu, mikroorganismu šūnu mehānisku iznīcināšanu pie augsta 700–900 bāru spiediena, interferona izšķīšanu buferī guanidīna hidrohlorīda šķīdums, interferona renaturācija fizioloģiskos buferšķīdumos haotropisku vielu klātbūtnē, kam seko interferona trīs pakāpju hromatogrāfiska attīrīšana uz helātu radošiem Sepharose Fast Flow sveķiem, kas imobilizēti ar Cu +2 joniem, jonu apmaiņas hromatogrāfija uz CM tipa gēla Sepharose Flow un gēla Sepharose jonu apmaiņas sveķiem. sveķi, piemēram, Superdex 75.

Optimālie apstākļi atsevišķiem interferona iegūšanas posmiem ir šādi:

Fermentācija tiek veikta, nepārtraukti pievienojot substrātus visā procesā, kas izraisa augsts līmenis interferona ekspresija;

Šūnu iznīcināšana tiek veikta Gaulin tipa dezintegratorā ar 900 bāru spiedienu;

Šķīstošo šūnu komponentu (DNS, RNS, olbaltumvielas, lipopolisaharīdi utt.) Noņemšana tiek veikta, nešķīstošo interferona formu mazgājot ar buferšķīdumiem, kas satur mazgāšanas līdzekļus (Triton XI00, urīnviela utt.);

Iegūtās interferonu saturošās nogulsnes izšķīdina 6 M guanidīna hidrohlorīda buferšķīdumā;

Interferona renaturēšanu veic fizioloģiskā buferšķīdumā, kas satur haotropiskus līdzekļus;

Trīspakāpju interferona hromatogrāfiskā attīrīšana tiek veikta ar helikopteru Chelating Sepharose Fast Flow, kas imobilizēta ar Cu +2 joniem, uz CM Sepharose Fast Flow katjonu apmaiņas sveķiem un želejas filtrēšanas hromatogrāfiju ar Superdex 75 tipa sveķiem;

Pēc katras hromatogrāfiskās attīrīšanas sterilizējošo filtrēšanu veic caur pirogēnu nesaturošiem filtriem ar poru izmēru 0,22 μm.

Interferona iznākums aprakstītās metodes izmantošanas rezultātā ir aptuveni 400-800 mg interferona no 1 litra barotnes. Iegūtā produkta kvalitāte atbilst "Eiropas Farmakopejas" standartiem un prasībām attiecībā uz vielu alfa-2b interferonu.

Būtiskās atšķirības starp piedāvāto metodi un prototipu ir:

Celma konstrukcijas izmantošana ar augstāku produktivitāti, kas ļauj iegūt biosintēzes laikā lielāku daudzumu interferona no 1 litra barotnes;

Šūnu biomasas efektīvas mehāniskas iznīcināšanas izmantošana, kas ļauj īsākā laikā iegūt mazāk tīru nešķīstošās interferona formas ekstraktu ar mazākiem zaudējumiem;

Fizioloģisko buferšķīdumu izmantošana renaturācijas laikā haotropisko līdzekļu klātbūtnē palielina pareizi renaturētas interferona formas ražu;

Trīspakāpju interferona hromatogrāfiskā attīrīšana ļauj iegūt interferona vielu, kuras tīrība pārsniedz 99% saskaņā ar elektroforēzi reducējošos un nesamazinošos apstākļos, krāsojot želejas ar sudrabu un vairāk nekā 98% saskaņā ar RF HPLC un praktiski bez pirogēniem (LAL tests).

Pieprasītās izgudrojumu grupas būtību un priekšrocības ilustrē šādi piemēri.

1. piemērs. Rekombinantās plazmīdas pSX50 konstruēšana

PSX50 plazmīda konstruēšanas metode ietver šādas darbības:

Vektora plazmīdas pSX10 konstruēšana;

1. pSX3 plazmīdas konstrukcija (2641 bp)

2. vektora plazmīdas pSX10 uzbūve (2553 bp)

Rekombinantās plazmīdas pSX41 (3218 bp) konstruēšana;

Rekombinantās plazmīdas pSX43 konstruēšana (3218 bp);

Rekombinantās plazmīdas pSX45 konstruēšana (3218 bp);

Rekombinantās plazmīdas pSX50 (3218 bp) konstruēšana.

Vektora plazmīdas pSX10 konstruēšana

Vektora plazmīda pSX10 ir vektors pUC19, kurā beta-laktomāzes gēna kodējošā secība, kas piešķir rezistenci pret ampicilīnu, tiek aizstāta ar kan gēna kodēšanas secību un satur transkripcijas terminatoru no plazmīdas pKK223-3.

Vektora plazmīdas pSS10 konstruēšana tiek veikta divos posmos:

Iegūstot plazmidu pSX3 (2641 bp), kas ir pUC19 plazmīds, kurā amp gēna kodējošais reģions tiek aizstāts ar kan gēna kodējošo reģionu;

Vēja plazmīdas pSX10 (2553 bp) iegūšana, kas ir pSX3 plazmīda, kurā DNS fragments, kas kodē transkripcijas terminatoru rBT1 T2, tiek ievietots aiz BamHI vietas.

Lai iegūtu plazmidu pSX3, tiek veiktas piecas DNS amplifikācijas kārtas ar PCR (polimerāzes ķēdes reakcija). Pirmajā kārtā, izmantojot matricu plazmīdas pUC19 DNS, tiek veikta 1828 bp DNS fragmenta amplifikācija. (fragments PU1-PU2), izmantojot gruntējumus:

Šo un turpmākās PCR reakcijas veic šādos apstākļos: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4) 2S04, 10 mM KCl, 2 tM MgCl2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg / ml BSA, 0,2 mM katras dNTP, 1,25 vienības. Pfu DNS polimerāze, 100 ng DNS. Pastiprināšanas process sastāv no šādiem posmiem: karsēšana 95 ° C temperatūrā 5 minūtes, 35 PCR cikli (30 sek. Pie 95 ° С, 30 sekundes pie 56 ° С, 2 minūtes pie 72 ° С) un inkubācija 10 minūtes 72 ° C temperatūrā. Pēc amplifikācijas (un pēc sekojošām amplifikācijām) DNS fragmentu attīra ar elektroforēzi 1% agarozes gēlā. Otrajā un trešajā kārtā, izmantojot šablonu pUC4K plazmīdas DNS, tiek pastiprināts 555 bp liels DNS fragments. (fragments KM1-KM2), izmantojot grunti:

un 258 bp DNS fragmenta amplifikācija. (KMZ-KM4) ar gruntējumiem

Piektajā PCR kārtā fragmenti (PU1-PU2) un (KM1-KM4) tiek apvienoti šādos apstākļos: sildīšana 95 ° C temperatūrā 5 minūtes, 5 PCR cikli (30 sek. 95 ° C, 30 sek. 56 ° C, 10 minūtes 72 °). C) un inkubē 10 minūtes 72 ° C temperatūrā. Pēc pēdējās PCR iegūtā DNS tiek tieši pārveidota E. coli DH5 celma šūnās un izklāta uz LA barotnes, kas satur 20 μg / ml kanamicīna. Pēc 12 stundu ilgas inkubācijas 37 ° C temperatūrā klonus izsijā, izolē plazmīdo DNS un veic restrikcijas analīzi. Rezultātā tiek iegūta pSX3 plazmīda ar 2641 bp lielumu.

Lai iegūtu vektora plazmidu pSX10, tiek veiktas trīs DNS amplifikācijas kārtas ar PCR. Pirmajā kārtā, izmantojot matricu pSX3 plazmīdas DNS, tiek veikta 2025 bp DNS fragmenta amplifikācija. (fragments 10.1-10.2), izmantojot grunti:

Otrās kārtas laikā, izmantojot matricu pKK223-3 plazmīdas DNS, tiek veikta DNS fragmenta amplifikācija 528 bp. (fragments KK1-KK2), izmantojot grunti:

PCR trešajā kārtā fragmenti (10.1-10.2) un (KK1-KK2) tiek apvienoti šādos apstākļos: sildīšana 95 ° C temperatūrā 5 minūtes, 5 PCR cikli (30 sek. 95 ° C, 30 sek. 56 ° C, 10 min. 72 °). C) un inkubē 10 minūtes 72 ° C temperatūrā. Pēc pēdējās PCR iegūtā DNS tiek tieši pārveidota E. coli DH5 celma šūnās un sēta LA barotnē, kas satur 20 μg / ml kanamicīna. Pēc 12 stundu ilgas inkubācijas 37 ° C temperatūrā klonus izsijā, izolē plazmīdo DNS un veic restrikcijas analīzi. Rezultātā tiek iegūta 2553 bp plazmīda pSX10.

Rekombinantās plazmīdas pSX41 konstruēšana

Rekombinantā plazmīda pSX41 ir vektora pSX3 plazmas Hind III - BamHI DNS fragments (2529 bp), Hind III - EcoRI 168 bp DNS fragments, kas kodē E. coli triptofāna operona promotoru (P trp), EcoRI-XbaI sintētisks 20 fragmentu DNS fragments, kas kodē SD secību (Shine-Delgarno), un XbaI-BamHI - 501 bp DNS fragments, kas kodē cilvēka interferona alfa 2b gēnu.

Lai iegūtu Hind III - BamHI, vektora plazmīdas pSX3 (2529 bp) DNS fragmentu, pSX3 plazmīdas DNS apstrādā ar HindIII un BamHI restrikcijas enzīmiem, kam seko elektroforētiska attīrīšana 1% agarozes gēlā. Hind III EcoRI DNS fragmentu 168 bp, kas kodē triptofāna operona promotoru (P trp), iegūst ar PCR, izmantojot kopēju E. coli DNS kā matriku un primerus TRP1 un PRP2, kam seko amplificētā fragmenta apstrāde ar restrikcijas enzīmiem Hindlll un EcoRI:

Lai iegūtu EcoRI-Xbal sintētisku 20 bp lielu DNS fragmentu, kas kodē SD secību (Shine-Delgarno), tiek sintezēti šādi komplementāri oligonukleotīdi:

501 bp XbaI-BamIII DNS fragmentu, kas kodē cilvēka interferona alfa 2b gēnu, iegūst ar PCR, izmantojot kopējo cilvēka DNS kā matriku un gruntējumus IFN1 un IFN2, kam seko amplificētā fragmenta apstrāde ar restrikcijas enzīmiem Xbal un BamIII:

Tad elektroforētiski attīrītos fragmentus apvieno, sasaista ar T4 fāga ligāzes enzīmu, DNS pārveido E. coli DH5 celma šūnās un sēj uz LA barotni, kas satur 20 μg / ml kanamicīna. Pēc 12 stundu ilgas inkubācijas 37 ° C temperatūrā klonus izsijā, izolē plazmīdo DNS, veic restrikcijas analīzi un nosaka DNS primāro struktūru. Rezultātā tiek iegūta 3218 bp plazmīda pSX41. Pēc tam tiek veikta pakāpeniska interferona gēna mutagēze, lai palielinātu mērķa produkta ekspresijas līmeni. Interferona gēna mutagēze sastāv no tripletu, kas reti sastopami E. coli, kas kodē atbilstošās aminoskābes, aizstāšanas ar tripletiem, kas bieži sastopami E. coli, kodējot tās pašas aminoskābes. Interferona gēna DNS mutagēzi veic ar PCR.

Rekombinantās plazmīdas pSX43 konstruēšana

Lai iegūtu rekombinanto plazmidu pSX43, tiek veikta viena DNS amplifikācijas kārta ar PCR, izmantojot templātu pSX41 DNS un IFN3 un IFN4 primerus:

PCR veic šādos apstākļos: karsēšana 95 ° C temperatūrā 5 minūtes, 20 PCR cikli (30 sek. 95 ° C temperatūrā, 30 sek. 56 ° C temperatūrā, 10 minūtes 72 ° C temperatūrā) un inkubācija 20 minūtes 72 ° C temperatūrā. Pēc PCR iegūtā DNS tiek tieši pārveidota E. coli DH5 celma šūnās un izklāta uz LA barotnes, kas satur 20 μg / ml kanamicīna. Pēc 12 stundu ilgas inkubācijas 37 ° C temperatūrā klonus izsijā, izolē plazmīdo DNS, veic restrikcijas analīzi un nosaka DNS primāro struktūru. Rezultātā tiek iegūta pSX43 plazmīda ar 3218 bp lielumu.

Rekombinantās plazmīdas pSX45 konstruēšana

Lai iegūtu rekombinanto plazmidu pSX45, tiek veikta viena DNS amplifikācijas kārta ar PCR, izmantojot matricu pSX43 plazmīdas DNS un IFN5 un IFN6 primerus:

PCR veic šādos apstākļos: karsēšana 95 ° C temperatūrā 5 minūtes, 20 PCR cikli (30 sek. 95 ° C, 30 sek. 56 ° C, 10 min. 72 ° C) un inkubācija 20 minūtes 72 ° C temperatūrā. Pēc PCR iegūtā DNS tiek tieši pārveidota E. coli DH5 celma šūnās un izklāta uz LA barotnes, kas satur 20 μg / ml kanamicīna. Pēc 12 stundu ilgas inkubācijas 37 ° C temperatūrā klonus izsijā, izolē plazmīdo DNS, veic restrikcijas analīzi un nosaka DNS primāro struktūru. Rezultātā tiek iegūta 3218 bp plazmīda pSX45.

Rekombinantās plazmīdas pSX50 konstruēšana.

Lai iegūtu rekombinanto plazmīdu pSX50, tiek veikta viena DNS amplifikācijas kārta ar PCR, izmantojot matricu pSX45 plazmīdas DNS un IFN7 un IFN8 primerus:

2. piemērs. E. coli SX50 celma iegūšana - interferona ražotājs

Celmu, kas ražo interferonu E. coli SX50, iegūst, pārveidojot E. coli BL21 celma šūnas ar rekombinanto plazmidu pSX50. Interferonu ražojošo celmu 30 l fermentatorā audzē līdz optiskajam blīvumam 25,0-30,0 o.u. M9 barotnē, kas satur 1% skābā kazeīna hidrolizāta (Difco), 1% glikozes, 40 μg / ml kanamicīna, 38-39 ° C temperatūrā. Fermentācijas laikā uzturvielu substrātu nepārtraukti pievieno, izmantojot gravitometrisko kontrolieri.

3. piemērs. Interferona izolēšanas metode no E. coli SX50 celma

Interferons tika iegūts 4 posmos:

1. posms. E. coli SX50 celma kultivēšana.

2. posms. Nešķīstošās interferona formas izolēšana un attīrīšana.

3. posms. Interferona izšķīšana un renaturācija.

4. posms. Interferona hromatogrāfiska attīrīšana.

1. posms. E. coli SX50 celma kultivēšana

Izaudzēto E. coli SX50 celma inokulātu 3 l bagātīgas LB barotnes tilpumā 12 stundas 26 ° C temperatūrā aseptiski ievada fermentatorā, kas satur 27 l sterilas barotnes, kas satur M9, 1% kazeīna skābes hidrolizāta, 1% glikozes, 1 mM MgCl. 2, 0,1 mM CaCl2, 40 mg / ml kanamicīna. Audzēšana fermentatorā tiek veikta 38-39 ° C temperatūrā, saglabājot pH 7 ± 0,15, automātiski titrējot ar 40% nātrija hidroksīda šķīdumu. Izšķīdušā skābekļa koncentrācija piesātinājuma diapazonā (50 ± 10)% tiek uzturēta, mainot maisītāja ātrumu no 100 līdz 800 apgriezieniem minūtē un gaisa padevi no 1 līdz 15 l / min. Fermentācijas laikā mēra substrātu, jo īpaši glikozes un rauga ekstrakta, koncentrāciju, un to koncentrāciju uztur, mainot koncentrētu šķīdumu padeves ātrumu caur peristaltiskajiem sūkņiem, izmantojot gravimetrisko kontrolieri.

Nešķīstoša interferona uzkrāšanos kontrolē ar fāžu kontrasta mikroskopiju, 15% poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAAG) un reversās fāzes augstas veiktspējas hromatogrāfiju (RF HPLC). Fermentācija tiek pārtraukta, kad tiek sasniegts maksimālais optiskais blīvums (~ 25-30 pu) un apstājas interferona sintēze. Fermentācijas beigās kultūras šķidrumu atdala, centrifugējot caurplūdes rotorā ar rotācijas ātrumu 5000-10000 apgr./min. Biomasa ir iepakota plastmasas maisiņos un sasaldēta mīnus 70 ° C temperatūrā.

2. posms. Nešķīstošās interferona formas izolēšana un attīrīšana

300-400 g sasaldētas E. coli SX50 celma biomasas suspendē 3000 ml 1. bufera (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspensiju izlaiž caur Gaulin tipa caurplūdes homogenizatoru, uztur 900 bar un centrifugē caurplūdes rotorā ar ātrumu 15 000 apgr./min. Iegūtās nogulsnes secīgos apstākļos mazgā līdzīgos apstākļos ar buferiem 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M karbamīda) un 3. buferšķīdumu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), un visbeidzot interferona nogulsnes suspendē 200 ml ml bufera 3. Tajā pašā laikā nešķīstošās interferona formas izolēšanas un attīrīšanas laiks ir ne vairāk kā 5 stundas.

3. posms. Interferona izšķīšana un renaturācija

Iepriekšējā posmā iegūtās nešķīstošās interferona formas suspensijai 6 M koncentrācijai pievieno sausu guanidīna hidrohlorīdu, 50 mM koncentrācijai pievieno ditiotreitolu, Tris-HCl pH 8,0 līdz 50 mM, NaCl līdz 150 mM un Triton X100 līdz 0,1% koncentrācijai, inkubē pie 0,1%. istabas temperatūrā 2 stundas.Nešķīstošo materiālu atdala, sterilizējot filtrēšanu caur membrānām, kuru poru diametrs ir 0,22 mikroni.

Interferona renaturācija tiek veikta, iegūto šķīdumu 100-200 reizes lēnām atšķaidot ar 4. buferšķīdumu (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Pēc tam renaturācijas maisījumu pastāvīgi maisot, inkubē 12-15 stundas 4-8 ° C temperatūrā. Tad magnija sulfātu pievieno 1 mM koncentrācijai un sakopoto materiālu noņem, sterilizējot filtrēšanu caur membrānas filtru ar poru diametru 0,22 mikroni.

4. posms. Interferona hromatogrāfiska attīrīšana

Interferona hromatogrāfisko attīrīšanu veic trīs posmos.

1. Iegūto renaturēto interferonu pirmajā posmā attīra ar afinitātes hromatogrāfiju uz helātu veidojošā Sepharose Fast Flow sveķiem (Amersham Biosciences), kas imobilizēti ar Cu +2 joniem. Šim nolūkam kolonnai uzliek interferona šķīdumu ar Cu +2 helātus veidojošu Sepharose Fast Flow, un interferonu eluē ar 0,1 M citronskābes buferšķīdumu, pH 2,2.

2. Hromatogrāfiskās attīrīšanas otrajā posmā interferona šķīdumu uzklāj CM Sepharose Fast Flow katjonu apmaiņas sveķiem (Amersham Biosciences) un interferonu eluē ar šķīdumu gradientu (0,0-0,5 M NaCl) 50 mM Na (CH 3 COO) buferšķīdumā, pH 5,5.

3. Interferona monomēra formas attīrīšana no interferona polimēru formu atlikumiem tiek veikta interferona attīrīšanas trešajā posmā ar želejas filtrēšanu uz Superdex 75 sveķiem (Amersham Biosciences). Hromatogrāfiju veic 50 mM Na (CH 3 COO) buferšķīdumā, pH 5,0, kas satur 0,15 M NaCl.

Aprakstītā interferona izolēšanas un attīrīšanas metode ļauj vienā izolēšanas ciklā 7-10 dienas iegūt 4-8 g augsti attīrīta interferona no biomasas, kas iegūta no 10 l barotnes. Iegūtā interferona kvalitāte pilnībā atbilst "Eiropas Farmakopejas" prasībām attiecībā uz alfa-2b interferona vielu, proti:

Interferona koncentrācija nav mazāka par 2 × 108 SV / ml;

Interferona specifiskā aktivitāte nav mazāka par 2,0 × 108 SV / mg;

Preparāta elektroforētiskā tīrība reducējošos un nesamazinošos apstākļos, krāsojot želejas ar sudrabu, nav mazāka par 99%;

Izolētā interferona izoelektriskais punkts ir pH 5,8-6,3 zonā;

Izolētā interferona peptīdu karte būtiski neatšķiras no peptīda kartes, kas piemērota alfa 2b interferona CRS Eiropas standartam;

Kā izriet no iepriekš minētajiem piemēriem, pieprasītā izgudrojumu grupa ļauj iegūt alfa-2b interferonu ar lielu ražu ar salīdzinoši vienkāršu un uzticamu tehnoloģiju.

PRASĪBA

1. Rekombinantā plazmīda DNS pSX50, kas kodē cilvēka rekombinantā alfa-2b interferona sintēzi, kas raksturīga ar to, ka tā izmērs ir 3218 bāzes pāri (bp) un sastāv no šādiem fragmentiem: 1. līdz 176. nukleotīda (bp) secībā ir fragments. DNS 176 bp, kas satur triptofāna promotoru (P trp), secība no 177 līdz 194 bp. ietver sintētisku DNS fragmentu 18 bp, kas satur Shine Delgarno sekvenci, kas ir atbildīga par tulkošanas ierosināšanu, secība no 195 līdz 695 nt. ietver 501 bp lielu DNS fragmentu, kas satur interferona alfa-2b gēnu ar nukleotīdu aizstājējiem: 37 (A\u003e C), 39 (G\u003e T), 40 (A\u003e C), 42 (G\u003e T), 67 ( A\u003e C), 69 (G\u003e T), 70 (A\u003e C), 72 (A\u003e T), 96 (G\u003e A), 100 (A\u003e C), 102 (A\u003e T), 114 (A \u003e C), 120 (C\u003e G), 126 (G\u003e A), 129 (G\u003e A), 330 (C\u003e G), 339 (G\u003e A), 342 (G\u003e A), 487 (A\u003e C), 489 (A\u003e T), 495 (G\u003e A), secība no 696 līdz 713 n. ietver sintētisku DNS fragmentu 18 bp, kas satur sintētisku polilinkeru, secība no 714 līdz 1138 bp. ietver plazmas pKK223-3 DNS fragmentu no 4129 līdz 4553 nt. izmērs 425 bp, kas satur stingras transkripcijas terminatora rrnBT 1 T 2 secību, secība no 1139 līdz 1229 nt. satur pUC19 plazmīdas DNS fragmentu no 2487 līdz 2577 nt. 91 bp izmērs, kas satur gēna β-laktomāzes promotoru (gēna rezistence pret ampicilīnu -Amp R), secība no 1230 līdz 2045 nt. ietver plazmas pUC4K DNS fragmentu ar 720 nt. līdz 1535. g izmērs 816 bp, kas satur kan gēna strukturālo reģionu, secība no 2046 bp. līdz 3218 n. ietver plazmīdas pUC19 DNS fragmentu no 1625 līdz 453 nt. 1173 bp izmērs, kas satur secību, kas ir atbildīga par plazmīdas (ori) un lac promotera (Plac) replikāciju.

2. Baktēriju celms Eschcerichia coli SX50, kas pārveidots ar rekombinanto plazmīdu saskaņā ar 1. pretenziju - rekombinantā cilvēka leikocītu interferona alfa-2b ražotājs.

3. Metode cilvēka interferona alfa-2b iegūšanai, ieskaitot Escherichia coli SX5 celma audzēšanu saskaņā ar 2. punktu barības vidē ar pastāvīgu barības vielu substrātu pievienošanu biosintēzes laikā, mikroorganismu šūnu mehānisku iznīcināšanu pie 700-900 bāru spiediena, interferona izšķīšanu guanidīna hidrohlorīda buferšķīdumā. , interferona renaturācija fizioloģiskos buferšķīdumos haotropisku vielu klātbūtnē, interferona trīs pakāpju hromatogrāfiska attīrīšana ar helātu radošiem Sepharose Fast Flow sveķiem, kas imobilizēti ar Cu +2 joniem, jonu apmaiņas hromatogrāfija ar CM Sepharose Fast Flow jonu apmaiņas sveķiem un želejas filtrēšanas hromatogrāfija ar Superdex 75 sveķiem. ...

4. Metode saskaņā ar 3. punktu, kurā kultivēšana tiek veikta uz barības vielas ar samazinātu triptofāna saturu, nepārtraukti pievienojot barības vielu substrātus, vēlams glikozi un rauga ekstraktu.

5. Metode saskaņā ar 3. punktu, kas atšķiras ar to, ka pirms interferona izšķīdināšanas to attīra, noņemot šķīstošos šūnu komponentus, ieskaitot DNS, RNS, olbaltumvielas, lipopolisaharīdus, mazgājot ar buferšķīdumiem, kas satur Triton XI 00 tipa mazgāšanas līdzekļus, urīnvielas.

6. Metode saskaņā ar 3. punktu, kas atšķiras ar to, ka pēc katras hromatogrāfiskās attīrīšanas sterilizējošu filtrēšanu veic caur filtriem, kuru poru izmērs ir 0,22 μm.