Хүүхдийн эрүүл мэнд. Эмийн тухай бүх зүйл Интерферон альфа 2б гэж юу вэ
Эмнэлзүйн судалгаанд өргөн хүрээний заалт, тунгийн өргөн хүрээнд (үсэрхэг эсийн лейкемийн хувьд долоо хоногт 6 сая IU / m2; меланомын үед долоо хоногт 100 сая IU / m2 хүртэл), хамгийн түгээмэл тохиолддог сөрөг үзэгдэл нь халуурах, ядрах, толгой өвдөх, миалги. Мансууруулах бодис өгөхийг зогсоосноос хойш 72 цагийн дотор халуурах, ядаргаа намдав. Температур нь ихэвчлэн интерферон эмчилгээний үед ажиглагддаг томуу төст синдромын шинж тэмдгүүдийн нэг байж болох ч бусдыг үгүйсгэхийн тулд шинжилгээ хийх хэрэгтэй. боломжтой шалтгаанууд байнгын халууралт.
Доорх аюулгүй байдлын танилцуулгыг 4-ээс авсан болно эмнэлзүйн судалгаа архаг гепатит С-тэй өвчтөнд Intron A-ийг моно эмчилгээ эсвэл рибавиринтай хавсарч 1 жилийн турш хэрэглэсэн. Бүх өвчтөнүүд долоо хоногт 3 удаа 3 сая IU Intron A эм ууж байсан.
Хүснэгт 2-т 1 жилийн турш эмчилгээ хийлгээгүй, Intron A (эсвэл Intron A-г рибавиринтэй хамт) хэрэглэсэн өвчтөнүүдэд 10% -иас дээш буюу түүнээс дээш давтамжтайгаар ажиглагдсан сөрөг үзэгдлийг харуулав. Ерөнхийдөө мэдээлэгдсэн сөрөг үзэгдлүүд хөнгөн, дунд зэрэг байв.
Хүснэгт 2.
| Сөрөг үйл явдлууд | Intron A (n \u003d 806) | Intron A + рибавирин (n \u003d 1010) |
| Орон нутгийн хариу үйлдэл | ||
| Тарилгын талбайн үрэвслийн урвал | 9–16% | 6–17% |
| Тарилгын талбайн бусад урвалууд | 5–8% | 3–36% |
| Ерөнхий урвал | ||
| Толгой өвдөх | 51–64% | 48–64% |
| Ядаргаа | 42–79% | 43–68% |
| Хүйтэн | 15–39% | 19–41% |
| Халуурах | 29–39% | 29–41% |
| Томуу төст синдром | 19–37% | 18–29% |
| Астения | 9–30% | 9–30% |
| Жин хасах | 6–11% | 9–19% |
| Ходоод гэдэсний урвал | ||
| Дотор муухайрах | 18–31% | 25–44% |
| Хоолны дуршилгүй болох | 14–19% | 19–26% |
| Суулгалт | 12–22% | 13–18% |
| Гэдэсний өвчин | 9–17% | 9–14% |
| Бөөлжих | 3–10% | 6–10% |
| Булчингийн тогтолцооны урвал | ||
| Миалгиа | 41–61% | 30–62% |
| Артралгиа | 25–31% | 21–29% |
| Ясны болон булчингийн өвдөлт | 15–20% | 11–20% |
| Төв мэдрэлийн системийн хариу урвал | ||
| Сэтгэлийн хямрал | 16–36% | 25–34% |
| Цочромтгой байдал | 13–27% | 18–34% |
| Нойргүйдэл | 21–28% | 33–41% |
| Сэтгэл түгших | 8–12% | 8–16% |
| Төвлөрөх чадвар буурсан | 8–14% | 9–21% |
| Сэтгэлийн мэдрэмж | 8–14% | 5–11% |
| Арьсны хариу урвал | ||
| Алопеци | 22–31% | 26–32% |
| Загатнах | 6–9% | 18–37% |
| Хуурай арьс | 5–8% | 5–7% |
| Тууралт | 10–21% | 15–24% |
| Амьсгалын замын урвал | ||
| Фарингит | 3–7% | 7–13% |
| Ханиалга | 3–7% | 8–11% |
| Амьсгаадалт | 2–9% | 10–22% |
| Бусад | ||
| Толгой эргэх | 8–18% | 10–22% |
| Вирусын халдвар | 0–7% | 3–10% |
Вируст гепатит С-тэй өвчтөнүүдэд ажиглагдаж буй сөрөг үзэгдлүүд нь Intron A-ийг хэрэглэхэд ажиглагдаж буй тохиолдлуудтай тохирч байгаа бөгөөд энэ нь тохиолдлын тунгаас хамааралтайгаар нэмэгддэг.
Intron A-ийг бусад заалтын хувьд (эмнэлзүйн болон клиникийн гаднах туршилтанд) хэрэглэхэд ховор тохиолддог (| 1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Бие махбодоос бүхэлд нь.Маш ховор тохиолддог - нүүрний хаван.
Астеникийн эмгэг (астения, сульдах, ядаргаа), шингэн алдалт, зүрх дэлсэх, псориаз, мөөгөнцрийн халдвар, бактерийн халдвар (сепсис орно) зэрэг мэдээлэгдсэн байдаг.
Дархлааны системээс.Маш ховор тохиолдолд саркоидоз буюу түүний байдал улам дорддог.
Альфа интерфероныг хэрэглэснээр идиопатик буюу тромботик тромбоцитопенийн пурпура, ревматоид артрит, системийн чонон яр, судасны үрэвсэл, Фогт-Коянаги-Харада хам шинж.
Хэт мэдрэгшлийн цочмог урвалын тохиолдол, үүнд чонон хөрвөс, ангиоэдемийн тохиолдол бүртгэгдсэн байдаг харшлын хаван анафилакс.
Хажуу талаас нь зүрх судасны систем: ховор тохиолддог - хэм алдагдал (ихэвчлэн зүрх судасны тогтолцооны өмнөх өвчнөөр өвчилсөн эсвэл зүрх судасны хордлогын эмчилгээ хийлгэсэн өвчтөнүүдэд тохиолддог), түр зуур буцах кардиомиопати (зүрх судасны тогтолцооны ачаалалгүй түүхгүй өвчтөнүүдэд тэмдэглэдэг); маш ховор тохиолддог - артерийн гипотензи, миокардийн ишеми ба миокардийн шигдээс.
Төв мэдрэлийн систем ба захын мэдрэлийн системээс.Ховор тохиолдолд - амиа хорлох хандлага; маш ховор тохиолддог - бусад хүмүүст чиглэсэн түрэмгий зан байдал, амиа хорлох оролдлого, амиа хорлох, сэтгэцийн эмгэг (хий үзэгдэл орно), ухамсар, мэдрэлийн эмгэг, полиневропати, энцефалопати, тархины судасны ишеми, тархины судасны цус алдалт, захын мэдрэлийн эмгэг, таталт.
Сонсголын эрхтэнээс.Маш ховор тохиолддог - сонсголын бэрхшээл.
Дотоод шүүрлийн системээс.Ховор тохиолдолд - чихрийн шижин, одоо байгаа чихрийн шижин өвчний явц муудаж байна.
Ходоод гэдэсний замаас.Маш ховор тохиолдолд - нойр булчирхайн үрэвсэл, хоолны дуршил нэмэгдэх, бохь цус алдах, колит.
Элэг ба цөсний замаас.Маш ховор тохиолддог - элэгний хоруу чанар (үхлийг оруулаад).
Шүд ба пародонтозын өөрчлөлт. Нитрон А ба рибавиринтай хавсарсан эмчилгээ хийлгэж буй өвчтөнүүдэд шүд, пародонтозын эмгэг өөрчлөлтийг тэмдэглэсэн. Рибавирин, Интрон А-тай удаан хугацааны хавсарсан эмчилгээ бүхий ам хуурайших нь шүд, амны хөндийн салст бүрхэвчийг гэмтээх аюултай. Өвчтөнүүд өдөрт 2 удаа шүдээ угааж, шүдний эмчийн үзлэгт тогтмол хамрагдаж байх ёстой. Үүнээс гадна зарим өвчтөнд бөөлжих шинж тэмдэг илэрч болно.
Бодисын солилцооны талаас.Ховор тохиолдолд - гипергликеми, гипертриглицеридеми.
Булчингийн тогтолцооноос.Ховор тохиолдолд - рабдомиолиз (заримдаа хүнд хэлбэрийн), хөлний булчин, нурууны өвдөлт, миозит.
Арьсны хэсэг дээр.Маш ховор тохиолддог - олон янзын улайлт, Стивенс-Жонсоны хам шинж, эпидермисийн хорт үхжил, тарилгын талбайн үхжил.
Амьсгалын тогтолцооноос.Ховор тохиолдолд уушгины хатгалгаа; маш ховор тохиолдолд уушигны нэвчдэс, уушгины үрэвсэл.
Шээсний системээс.Маш ховор тохиолддог - бөөрний эмгэг, бөөрний үйл ажиллагааны алдагдал, бөөрний дутагдал.
Цус үүсгэгч системээс.Маш ховор тохиолдолд Intron A-ийг дангаар нь эсвэл рибавиринтэй хавсарч хэрэглэхэд апластик цус багадалт, улаан чөмөгний бүрэн аплази ажиглагддаг.
Харааны эрхтэнХовор тохиолдолд - нүдний торлог бүрхэвчид цус алдах, нүдний ёроолд фокусын өөрчлөлт, нүдний торлог бүрхэвчийн артери ба венийн тромбоз үүсэх, харааны мэдрэмж буурах, харааны талбайн хэмжээ буурах, нүдний мэдрэлийн үрэвсэл, нүдний мэдрэлийн толгой хавагнах.
Эмнэлзүйн хувьд чухал өөрчлөлтүүд лабораторийн үзүүлэлтүүд.(эмийг өдөрт 10 сая IU-ээс их тунгаар томилох үед ихэвчлэн ажиглагддаг) - гранулоцит ба лейкоцитын тоо буурч, гемоглобин болон ялтасны тоо буурч, шүлтлэг фосфатаза, LDH, креатинин, ийлдэс мочевин азотын хэмжээ нэмэгддэг. Цусны сийвэн дэх ALT ба ACT-ийн үйл ажиллагааны өсөлт нь гепатитээс бусад бүх заалт, түүнчлэн HBV ДНХ байхгүй тохиолдолд архаг гепатит В өвчтэй зарим өвчтөнд хэрэглэхэд эмгэг гэж тэмдэглэгдсэн байдаг.
Хэрэв Intron A-ийг хэрэглэх үед ямар нэгэн заалтаар хүсээгүй үр дагавар гарвал та хүсээгүй үр дагаврыг арилгах хүртэл тунг багасгах эсвэл эмчилгээг түр зогсоох хэрэгтэй. Тохиромжтой тунгийн дэглэмийг хэрэглэснээр байнгын буюу давтан үл тэвчих шинж илэрвэл эсвэл өвчний явц үргэлжилж байвал Intron A эмчилгээг цуцална.
- Клиникийн фармакологи
Фармакологийн үйлдэл - вирусын эсрэг, antitumor ба дархлаа зохицуулах.
Энэ нь 19,300 далтон молекул жинтэй, маш их цэвэршүүлсэн рекомбинант уураг юм. Бактерийн плазмидыг хүний \u200b\u200bлейкоцитийн генээр интерфероны синтезийг кодчилох замаар эрлийзжүүлэх замаар E. coli клоноос гаргаж авдаг. Интерфероноос ялгаатай нь альфа-2а нь 23-р байрлалд аргинин агуулдаг бөгөөд энэ нь вирусын эсрэг үйлчилгээтэй бөгөөд энэ нь тодорхой мембран рецепторуудтай харилцан үйлчлэлцэх, РНХ-ийн синтез ба эцэст нь уургийн индукцээс үүдэлтэй юм. Сүүлийнх нь эргээд вирусын хэвийн нөхөн үржихүй эсвэл түүнийг суллахад саад учруулдаг. Энэ нь фагоцитозыг идэвхжүүлэх, эсрэгбие ба лимфокин үүсэхийг өдөөхтэй холбоотой дархлаа зохицуулах үйлчилгээтэй байдаг. Хавдрын эсүүдэд пролифератив нөлөө үзүүлдэг.
- Фармакокинетик
Булчинд тарихад 70% нь цусны эргэлтэнд ордог. Энэ нь голчлон бөөрөнд, бага хэмжээгээр элэгэнд биотрансформацид ордог. Интерферон альфа-2b нь бөөрөөр ялгардаг.
- Фармакокинетик
- Хэрэглэх заалт
- Архаг гепатит В.
- Архаг гепатит С.
- Мөөгний микоз.
- Анхдагч Т эсийн лимфосаркома.
- Үстэй эсийн лейкеми.
- Олон миелома (ерөнхий хэлбэр).
- Архаг миелоид лейкеми.
- Хорт хавдрын меланома.
- Давсагны хавдар (өнгөц байрлалтай).
- Суурийн эсийн хорт хавдар.
- Шилжүүлсэн кондиломатоз.
- Капошийн саркома (ДОХ-ыг оруулаад).
- Ходжкины бус лимфома (хавсарсан эмчилгээний нэг хэсэг).
- Хэрэглэх арга ба тун
Заалт, эмчилгээний горимоос хамааран хувь хүн.
- Үстэй эсийн лейкемийн үед
Насанд хүрэгчид долоо хоногт 3 удаа булчинд эсвэл арьсан дор 2 сая IU / m 2 тарина.
- Капошигийн саркомагаар
Долоо хоногт 3 удаа 30 сая IU / м 2.
- Үстэй эсийн лейкемийн үед
- Эсрэг заалт
- Зүрх судасны хүнд өвчин.
- Элэг ба / эсвэл бөөрний үйл ажиллагааны хүнд хэлбэр.
- Эпилепси ба / эсвэл төв мэдрэлийн системийн үйл ажиллагааны ноцтой эмгэгүүд.
- Элэгний хатуурлын аюул заналхийлсэн архаг гепатит.
- Декомпенсацийн үе шатанд элэгний өвчин.
- Дархлаа дарангуйлагчтай өмнөх эмчилгээний өмнөх болон дараах архаг гепатит (кортикостероидуудтай богино хугацааны эмчилгээ цуцлагдсанаас бусад тохиолдолд).
- Аутоиммун гепатит.
- Аутоиммун өвчний түүх.
- Дархлаа дарангуйлсан шилжүүлэн суулгуулсан хүмүүс.
- Бамбай булчирхайн өмнөх өвчин.
- Интерферон альфа-2б-д хэт мэдрэг байдал.
- Жирэмсэн ба хөхүүл үед хэрэглэх
Жирэмсэн үед хэрэглэх нь эхэд хүлээгдэж буй ашиг нь урагт учирч болзошгүй эрсдлээс давсан тохиолдолд боломжтой байдаг. Нөхөн үржихүйн насны эмэгтэйчүүд интерферон alfa-2b-ийг хэрэглэхдээ жирэмслэхээс хамгаалах найдвартай аргуудыг ашиглах хэрэгтэй.
Шаардлагатай бол саалийн үед хэрэглэхийг цуцлах шийдвэрийг гаргах ёстой хөхөөр хооллох.
- Харилцаа холбоо
Интерферонууд нь урьд өмнө эсвэл түүнтэй зэрэгцүүлэн тогтоосон эмийн нейротоксик, миелотоксик эсвэл кардиотоксик нөлөөг сайжруулж чаддаг.
- Тусгай нөхцөл
Өвчтөнд хэрэглэж болохгүй сэтгэцийн эмгэг түүх. Уушигны өвчний түүхтэй (уушгины архаг бөглөрөлтэй өвчнийг багтаасан), кетоацидозын хандлагатай чихрийн шижинтэй, цусны бүлэгнэлт ихэссэн (тромбофлебит, уушигны эмболизмын түүхтэй) өвчтөнүүдэд болгоомжтой хэрэглэнэ. миелодепрессын хүнд хэлбэрүүд.
Эмчилгээний хугацааг эхлэхээс өмнө системтэйгээр элэгний үйл ажиллагаа, захын цусны бүтэц, цусны биохимийн үзүүлэлтүүд, креатинины хяналтанд байх ёстой. Эмчилгээний хугацаанд биеийн хангалттай чийгшүүлэлтийг хийх шаардлагатай. Архаг гепатит С-тэй өвчтнүүдийн эмчилгээний явцад бамбай булчирхайг өдөөх дааврын түвшинг хянах шаардлагатай.
Архаг гепатит В-ийн үед элэгний синтетик үйл ажиллагааны бууралт дагалддаг (энэ нь альбумины түвшин буурах эсвэл протромбины хугацаа нэмэгдэх зэргээр илэрдэг), хүлээгдэж буй үр ашгийг үнэлж, болзошгүй эрсдэл эмчилгээ. Эмчилгээний хүлээгдэж буй ашиг нь болзошгүй эрсдлээс давсан тохиолдолд хавсарсан psoriasis-ийн хэрэглээ зөвтгөгддөг. Чихрийн шижин эсвэл артерийн гипертензийн хавсарсан үед эмчилгээний өмнө болон эмчилгээний явцад нүдний ёроолд үзлэг хийх шаардлагатай байдаг. Хэрэв зүрхний архаг дутагдал, миокардийн шигдээс ба / эсвэл урьд өмнө эсвэл одоо байгаа хэм алдагдалтай байсан бол интерферон альфа-2б-ийн эмчилгээг эмчийн хатуу хяналтан дор хийх ёстой.
- Тээврийн хэрэгсэл жолоодох, механизм ашиглах чадварт нөлөөлөх
Тээврийн хэрэгсэл жолоодох чадвар, хяналтын механизмд үзүүлэх нөлөө Эмчилгээний эхэн үед та болзошгүй эрсдлээс зайлсхийх хэрэгтэй аюултай зүйлүүд интерферон альфа-2б-ийн үйл ажиллагааг тогтворжуулах хүртэл анхаарал, психомоторын хурдан хариу урвал шаарддаг үйл ажиллагаа.
Тарилгын нунтаг болон тарилгын уусмал хэлбэрийн интерферон alfa-2b нь VED жагсаалтад багтсан болно.
- Тээврийн хэрэгсэл жолоодох, механизм ашиглах чадварт нөлөөлөх
Маягт, найрлага, сав баглаа боодол
Тарилгын тунгалаг, өнгөгүй.
Туслах бодис:
0.5 мл - ампулууд (5) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (1) - цаасан хайрцаг.
0.5 мл - ампулууд (5) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (2) - цаасан хайрцаг.
0.5 мл - шил (1) - картон хайрцаг.
0.5 мл - шил (5) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (1) - картон хайрцаг.
0.5 мл - шилэн тариур (1) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (1) - картон хайрцаг.
0.5 мл - шилэн тариур (1) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (3) - картон хайрцаг.
0.5 мл - шилэн тариур (3) - контур хэлбэртэй эсийн хайрцаг (1) - картон хайрцаг.
0.5 мл - шилэн тариур (3) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (3) - картон хайрцаг.
Тарилгын тунгалаг, өнгөгүй.
Туслах бодис: натрийн ацетат, натрийн хлорид, тетраацетик хүчил этилендиамин, натрийн давс, tween-80, декстран 40, ус d / i.
1 мл - ампулууд (5) - хэлбэржүүлсэн эсийн сав баглаа боодол (1) - картон хайрцаг.
1 мл - ампулууд (5) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (2) - цаасан хайрцаг.
1 мл - шил (1) - картон хайрцаг.
1 мл - шил (5) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (1) - картон хайрцаг.
1 мл - шилэн тариур (1) - хэлбэржүүлсэн эсийн сав баглаа боодол (1) - картон хайрцаг.
1 мл - шилэн тариур (1) - хэлбэржүүлсэн эсийн сав баглаа боодол (3) - картон хайрцаг.
1 мл - шилэн тариур (3) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (1) - картон хайрцаг.
1 мл - шилэн тариур (3) - хэлбэржүүлсэн эсийн хайрцаг (3) - картон хайрцаг.
Клиник ба фармакологийн бүлэг
Интерферон. Antineoplastic, вирусын эсрэг ба дархлаа зохицуулах эмфармакологийн нөлөө
Интерферон. Altevir ® нь вирусын эсрэг, дархлаа дарангуйлах, antiproliferative болон antitumor нөлөөтэй байдаг.
Интерферон альфа-2б нь эсийн гадаргуу дээрх тодорхой рецепторуудтай харилцан үйлчлэлцэж, эсийн доторх өөрчлөлтүүдийн нарийн төвөгтэй гинжийг эхлүүлж, үүнд хэд хэдэн тодорхой цитокин ба ферментийн синтезийг оруулснаар эсийн доторх вирусын РНХ ба вирусын уургийн нийлэгжилтийг алдагдуулдаг. Эдгээр өөрчлөлтүүдийн үр дүн нь эсэд вирусын репликациас урьдчилан сэргийлэх, эсийн үржлийг дарангуйлах, интерфероны дархлаа зохицуулах нөлөөтэй холбоотой өвөрмөц бус вирусын эсрэг ба antiproliferative activity юм. Интерферон альфа-2б нь эсрэгтөрөгчийг иммунокомпетент эсүүдэд үзүүлэх үйл явцыг идэвхжүүлж, макрофагуудын фагоцитик идэвхжлийг идэвхжүүлэх чадвартай ба вирусын эсрэг дархлааг оролцуулдаг Т эсүүд ба "байгалийн алуурчин эсүүд" -ийн цитотоксик идэвхжилийг бий болгодог.
Эсийн, ялангуяа хавдрын эсүүдийн үржихээс сэргийлдэг. Зарим хавдрын нийлэгжилтэнд сэтгэл гутралын нөлөө үзүүлдэг бөгөөд хавдрын өсөлтийг дарангуйлдаг.
Фармакокинетик
Сорох
Интерферон альфа-2b-ийг s / c эсвэл i / m-ийн удирдамжаар хэрэглэвэл биоидэвхид нь 80% -иас 100% хооронд хэлбэлздэг. Интерферон альфа-2б, цусны сийвэн дэх T max-ийг хэрэглэсний дараа 4-12 цаг, T 1/2 - 2-6 цаг байна.Уг хэрэглэснээс хойш 16-24 цагийн дараа цусны ийлдсэнд рекомбинант интерферон илрээгүй болно.
Метаболизм
Метаболизм нь элэг дотор явагддаг.
Альфа интерферонууд нь исэлдэлтийн солилцооны процессыг тасалдуулж, цитохром P450 системийн элэгний микросомын ферментийн идэвхийг бууруулдаг.
Цуцлалт
Энэ нь гломеруляр шүүлтүүрээр голчлон бөөрөөр ялгардаг.
Мансууруулах бодис хэрэглэх заалт
Насанд хүрэгчдэд зориулсан цогц эмчилгээний нэг хэсэг болгон:
- элэгний хатуурлын шинж тэмдэггүй архаг вируст гепатит В;
- шинж тэмдэг илрээгүй тохиолдолд архаг вируст гепатит С-тэй элэгний дутагдал (рибавиринтай моно эмчилгээ эсвэл хавсарсан эмчилгээ);
- залгиурын папилломатоз бүхий;
- бэлэг эрхтэний үрэвсэл;
Үстэй эсийн лейкеми, архаг миелоид лейкеми, Ходжкины бус лимфома, меланома, олон миелома, ДОХ-ын эсрэг Капоши сарком, бөөрний хорт хавдар.
Тунгийн дэглэм
S / c, i / m ба i / v-ийг хэрэглэнэ. Эмчилгээг эмч эхлэх ёстой. Цаашилбал, эмчийн зөвшөөрлөөр өвчтөн өөрөө өөртөө засвар үйлчилгээ хийх тунг тарьж болно (эмийг с / с эсвэл и / м-ээр тогтоосон тохиолдолд)
Архаг гепатит В: Altevir ®-ийг долоо хоногт 3 удаа 16-24 долоо хоногийн турш 5-10 сая IU тунгаар арьсан дор эсвэл булчинд тарина. Эерэг динамик байхгүй тохиолдолд эмчилгээг 3-4 сарын дараа зогсооно (гепатит В вирусын ДНХ-ийн судалгаагаар).
Архаг гепатит С: Altevir ®-ийг долоо хоногт 3 удаа 24-48 долоо хоногийн турш 3 сая ME тунгаар арьсан дор эсвэл булчинд тарина. Өвчний давтан явцтай өвчтөнүүд болон урьд нь интерферон альфа-2b эмчилгээ хийлгээгүй өвчтөнүүдэд эмчилгээний үр дүнг рибавиринтай хавсарсан эмчилгээгээр нэмэгдүүлдэг. Холимог эмчилгээний үргэлжлэх хугацаа нь дор хаяж 24 долоо хоног байна. Арт гепатит С, вирусын генотип 1 вируст ачаалал ихтэй өвчтөнүүдэд альтевир эмчилгээг 48 долоо хоногийн турш хийх бөгөөд эмчилгээний эхний 24 долоо хоногийн эцэс гэхэд гепатит С вирусын РНХ илрээгүй болно.
Залгиурын папилломатоз: Altevir ®-ийг долоо хоногт 3 удаа 3 сая IU / м 2 тунгаар арьсан дор тарина. Хавдрын эдийг мэс заслын аргаар (эсвэл лазераар) авсны дараа эмчилгээ эхэлдэг. Мансууруулах бодисын хүлцэх байдлыг харгалзан тунг сонгоно. Эерэг хариу арга хэмжээ авахын тулд 6 сарын дотор эмчилгээ шаардлагатай болно.
Үстэй эсийн лейкеми: Алтевирийн спленэктомийн дараах эмчилгээ хийлгэсэн өвчтөнүүдэд арьсан дор тарихад хэрэглэх тун нь долоо хоногт 3 удаа 2 сая IU / м 2 байна. Ихэнх тохиолдолд нэг буюу хэд хэдэн гематологийн үзүүлэлтийг хэвийн болгох нь 1-2 сарын эмчилгээний дараа тохиолддог бөгөөд эмчилгээний үргэлжлэх хугацааг 6 сар хүртэл нэмэгдүүлэх боломжтой байдаг. Өвчний хурдацтай явц, мансууруулах бодисын үл тэвчих шинж тэмдэг илрээгүй тохиолдолд энэхүү тунгийн горимыг байнга дагаж мөрдөж байх ёстой.
Архаг миелоид лейкеми: Алтевирыг монотерапийн эмчилгээнд хэрэглэхийг зөвлөсөн тун нь өдөрт 4-5 сая IU / м 2 өдөр бүр с / с байна. Лейкоцитын тоог хадгалахын тулд 0.5-10 сая IU / м 2 тун шаардлагатай байж болно. Хэрэв эмчилгээ нь лейкоцитын тоог хянах боломжийг олгодог бол гематологийн ангижралыг хадгалахын тулд эмийг хамгийн их зөвшөөрөгдсөн тунгаар (өдөрт 4-10 сая IU / м 2) хэрэглэнэ. Хэрэв эмчилгээ нь гематологийн хэсэгчилсэн ангижралт эсвэл лейкоцитын тоог эмнэлзүйн хувьд бууруулахад хүргээгүй бол эмийг 8-12 долоо хоногийн дараа цуцлах хэрэгтэй.
Ходжкины бус лимфома: Altevir ® нь химийн эмчилгээний стандарт дэглэмтэй хослуулан туслах эм болгон ашигладаг. Энэ эмийг долоо хоногт 3 удаа 2-3 сарын турш 5 сая IU / м 2 тунгаар арьсан дор тарина. Мансууруулах бодисын хүлцэх байдлаас хамааран тунг тохируулах шаардлагатай.
Меланома: Altevir ® нь хавдрыг арилгасны дараа насанд хүрэгчдэд дахин давтагдах эрсдэл өндөртэй өвчтөнүүдэд туслах эм болгон ашигладаг. Altevir ® -ийг 4 долоо хоногийн турш долоо хоногт 5 удаа 15 сая IU / m 2 тунгаар судсаар, дараа нь арьсан дор 10 долоо хоногт 3 удаа, 48 долоо хоногт 3 удаа тарина. Мансууруулах бодисын хүлцэх байдлаас хамааран тунг тохируулах шаардлагатай.
Олон миелома: Алтевир ®-ийг долоо хоногт 3 удаа 3 сая IU / м 2 тунгаар тогтвортой уужуугаар эмчилнэ n / a.
ДОХ-той Капошийн саркома: оновчтой тунг тогтоогоогүй байна. Энэ эмийг 10-12 сая IU / m2 / s / c эсвэл i / m тунгаар хэрэглэж болно. Өвчин тогтворжих эсвэл эмчилгээнд хариу өгөх тохиолдолд эмчилгээг хавдрын регресс үүсэх эсвэл эмийг хасах шаардлагатай болтол үргэлжлүүлнэ.
Бөөрний хавдар:оновчтой тун ба горим тогтоогдоогүй байна. Энэ эмийг долоо хоногт 3 удаа 3-аас 10 сая IU / м 2 тунгаар арьсан дор хэрэглэхийг зөвлөж байна.
Судсаар тарих уусмал бэлтгэх
Шаардлагатай тунг бэлтгэхэд шаардагдах Алтевирийн уусмалын хэмжээг цуглуулж, 100 мл 0.9% натрийн хлоридын ариутгасан уусмал дээр нэмээд 20 минутын турш тарина.
Гаж нөлөө
Ерөнхий урвал: маш олон удаа - халуурах, сулрах (тунгаас хамааралтай, эргэж буцах урвалууд, эмчилгээ завсарлага авснаас хойш 72 цагийн дотор алга болдог), жихүүдэс хүрэх; ихэвчлэн сул дорой байдал.
Төв мэдрэлийн системийн талаас: маш олон удаа - толгой өвдөх; бага тохиолддог - астения, нойрмоглох, толгой эргэх, цочромтгой болох, нойргүйдэх, сэтгэлийн хямрал, амиа хорлох бодол, оролдлого; ховор - мэдрэлийн, сэтгэлийн түгшүүр.
Булчингийн тогтолцооноос: маш олон удаа - миалгиа; бага тохиолддог - артралги.
Хоол боловсруулах системээс:маш олон удаа - хоолны дуршил буурах, дотор муухайрах; бага - бөөлжих, гүйлгэх, хуурай ам, амт өөрчлөгдөх; ховор тохиолдолд - хэвлийн өвдөлт, диспепси; элэгний ферментийн идэвхжил сэргэх магадлалтай.
Зүрх судасны тогтолцооны хувьд: ихэвчлэн - цусны даралт буурах; ховор тохиолдолд тахикарди.
Арьсны урвал: цөөн удаа - халцрах, хөлс ихсэх; ховор тохиолдолд арьсны тууралт, арьс загатнах.
Цус үүсгэгч системээс: боломжтой лейкопени, гранулоцитопени, гемоглобины түвшин буурах, тромбоцитопени.
Бусад: ховор тохиолдолд - турах, аутоиммун бамбай булчирхайн үрэвсэл.
Мансууруулах бодис хэрэглэхэд эсрэг заалтууд
- зүрх судасны хүнд өвчний түүх (зүрх судасны хяналтгүй архаг дутагдал, сүүлийн үеийн миокардийн шигдээс, зүрхний хүнд хэлбэрийн хэм алдагдал);
- бөөр ба / эсвэл элэгний хүнд хэлбэрийн дутагдал (үүнд метастазын улмаас үүссэн);
- эпилепси, төв мэдрэлийн тогтолцооны хүнд хэлбэрийн эмгэг, ялангуяа сэтгэлийн хямрал, амиа хорлох бодол, оролдлогоор илэрхийлэгддэг (түүхэнд орно);
- Элэгний элэгний хатууралтай архаг гепатит ба дархлаа дарангуйлагч эмчилгээ хийдэг (саяхан дууссан богино хугацааны курс эмчилгээг эс тооцвол).
- аутоиммун гепатит эсвэл бусад аутоиммун өвчин;
- шилжүүлэн суулгасны дараа дархлаа дарангуйлагч эмчилгээ;
- уламжлалт эмчилгээний аргаар хянах боломжгүй бамбай булчирхайн өвчин;
- уушгины декомпенсацийн өвчин (үүнд COPD орно);
- декомпенсацитай чихрийн шижин;
- гиперкоагуляци (тромбофлебит, уушигны эмболизм орно);
- хүнд хэлбэрийн миелодепрессия;
- жирэмслэлт;
- саалийн хугацаа (хөхүүлэх);
- эмийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдэд хэт мэдрэг байдал.
Жирэмсэн ба хөхүүл үед мансууруулах бодис хэрэглэх
Жирэмсэн ба хөхүүл (хөхүүлэх) үед эмийг хэрэглэхийг хориглоно.
Элэгний үйл ажиллагааг зөрчсөн өргөдөл
Бөөрний үйл ажиллагааны алдагдалд зориулсан өргөдөл
Энэ эм нь бөөр ба / эсвэл элэгний дутагдлын үед эсрэг заалттай байдаг (үүнд метастаз байгаагаас үүдэлтэй).
тусгай заавар
Алтевиртэй вируст гепатит В, С архаг үрэвслийг эмчлэхийн өмнө элэгний гэмтлийн түвшинг үнэлэхийн тулд элэгний биопси хийхийг зөвлөж байна (идэвхтэй үрэвслийн процесс ба / эсвэл фиброзын шинж тэмдэг). Архаг гепатит С-ийн эмчилгээний үр дүн Алтевир ба рибавиринтай хавсарсан эмчилгээ хийснээр нэмэгддэг. Алтевирийг хэрэглэх нь декомпенсацитай элэгний хатуурал эсвэл элэгний комын хөгжилд үр дүнгүй байдаг.
Алтевирийн эмчилгээнд гаж нөлөө илэрвэл эмийн тунг 50% -иар бууруулах буюу алга болтол эмийг түр цуцлах хэрэгтэй. Хэрвээ сөрөг нөлөө тунг бууруулсны дараа үргэлжлүүлэн эсвэл дахин гарч ирэх эсвэл өвчний явц ажиглагдаж байвал Алтевирийн эмчилгээг зогсоох хэрэгтэй.
Хэрэв ялтасын тоо 50х10 9 / л-ээс доош буюу гранулоцитын хэмжээ 0.75x10 9 / л-ээс доош байвал 1 долоо хоногийн дараа цусны шинжилгээгээр Алтевирийн тунг 2 дахин бууруулахыг зөвлөж байна. Хэрэв эдгээр өөрчлөлтүүд хэвээр байвал эмийг цуцлах хэрэгтэй.
Хэрэв ялтасын тоо 25х10 9 / л-ээс доош буюу гранулоцитын хэмжээ 0.5х10 9 / л-ээс доош байвал 1 долоо хоногийн дараа Алтевир ® -ийг цусны шинжилгээний хяналтаар зогсоохыг зөвлөж байна.
Интерферон альфа-2б бэлдмэлийг хүлээн авч буй өвчтөнүүдэд вирусын эсрэг үйл ажиллагааг саармагжуулдаг эсрэгбиеийг цусны ийлдсэнд илрүүлж болно. Бараг бүх тохиолдолд эсрэгбиеийн титр нь бага байдаг тул гадаад төрх нь эмчилгээний үр дүн буурах эсвэл бусад аутоиммун эмгэг үүсгэдэггүй.
Хэт их тун
Хэт их тунгаар хэрэглэдэг Altevir ®-ийн талаар мэдээлэл өгөөгүй болно.
Эмийн харилцан үйлчлэл
Алтевир ба бусад эмийн хоорондын харилцан үйлчлэлийг бүрэн судлаагүй байна. Алтевирийг нойрны эмтэй нэгэн зэрэг болгоомжтой хэрэглэх хэрэгтэй тайвшруулах эм, мансууруулах бодисын өвдөлт намдаах эм, миелодепрессант нөлөөтэй эмүүд.
Алтевир ба теофиллиныг нэгэн зэрэг томилсны дараа цусны ийлдсэн дэх концентрацийг хянаж, шаардлагатай бол тунгийн горимыг өөрчлөх шаардлагатай.
Алтевирийг хими эмчилгээний эмтэй (цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, тенипозид) хослуулан хэрэглэхэд хорт нөлөөнд өртөх эрсдэл нэмэгддэг.
Эмийн сангаас олгох хугацаа
Энэ эмийг жороор авах боломжтой.
Хадгалах нөхцөл ба хугацаа
Мансууруулах бодисыг SP 3.3.2-1248-03 стандартын дагуу 2 ° -аас 8 ° C-ийн температурт хүүхдэд хүрч чадахгүй газарт хадгална. хөлдөхгүй байх. Хадгалах хугацаа 18 сар байна.
2 ° -аас 8 ° С-ийн температурт тээвэрлэх; хөлдөхгүй байх.
"Энэхүү бүтээл нь генетикийн инженерчлэл, биотехнологи, анагаах ухаан, эм зүйтэй холбоотой юм. Хүний лейкоцитийн альфа-2б интерфероны синтезийг кодчилсон шинэ рекомбинант мультикоплазмын ДНХ pSX50, түүний илэрхийлэл нь лактоз ба триптофан промотор ба транскрипцийн терминаторын хяналтанд байдаг. Хүлээн авагч E. coli BL21 омгийн эсийг рекомбинант плазмидын pSX50 плазмидтай хувиргасны үр дүнд E. coli SX50 омгийг олж авав. 1 литрийн тэжээлээс 0.9-1.0 г хүртэл альфа-2б интерфероны бүтээмж бүхий хүний \u200b\u200bлейкоцитын альфа-2б интерферон үйлдвэрлэгч. Рекомбинант альфа-2б интерферон үйлдвэрлэх арга нь E. coli SX50-ийн үүсгэсэн рекомбинантын омгийг ашиглахад үндэслэсэн бөгөөд биосинтезийн явцад тэжээлийн субстратыг тасралтгүй нэмж, триптофаны агууламж багатай тэжээлийн орчинд гүнзгий бясалгах, өндөр даралттай үед бичил биетний эсийг механик аргаар устгах, нэгтгэсэн уургийн уусмал. гуанидин гидрохлоридын концентрацитай уусмал, дараа нь хаотропик бодис агуулсан физиологийн буферын уусмал дахь интерфероныг ренатуржуулж, Cu + 2 ионоор хөдөлгөөнгүйжүүлсэн Chelating Sepharose Fast Flow гэх мэт давирхайнууд дээр интерфероныг гурван үе шаттай хроматографийн аргаар цэвэршүүлж, CM Flow, Seph зэрэг ион солилцооны давирхайнууд дээр ион солилцооны хроматографи. Супердекс 75 төрлийн давирхай дээрх шүүх хроматографи.Энэ арга нь электрофорезын өгөгдлийн дагуу 99% -иас дээш цэвэршилттэй интерферон бодисыг бууруулж бууруулдаггүй нөхцөлд авах боломжийг олгодог. 1 литр тэжээлийн орчиноос дор хаяж 400-800 мг-ийн хэмжээгээр RF-ийн HPLC ба пироген агуулаагүй (LAL тест) -ийн дагуу гельийг мөнгөлөг ба 98% -иас дээш будгаар будах. 3 n. ба 3 s.p f-ly, 6 өвчтэй.
RF-ийн патентын зураг 2242516
Шинэ бүтээл нь генетикийн инженерчлэлтэй холбоотой эм, биотехнологийн аргаар олж авсан, тухайлбал, эмчилгээний зорилгоор хүний \u200b\u200bрекомбинант лейкоцитийн интерферон альфа-2b-ийг үйлдвэрлэлийн аргаар (цаашид интерферон гэх), мөн Escherichia coli (E. coli) болон интерфероны синтезийг кодчилдог ДНХ-ийн плазмид үүсгэдэг.
Интерферонууд нь вирусын халдвар эсвэл бусад эмгэг төрүүлэгчдөд хариу үйлдэл үзүүлэх замаар эсүүдээс гаргаж, ялгаруулдаг молекул жин нь 15000-2000 дальтоны уургийн молекулууд юм. Альфа, бета, гамма гэсэн гурван үндсэн интерферон бүлэг байдаг. Эдгээр бүлгүүд нь нэг төрлийн биш бөгөөд хэд хэдэн өөр интерфероны молекулын зүйлийг агуулж болно. Тиймээс интерферон альфагийн 14 гаруй генетик сортыг тогтоосон бөгөөд энэ нь вирусын эсрэг, дэлгэрүүлэхийн эсрэг, дархлаа дарангуйлагч бодис болгон анагаах ухаанд өргөнөөр ашигладаг.
Хүний лейкоцитийн интерфероныг лейкоцитээс гаргаж авах талаар мэддэг арга цус хандивласан вирус ба бусад индуктороор өдөөгдсөн хүн (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
Интерферон үйлдвэрлэх эдгээр аргын гол сул тал бол эцсийн бүтээгдэхүүнийг хүний \u200b\u200bвирус, тухайлбал гепатит В, С вирус, дархлал хомсдолын вирус гэх мэт вирусаар бохирдуулах магадлал юм.
Өнөө үед микробиологийн синтезээр интерферон авах аргыг илүү ирээдүйтэй гэж хүлээн зөвшөөрсөн бөгөөд энэ нь харьцангуй хямд үнэтэй түүхий эдээс харьцангуй өндөр ургац бүхий зорилтот бүтээгдэхүүнийг авах боломжийг олгодог. Энэ тохиолдолд ашигласан хандлагууд нь бүтцийн генийн бактерийн экспрессэд оновчтой хувилбарууд, түүнчлэн түүний илэрхийлэлийг хянах зохицуулагч элементүүдийг бий болгох боломжийг олгодог.
Pichia pastoris, Pseudomonas putida, Escherichia coli омгуудын янз бүрийн бүтцийг бичил биетэн болгон ашиглаж байна.
P. pastoris-ийг интерферон үйлдвэрлэгч болгон ашиглахын сул тал (JN Garcia, JA Aguiar et al. // Pichia pastoris дахь хүний \u200b\u200bIFN-2b-ийн өндөр түвшний илэрхийлэл .// Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995), нь энэ төрлийн мөөгөнцрийн исгэх маш хэцүү нөхцөл бөгөөд биосинтезийн явцад индуктор, ялангуяа метанолын концентрацийг чанд хадгалах шаардлагатай байдаг. Ps ашиглахын сул тал. путида (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) нь экспрессацийн доод түвшинд исгэх процессын нарийн төвөгтэй байдал юм (1 литр тэжээлийн орчинд 10 мг интерферон). Escherichia coli-ийн омгийг ашиглах нь илүү үр дүнтэй байдаг (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 нэмэлт 9): S9-41-S9-51).
Интерфероныг илэрхийлэх олон тооны плазмид ба E. coli омгийг мэддэг: E. coli ATCC 31633 ба 31644 плазмидуудтай Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 эсвэл Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli омог pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli омог pINF-F-Pa (AU 1312962), p280 / 21FN плазмидтай E. coli SG 20050 омог (Кравченко В.В.) et al. Биорганик хими, 1987, 13-р хуудас, № 9, хуудас 1186-1193), pINF14 плазмидтай E. coli SG 20050 омог (SU 1703691), pINF16 плазмидтай E. coli SG 20050 омог (RU 2054041) ба бусад.Эдгээр омгийг ашиглахад суурилсан технологийн сул тал нь тогтворгүй байдал, түүнчлэн интерфероны илэрхийлэл хангалтгүй байдаг.
Ашигласан омгийн шинж чанаруудын хамт процессын үр ашиг нь интерфероныг тусгаарлах, цэвэршүүлэх технологиос ихээхэн хамаардаг.
Интерферон үйлдвэрлэх, үүнд Ps эсийг тариалах арга. путида, биомасс устгах, полиэтилениминээр эмчлэх, аммонийн сульфаттай фракцичлах, фенилсилохром С-80 дээр гидрофобын хроматографи, лизатыг рН фракцлах, түүний концентраци ба диафильтраци, целлюлозын DE-52 дээрх ион солилцооны хроматографи, рН градиент дахь элюци, ион солилцооны элюус -52, Sephadex G-100 (SU 1640996) дээрх шүүлтүүр кассет болон гель шүүлтүүрээр дамжин өнгөрөх концентраци. Энэ аргын сул тал нь олон үе шаттай исгэхээс гадна эцсийн бүтээгдэхүүнийг олж авах олон үе шаттай үйл явц юм.
Интерферон үйлдвэрлэх арга, түүний дотор E. coli-ийн омог SG 20050 / pIF16-ийг LB-ийн шөлөнд термостаттай чичиргээн дэх колбонд тариалах, биомассыг центрифугалах, буфер уусмалаар угааж, эсийг устгахад зориулагдсан Sonication арга юм. Үүссэн лизатыг центрифугалж, буфер дахь 3М карбамидын уусмалаар угааж, буан дахь гуанидин хлоридын уусмалд уусгаж, sonication, центрифужсэн, исэлдүүлэгч сульфитолиз, 8 М мочевины эсрэг диализ, ренатураци ба CM-52 целлюлоз ба Сефадекийн эцсийн хоёр үе шаттай хроматографи. RU 2054041). Энэ аргын сул талууд нь тусгаарлах, цэвэршүүлэх процессын үндсэн үе шатанд харьцангуй бага бүтээмжтэй байдаг. Ялангуяа энэ нь бүтээгдэхүүний хэт авианы эмчилгээ, диализ ба исэлдэлтийн сульфитолизд хамаатай бөгөөд ингэснээр интерфероны ургацын тогтворгүй байдал, мөн интерфероныг үйлдвэрлэлийн аргаар ашиглах боломжгүй юм.
Хамгийн ойр аналоги (прототип) байдлаар хүний \u200b\u200bлейкоцитийн интерферон үйлдвэрлэх аргыг зааж өгч болно.Энэ нь E. coli-ийн рекомбинант омгийг өсгөх, үүссэн биомассыг -70 ° C-аас ихгүй температурт хөлдөөх, гэсгээх, бичил биетний эсийг лизоцимоор устгах, ДНХ ба РНХ-ийг нэвтрүүлэх замаар орно. DNase-ийн лизат руу орж, тусгаарлагдсан уусдаггүй хэлбэрийн интерфероныг угаалгын нунтаг бүхий буферийн уусмалаар угааж, интерфероны тунадасыг гуанидин гидрохлоридын уусмалд уусган, ренатураци болон ион солилцооны хроматографийн аргаар нэг үе шаттай цэвэршүүлнэ. Үйлдвэрлэгчийн хувьд E. coli-ийн омгийг SS5 ашигладаг бөгөөд P lac, P t7 ба P trp гэсэн гурван промотор агуулсан рекомбинант pSS5 плазмид ба нуклеотид орлуулалттай интерферон альфа генийг ашигладаг.
Энэхүү плазмидыг агуулсан E. coli-ийн омог болох SS5-ийн интерфероны илэрхийлэлийг P прак, P t7 ба P trp гэсэн 3 промотор хянана. Интерфероны экспортын түвшин нь 1 литр эсийн суспенз тутамд 800 мг орчим байдаг (RU 2165455).
Энэ аргын сул тал нь эсийн ферментийн устгал, бичил биетний ДНХ, РНХ-ийг ашиглах, интерфероныг нэг үе шаттай хроматографийн аргаар цэвэрлэхэд ашиглах чадвар багатай юм. Энэ нь интерферон ялгаруулах процессын тогтворгүй байдлыг бий болгож, чанар нь буурахад хүргэж, интерфероныг үйлдвэрлэлийн аргаар ашиглахад дээрх схемийг ашиглах боломжийг хязгаарлаж байна. Энэ плазмидын сул талууд ба түүнд суурилсан омог нь Т7 РНХ полимеразын ген нь лак оперон промоторын дор байрладаг бөгөөд үргэлж "урсдаг" E. coli BL21 (DE3) омгийн Т7 фазын хүчтэй зохицуулагч бус плазмидад ашиглагддаг. Үүний үр дүнд интерфероны синтез нь эсэд тасралтгүй явагддаг бөгөөд энэ нь плазмидыг задалж, омгийн эсүүдийн амьдрах чадварыг бууруулж, улмаар интерфероны ургац буурдаг.
Энэхүү шинэ бүтээлийн зорилго нь интерфероны биосинтезийн өндөр түвшинг агуулсан шинэ рекомбинант плазмидын ДНХ ашиглан рекомбинант аж үйлдвэрийн E. coli үйлдвэрлэгч омгийг бий болгох, интерферон альфа-2б бодисын чанарын хувьд "Европын фармакопея" -д тохирсон эмчилгээний зориулалттай интерферон бодис үйлдвэрлэх үр дүнтэй үйлдвэрлэлийн технологийг боловсруулах явдал юм.
Энэхүү даалгаврыг Холбооны улсын нэгдсэн үйлдвэр GosNII Genetics, VKPM B-8550 дугаартай Бүх Оросын үйлдвэрлэлийн омгуудад хадгалсан рекомбинант ДНХ-ийн pSX50 ба Escherichia coli SX50 омгийг үүсгэх замаар шийдвэрлэв.
e. coli SX50 рекомбинант омгийг ашиглахад үндэслэсэн рекомбинант альфа-2б интерферон үйлдвэрлэх арга бөгөөд биосинтезийн явцад тэжээлийн субстратыг тасралтгүй нэмж, триптофаны агууламж багатай тэжээлийн орчинд гүн тариалах, өндөр даралтанд бичил биетний эсийг механик аргаар устгах, нэгтгэх. концентрацитай гуанидин гидрохлоридын уусмал дахь уураг, дараа нь хаотропик бодис агуулсан физиологийн буферын уусмал дахь интерфероны ренатураци ба Cu + 2 ионоор хөдөлгөөнгүйжүүлсэн Селхарозын хурдан урсгалын төрлийн давирхай дээрх интерфероныг гурван үе шаттай хроматографийн цэвэршүүлэлт, мөн CMhar гель төрлийн давирхай дээр ион солилцооны хроматографи. Superdex 75 давирхай дээрх хроматографи.
Шинэ бүтээлийн дагуу хүний \u200b\u200bлейкоцитийн альфа-2б интерфероны синтезийг кодчилсон шинэ рекомбинант мультикоплазмтай ДНХ-ийн pSX50 хангагдсан бөгөөд түүний илэрхийлэл нь лактоз ба триптофан промотор ба транскрипцийн төгсгөгчийн хяналтанд байдаг. Плазмид pSX50 нь 3218 суурь хос (bp) бөгөөд дараахь хэсгүүдээр тодорхойлогддог.
1 нуклеотидээс 176 нуклеотид (nt) хүртэлх дараалалд триптофан промотор (P trp) агуулсан 176 bp ДНХ-ийн хэсэг орно;
177 n-ээс дараалал. 194 Н хүртэл. Орчуулгын ажлыг эхлүүлэх үүрэг бүхий Шин Делгарно дарааллыг агуулсан 18 морины хүчтэй ДНХ-ийн синтетик фрагмент орно;
МЭ 195 оноос хойш залгамж халаа 695 N хүртэл. дараахь нуклеотидын орлуулалттай интерферон генийн дарааллыг агуулсан 501 bp-ийн ДНХ-ийн хэсгийг агуулна: 37 байрлалд А-аас С, 39-р байр, G-ээс Т, 40-р байрлал, А-аас С, 42-р байр, G-ээс T , 67 байрлалд A-г C-ээр, 69-р байранд G-г T, 70-р байрыг A-г C, 72-р байрыг A-г T, 96-р байрыг G-г A, 100-р байрыг A, C, c-ээр солих 102 байрлалд А-г T, 114 байрлалд A, C, 120 байрлалд C, G, 126 байршилд G, A, 129 байрлалд G, A, 330 байрлалд C, G, 339 байрлалд G-г А-р, 342-р байрлалд G-г A, 487-р байрлал дахь A-г C, 489-р байрыг A-р T-р, 495-р байрлал дахь G-г A-р солих;
Дараалал 696 н. 713 N хүртэл. синтетик полинлинкер агуулсан 18 морины хүчтэй синтетик ДНХ-ийн хэсэг орно;
Дараалал 714 н. МЭ 1138 он хүртэл 4129 нт бүхий pKK223-3 плазмидын ДНХ-ийн хэсэг орно. 4553 N хүртэл. 425 bp хэмжээтэй, транскрипцийн хатуу төгсгөлийн дарааллыг агуулсан rrnBT 1 T 2;
МЭ 1139 оноос хойшхи дараалал МЭ 1229 он хүртэл 2487 нт бүхий pUC19 плазмидын ДНХ-ийн хэсэг орно. 2577 н хүртэл. b-лактомаза генийг сурталчлагч агуулсан 91 bp хэмжээтэй (ампициллиний генийн эсэргүүцэл - Amp R);
МЭ 1230 оноос хойшхи дараалал 2045 он хүртэл. 720 nt бүхий pUC4K плазмидын ДНХ-ийн хэсэг орно. МЭ 1535 он хүртэл кан генийн бүтцийн мужийг агуулсан 816 bp хэмжээтэй;
МЭ 2046 оноос хойшхи дараалал 3218 н хүртэл. 1625-аас 453 нт-ийн хоорондох pUC19 плазмидын ДНХ-ийн хэсэг орно. 1173 bp хэмжээтэй, плазмид (ori) ба лак промотор (P lac) -ийг хуулбарлах үүрэгтэй дарааллыг агуулна.
Зураг 1-5-д pSX50 плазмидын барилгын схем ба физик газрын зургийг харуулав.
Зураг 6-т плазмид pSX50-ийн нуклеотидын бүрэн дарааллыг харуулав.
Escherichia coli SX50 омгийг уламжлалт генетикийн инженерийн технологийг ашиглан Escherichia coli BL21 эсийг pSX50 плазмидаар хөрвүүлэх замаар олж авсан. E. Coli SX50 омог нь дараах шинж чанаруудаар тодорхойлогддог.
Соёлын болон морфологийн шинж чанарууд
Эсүүд нь жижиг, шулуун, өтгөрүүлсэн саваа хэлбэртэй, грам сөрөг, спорт биш юм. Энгийн тэжээллэг орчинд эсүүд сайн ургадаг. Difco агар дээр ургахад дугуй, гөлгөр, гүдгэр, үүлэрхэг, гялалзсан, гөлгөр ирмэг бүхий саарал колони үүсдэг. Шингэн орчинд (глюкоз агуулсан хамгийн бага орчинд эсвэл LB-шөлөөр) ургахдаа тэдгээр нь бүрхэг манан үүсгэдэг.
Физик-биологийн шинж тэмдгүүд
Аэробе. Өсөлтийн температурын хэмжээ 4-42 ° C, хамгийн тохиромжтой рН 6.5-7.5 байна.
Аммонийн ба нитратын найрлага дахь эрдэс давс, амин хүчил, пептон, триптон, мөөгөнцрийн ханд гэх мэт органик нэгдлүүдийг хоёуланг нь азотын эх үүсвэр болгон ашигладаг.
Амин хүчил, глицерин, нүүрс усыг нүүрстөрөгчийн эх үүсвэр болгон ашигладаг. Антибиотикт тэсвэртэй. Эсүүд нь канамициний эсэргүүцлийг (100 мкг / мл хүртэл) харуулдаг.
Escherichia coli 8X50 омог нь интерферон үйлдвэрлэгч юм.
Омог хадгалах орчны арга, нөхцөл, найрлага
Газрын тосны дор 20 мкг / мл концентрацитай канамицин нэмсэн L-арапед, 15% глицерин ба түүнд тохирох антибиотик агуулсан L-шөлөнд хасах 70С-ийн температурт ампулыг, 4% -аас дээш температурт ампул дахь лиофилизацитай байдалд.
Escherichia coli SX50 омгийг Bergi's Guide (1974) -т Escherichia coli зүйлийн омог гэж тодорхойлсон байдаг.
Альфа-2б интерфероныг үйлдвэрлэлийн аргаар үйлдвэрлэх арга
Санал болгож буй аргын онцлог нь интерфероныг исгэх явцад хуримтлагддаг уусдаггүй хэлбэрээс тусгаарлах боломжийг олгодог технологийг хөгжүүлэх явдал бөгөөд ингэснээр тусгаарлах процессын технологийн схемийг ихээхэн хялбарчилж, зорилтот бүтээгдэхүүний гарцыг нэмэгдүүлэх боломжийг олгодог.
Энэхүү арга нь биосинтезийн явцад шим тэжээлийн субстрат, илүү зохимжтой глюкоз ба мөөгөнцрийн хандыг тогтмол нэмж, Escherichia coli SX50 омгийг өсгөвөрлөх, триптофаны агууламж буурч, 700-900 бар өндөр даралтанд бичил биетний эсийг механик аргаар устгах, интерфероныг уусгах зэргээс бүрдэнэ. гуанидин гидрохлоридын уусмал, фатриологийн буфер уусмал дахь интерфероны ренатураци, хаотропик бодисын оролцоотой, дараа нь Cu +2 ионоор хөдөлгөөнгүйжүүлсэн Хелатин Сепарарозын хурдан урсгалын давирхай дээрх интерфероныг гурван үе шаттай хроматографийн аргаар цэвэршүүлэх, СМ гель Сефарозын урсгалын ион солилцооны давирхай дээр ион солилцооны хроматографи Superdex 75 гэх мэт давирхай.
Интерферон авах үе шатуудын оновчтой нөхцөл нь дараах байдалтай байна.
Исгэлтийг бүх процессын туршид субстратыг тасралтгүй нэмж хийдэг өндөр түвшин интерфероны илэрхийлэл;
Эсийг устгах ажлыг Гаулин төрлийн задлагч төхөөрөмжид 900 бар даралттай хийдэг;
Уусдаг эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг (ДНХ, РНХ, уураг, липополисахарид гэх мэт) зайлуулах ажлыг уусдаггүй интерферон хэлбэрийг угаалгын нунтаг агуулсан буфер уусмалаар (Triton XI00, мочевин гэх мэт) угаах замаар гүйцэтгэдэг;
Интерферон агуулсан тунадасыг 6М гуанидин гидрохлоридын буфер уусмалаар уусгасан;
Интерфероныг сэргээн засварлах ажлыг хаотропик бодис агуулсан физиологийн буфер уусмалаар хийдэг;
Интерфероныг гурван үе шаттай хроматографийн цэвэршүүлэлтийг Cu +2 ионоор хөдөлгөөнгүйжүүлсэн Chelating Sepharose Fast Flow, CM Sepharose Fast Flow катионы солилцооны давирхай, Superdex 75 төрлийн давирхай дээр гель шүүх хроматографи дээр хийдэг;
Хроматографийн цэвэршүүлэлт бүрийн дараа ариутгалын шүүлтүүрийг 0.22 мкм нүх сүв бүхий пирогенгүй шүүлтүүрээр дамжуулан хийдэг.
Тодорхойлсон аргыг хэрэглэсний үр дүнд интерфероны гарц нь ойролцоогоор 1 литр тэжээлийн орчноос 400-800 мг интерферон байна. Үүссэн бүтээгдэхүүний чанар нь альфа-2б интерферон бодисын "Европын фармакопея" стандартын шаардлагад нийцдэг.
Санал болгож буй арга ба эх загвар хоорондын ялгаа нь дараахь зүйлүүд юм.
Биосинтезийн үед 1 литр тэжээлийн орчиноос илүү их хэмжээний интерферон авах боломжтой болгодог омог бүтцийг өндөр бүтээмжтэй ашиглах;
Интерфероны уусдаггүй хэлбэрийн илүү цэвэр хандыг богино хугацаанд бага алдагдалтайгаар олж авах боломжийг олгодог эсийн биомассыг үр дүнтэй механик аргаар устгах;
Хаотропик бодис агуулсан ренатуризацийн үед физиологийн буферийн уусмалыг ашиглах нь зөв ренатирован хэлбэрийн интерфероны ургацыг нэмэгдүүлдэг;
Гурван үе шаттай интерфероныг хроматографийн аргаар цэвэршүүлснээр RF HPLC-ийн дагуу гельийг мөнгөөр, 98% -иас дээш өнгөөр \u200b\u200bбудаж, багасгаж, бууруулдаггүй нөхцөлд электрофорезын дагуу 99% -иас дээш цэвэршилттэй интерферон бодисыг олж авах боломжтой байдаг (LAL тест).
Нэхэмжлэлийн бүлгүүдийн мөн чанар, давуу талыг дараахь жишээнүүдээр харуулав.
Жишээ 1. pSX50 рекомбинант плазмидыг барих
PSX50 плазмидыг барих арга нь дараахь алхамуудыг агуулна.
PSX10 вектор плазмидыг барих;
1. pSX3 плазмидыг барих (2641 bp)
2. вектор плазмидыг бүтээх pSX10 (2553 bp)
PSX41 (3218 bp) рекомбинант плазмидыг барих;
PSX43 (3218 bp) рекомбинант плазмидыг барих;
PSX45 рекомбинант плазмидыг барих (3218 bp);
PSX50 рекомбинант плазмидыг барих (3218 морины хүчтэй).
PSX10 вектор плазмидыг бүтээх
PSX10 вектор плазмид нь pUC19 вектор бөгөөд ампициллиний эсэргүүцлийг өгдөг бета-лактомазын генийн кодчиллын дарааллыг кан генийн кодчиллын дарааллаар орлуулж pKK223-3 плазмидын транскрипцийн төгсгөлийг агуулдаг.
PSS10 вектор плазмидыг барих ажлыг хоёр үе шаттайгаар гүйцэтгэнэ.
Amp генийн кодлох мужийг кан генийн кодлох мужаар орлуулдаг pUC19 плазмид болох pSX3 (2641 bp) плазмидыг авах;
BamHI талбайн ард транскрипц терминатор rBT 1 T 2-ийг кодчилсон ДНХ-ийн фрагментийг оруулсан pSX3 плазмид болох pSX10 (255 bp) салхины плазмидыг бэлтгэх.
Плазмид pSX3-ийг авахын тулд ПГУ-аар ДНХ-ийн таван удаагийн олшруулалтыг (полимеразын гинжин урвал) хийдэг. Эхний шатанд pUC19 плазмидын ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж 1828 bp хэмжээтэй ДНХ-ийн фрагментийг олшруулав. (фрагмент PU1-PU2) ашиглан праймерыг ашиглана уу:
Энэ болон дараагийн ПГУ-ын урвалуудыг дараахь нөхцөлд явуулна: 20 мМ Tis-HCl, pH 8.8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl 2, 0.1% Triton X100, 0.1 мг / мл BSA, 0.2 dNTP тус бүрийн mM, 1.25 нэгж. Pfu ДНХ полимераза, 100 нг ДНХ. Өсөн нэмэгдэж буй процесс нь дараахь үе шатуудаас бүрдэнэ: 95 0С-т 5 минут халааж, 35 ПГУ-ын цикл (30 сек 95 ° С, 30 сек 56 ° С, 2 мин 72 ° С), 10 минутын турш 72 0 С-т өсгөвөрлөнө. Үржүүлсний дараа (мөн дараа нь олшруулсны дараа) ДНХ-ийн хэлтэрхийг электрофорезоор 1% агарозын гельээр цэвэрлэнэ. Хоёр ба гурав дахь ээлжийн үеэр pUC4K плазмидын ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж, 555 б.к.-ийн ДНХ-ийн фрагментийг олшруулж байна. (фрагмент KM1-KM2) ашиглан праймерыг ашиглана уу.
258 морины хүчтэй ДНХ-ийн хэсгийг олшруулах. (KMZ-KM4) праймеруудтай
ПГУ-ын тав дахь шатанд (PU1-PU2) ба (KM1-KM4) хэсгүүдийг дараахь нөхцлөөр нэгтгэнэ: 95 0С-т 5 минут халааж, 5 ПГУ-ын цикл (30 сек 95 ° С, 30 сек 56 ° С, 10 мин 72 °) C) ба 72 минутын турш 10 минутын турш инкубаци хийх. Сүүлийн ПГУ-ын дараа олж авсан ДНХ-г шууд E. coli DH5 омгийн эс болгон хувиргаж, 20 мкг / мл канамицин агуулсан LA орчинд бүрхэв. 12 цагийн турш 37 ° С-т өсгөвөрлөсний дараа клонуудыг шигшиж, плазмидын ДНХ-г тусгаарлаж, хязгаарлалтын шинжилгээ хийнэ. Үүний үр дүнд 2641 bp хэмжээтэй pSX3 плазмидыг олж авна.
Вектор плазмид pSX10-ийг авахын тулд ПГУ-аар ДНХ-ийн гурван үеийг олшруулдаг. Эхний шатанд pSX3 плазмидын ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж 2025 морины хүчтэй ДНХ-ийн фрагментийг олшруулав. (фрагмент 10.1-10.2) праймер ашиглан:
Хоёрдахь шатанд pKK223-3 плазмидын ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж 528 bp хэмжээтэй ДНХ-ийн хэлтэрхий олшруулалтыг хийж гүйцэтгэв. (фрагмент KK1-KK2) праймер ашиглан:
ПГУ-ын гурав дахь шатанд (10.1-10.2) ба (KK1-KK2) хэсгүүдийг дараахь нөхцөлд нэгтгэнэ: 95 0С-т халааж 5 минут, ПГУ-ын 5 цикл (30 сек 95 ° С, 30 сек 56 ° С, 10 мин 72 °) C) ба 72 минутын турш 10 минутын турш инкубаци хийх. Сүүлийн ПГУ-ын дараа олж авсан ДНХ-г шууд E. coli DH5 омгийн эс болгон хувиргаж, 20 мкг / мл канамицин агуулсан LA орчинд бүрхэв. 12 цагийн турш 37 ° С-т өсгөвөрлөсний дараа клонуудыг шигшиж, плазмидын ДНХ-г тусгаарлаж, хязгаарлалтын шинжилгээ хийнэ. Үүний үр дүнд 2553 морины хүчтэй pSX10 плазмидыг олж авна.
PSX41 рекомбинант плазмидыг барих
Рокомбинант плазмид pSX41 бол вектор плазмидийн pSX3 (2529 bp) -ийн Hind III - BamHI ДНХ-ийн хэсэг, Hind III - EcoRI 168 bp хэмжээтэй E. coli триптофан опероны промотор (P trp), EcoRI-XbaI-ийг кодчилсон ДНХ-ийн хэсэг юм. SD цуврал (Shine-Delgarno) -ийг кодчилдог 20 bp-ийн синтетик ДНХ хэсэг ба хүний \u200b\u200bинтерферон альфа 2b генийг кодчилдог XbaI-BamHI 501 bp ДНХ-ийн хэсэг.
Hind III - BamHI, вектор плазмидын ДНХ-ийн хэлтэрхий pSX3 (2529 bp) -ийг авахын тулд pSX3 плазмидын ДНХ-ийг хязгаарлах ферментүүд HindIII ба BamHI-ээр эмчилж, дараа нь 1% агарозын гель дотор электрофоретик аргаар цэвэрлэнэ. Триптофан опероны промоторыг (P trp) кодчилсон Hind III EcoRI ДНХ-ийн фрагментийг нийт E. coli ДНХ-ийг загвар болгон, TRP1 ба PRP2 праймеруудыг ашиглан ПГУ-аар олж авсан бөгөөд дараа нь хязгаарлагдмал ферментүүд болох Hindlll ба EcoRI-ээр олшруулсан фрагментийг боловсруулав.
EcoRI-Xbal-ийн SD дарааллыг (Shine-Delgarno) кодчилсон 20 bp ДНХ-ийн синтетик хэсгийг авахын тулд дараахь нэмэлт oligonucleotides-ийг нэгтгэнэ.
Хүний интерферон альфа 2б генийг кодчилсон 501 bp XbaI-BamIII ДНХ-ийн фрагментийг хүний \u200b\u200bнийт ДНХ-ийг загвар болгон, IFN1, IFN2 праймеруудыг ашиглан ПГУ-аар олж авдаг бөгөөд дараа нь Xbal ба BamIII хязгаарлах ферментүүдээр олшруулсан фрагментийг эмчилдэг.
Дараа нь электрофоретик аргаар цэвэршүүлсэн хэсгүүдийг нэгтгэж, T4 phage ligase ферменттэй холбож, ДНХ-ийг E. coli DH5 омгийн эс болгон хувиргаж, 20 мкг / мл канамицин агуулсан ЛА орчинд тарина. 12 цагийн турш 37 ° С-т өсгөвөрлөсний дараа клонуудыг шигшиж, плазмидын ДНХ-г тусгаарлаж, хязгаарлалтын шинжилгээ хийж, ДНХ-ийн анхдагч бүтцийг тодорхойлно. Үүний үр дүнд 3218 морины хүчтэй pSX41 плазмидыг олж авна. Дараа нь зорилтот бүтээгдэхүүний экспресс түвшинг нэмэгдүүлэхийн тулд интерферон генийн үе шаттай мутагенез явагдана. Интерфероны генийн мутагенез нь E. coli-д ховор тохиолддог гурвалсан эмийг харгалзах амин хүчлийг кодчилох, мөн ижил амин хүчлийг кодлох E. coli-д ихэвчлэн байдаг гурвалсан эмээр солихоос бүрдэнэ. Интерферон генийн ДНХ-ийн мутагенезийг ПГУ-аар гүйцэтгэдэг.
PSX43 рекомбинант плазмидыг барих
Рекомбинант pSX43 плазмидыг авахын тулд ПСГ-аар ДНХ-ийн нэг дугуй олшруулалтыг pSX41 плазмидын ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж, IFN3 ба IFN4 праймеруудыг ашиглана.
ПГУ-ыг дараахь нөхцөлд явуулна: 95 0С-т 5 минут халааж, 20 ПГУ-ын цикл (30 сек 95 ° С, 30 сек 56 ° С, 10 мин 72 ° С), 72 минутын температурт 20 минутын турш инкубаци хийнэ. ПГУ-ын дараа олж авсан ДНХ-ийг шууд E. coli DH5 омгийн эс болгон хувиргаж, 20 мкг / мл канамицин агуулсан ЛА орчинд тарина. 12 цаг 37 ° С температурт өсгөвөрлөсний дараа клонуудыг шигшиж, плазмидын ДНХ-г тусгаарлаж, хязгаарлалтын шинжилгээ хийж, ДНХ-ийн анхдагч бүтцийг тодорхойлно. Үүний үр дүнд 3218 bp хэмжээтэй pSX43 плазмидыг олж авна.
PSX45 рекомбинант плазмидыг барих
Рекомбинант pSX45 плазмидыг авахын тулд ПСГ-аар ДНХ-ийн нэг дугуй олшруулалтыг pSX43 плазмидын ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж, IFN5 ба IFN6 праймеруудыг ашиглана.
ПГУ-ыг дараахь нөхцлөөр гүйцэтгэнэ: 95 0С-т 5 минут халааж, 20 ПГУ-ын цикл (95 секундын температурт 30 сек, 56 оС-т 30 сек, 72 оС-т 10 минут) ба 72 минутын температурт 20 минутын турш инкубаци хийнэ. ПГУ-ын дараа олж авсан ДНХ-ийг шууд E. coli DH5 омгийн эс болгон хувиргаж, 20 мкг / мл канамицин агуулсан LA орчинд бүрхэв. 37 ° С-т 12 цагийн турш инкубацласны дараа клонуудыг шигшиж, плазмидын ДНХ-г тусгаарлаж, хязгаарлалтын шинжилгээ хийж, ДНХ-ийн анхдагч бүтцийг тодорхойлно. Үүний үр дүнд 3218 морины хүчтэй pSX45 плазмидыг олж авна.
PSX50 рекомбинант плазмидыг барих.
Рекомбинант pSX50 плазмидыг авахын тулд ПСГ-аар ДНХ-ийн нэг дугуй олшруулалтыг pSX45 плазмидын ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж, IFN7 ба IFN8 праймеруудыг ашиглана.
ПГУ-ыг дараахь нөхцөлд явуулна: 95 0С-т 5 минут халааж, 20 ПГУ-ын цикл (30 сек 95 ° С, 30 сек 56 ° С, 10 мин 72 ° С), 72 минутын температурт 20 минутын турш инкубаци хийнэ. ПГУ-ын дараа олж авсан ДНХ-ийг шууд E. coli DH5 омгийн эс болгон хувиргаж, 20 мкг / мл канамицин агуулсан LA орчинд бүрхэв. 12 цагийн турш 37 ° С-т өсгөвөрлөсний дараа клонуудыг шигшиж, плазмидын ДНХ-г тусгаарлаж, хязгаарлалтын шинжилгээ хийж, ДНХ-ийн анхдагч бүтцийг тодорхойлно. Үүний үр дүнд 3218 морины хүчтэй pSX50 плазмидыг олж авна.
Жишээ 2. E. coli SX50 омог авах - интерферон үйлдвэрлэгч
Интерферон E. coli SX50 үүсгэдэг омгийг E. coli BL21 омгийн эсүүдийг рекомбинант pSX50 плазмидтай хувиргах замаар олж авдаг. Интерферон үүсгэдэг омгийг 30 л исгэгчээр 25.0-30.0 о.у.-ийн оптик нягт хүртэл өсгөдөг. 1% хүчиллэг казеины гидролизат (Дифко), 1% глюкоз, 40 мкг / мл канамицин агуулсан M9 орчинд 38-39 ° C-д. Исгэлтийн үед тэжээлийн субстратыг гравитометрийн хянагч ашиглан тасралтгүй нэмж өгдөг.
Жишээ 3. Интерфероныг E. coli SX50 омогоос тусгаарлах арга
Интерфероныг 4 үе шаттайгаар авсан.
1-р шат. E. coli SX50 омгийг тариалах.
2-р шат. Интерфероны уусдаггүй хэлбэрийг тусгаарлах, цэвэршүүлэх.
3-р шат. Интерфероны уусалт ба ренатураци.
4-р шат. Интерфероныг хроматографийн аргаар цэвэршүүлэх.
1-р шат. E. coli SX50 омгийг тариалах
E. coli SX50 омгийн ургасан тарилгыг 26 цагийн турш 3 цагийн баялаг LB тэжээлийн эзэлхүүнтэй 26 цагийн турш 27 литр ариутгасан орчин, казеины 1% хүчил гидролизат, 1% глюкоз, 1мМ MgCl агуулсан исгэх бодисонд асептик байдлаар оруулна. 2, 0.1 мМ CaCl 2, 40 мг / мл канамицин. Исгэгчийн тариалалтыг 38-39 0С-ийн температурт хийж, рН-ийг 7 ± 0.15 хүртэл байлгаж 40% -ийн натрийн гидроксидын уусмалаар автомат титрлэнэ. Ханасан ханасан (50 ± 10)% -ийн хүрээнд ууссан хүчилтөрөгчийн концентрацийг хутгуурын эргэлтийн хурдыг 100-800 эрг / мин, агаарын хангамжийг 1-15 л / мин болгон өөрчлөх замаар хадгална. Исгэлтийн явцад субстратын, ялангуяа глюкоз ба мөөгөнцрийн хандыг хэмждэг бөгөөд тэдгээрийн концентрацийг гравиметрийн хянагч ашиглан перисталтик шахуургаар дамжуулж төвлөрсөн уусмалын тэжээлийн хэмжээг өөрчилнө.
Уусдаггүй интерфероны хуримтлалыг фазын тодосгогч микроскоп, 15% полиакриламид гель электрофорез (SDS-PAAG), урвуу фазын өндөр гүйцэтгэлтэй хроматографи (RF HPLC) -аар хянана. Оптикийн хамгийн их нягтрал (~ 25-30 pu) хүрч, интерфероны синтез зогсох үед исгэхээ зогсооно. Исгэлтийн төгсгөлд өсгөвөрлөх шингэнийг 5000-10000 эрг / мин эргэлтийн хурдаар урсдаг роторт центрифугээр ялгана. Биомассыг гялгар уутанд хийж, хасах 70 ° C-т хөлддөг.
2-р шат. Интерфероны уусдаггүй хэлбэрийг тусгаарлах, цэвэршүүлэх
E. coli SX50 омгийн 300-400 гр хөлдөөсөн биомассыг 3000 мл буфер 1-д түдгэлзүүлнэ (20мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X100). Түдгэлзүүлэлтийг Гаулин төрлийн урсгалын нэгэн төрлийн болгогчоор дамжуулж, 900 бар-т хадгалж, 15000 эрг / мин хурдтай урсдаг роторт центрифугдэв. Үүссэн тунадасыг ижил төстэй нөхцөлд буфер 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M urea) ба буфер 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) -аар дараалан угааж, эцэст нь интерфероны тунадасыг 200-д түдгэлзүүлнэ. мл буфер 3. Энэ тохиолдолд интерфероны уусдаггүй хэлбэрийг ялгаж цэвэршүүлэх хугацаа 5 цагаас илүүгүй байна.
3-р шат. Интерфероны уусалт ба ренатураци
Хуурай гуанидин гидрохлорид нь өмнөх шатанд олж авсан уусдаггүй хэлбэрийн интерфероны суспензид 6М концентрацид, дититрейтол 50мМ, Трис-НСl рН 8.0, 50мМ концентрацид, NaCl 150мм концентрацид, Triton X100 0.1% -ийн концентрацид нэмнэ. өрөөний температурыг 2 цаг байлгана.Уусдаггүй материалыг 0.22 микрон нүх сүвний диаметр бүхий мембранаар ариутгаж шүүнэ.
Интерфероныг сэргээн засварлахдаа үүссэн уусмалыг буфер 4 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) -аар 100-200 удаа аажмаар шингэлнэ. Дараа нь ренатурын хольцыг 4-15С-ийн температурт 12-15 цагийн турш тогтмол хутгах замаар өсгөвөрлөнө. Дараа нь магнийн сульфатыг 1мм концентрацид нэмээд 0.22 микрон нүх сүвний диаметр бүхий мембраны шүүлтүүрээр шүүж ариутгаж нэгтгэсэн материалыг зайлуулна.
4-р шат. Интерфероныг хроматографийн аргаар цэвэршүүлэх
Интерфероны хроматографийн цэвэршүүлэлтийг гурван үе шаттайгаар явуулдаг.
1. Үүссэн ренатират интерфероныг эхний шатанд Cu +2 ионоор хөдөлгөөнгүйжүүлсэн Cheating Sepharose Fast Flow давирхай (Amersham Bioscience) давирхай дээр ойртох хроматографийн аргаар цэвэрлэнэ. Үүний тулд интерфероны уусмалыг Cu + 2 Cheating Sepharose Fast Flow бүхий багананд түрхэж, интерфероныг 0.1 M нимбэгийн хүчил буфер, рН 2.2-аар шингэлнэ.
2. Хроматографийн цэвэршүүлэлтийн хоёрдахь шатанд интерфероны уусмалыг CM Sepharose Fast Flow катион солилцооны давирхайд (Amersham Bioscience) түрхэж, интерфероныг уусмалын градиент (0.0-0.5 M NaCl) -аар 50мМ Na (CH 3 COO) буферт, рН 5.5-д шингэлнэ.
3. Интерфероны мономер хэлбэрийг интерфероны полимер хэлбэрийн үлдэгдлээс цэвэрлэх ажлыг интерфероныг Superdex 75 давирхай (Amersham Bioscience) дээр гель шүүлтүүрээр цэвэрлэх гуравдахь үе шатанд явуулдаг. Хроматографийг 0.15 M NaCl агуулсан рН 5.0, 50 мМ Na (CH 3 COO) буферт хийдэг.
Интерфероныг ялгах, цэвэршүүлэх талаар тайлбарласан арга нь нэг л тусгаарлах мөчлөгт 4-8 г өндөр цэвэршүүлсэн интерфероныг 10 литр тэжээлийн орчиноос авсан биомассаас 7-10 хоногийн турш авах боломжийг олгодог. Олж авсан интерфероны чанар нь "Европын фармакопея" -ны интерфероны альфа-2b бодисын шаардлагыг бүрэн хангаж өгдөг.
Интерфероны агууламж 2 × 10 8 IU / мл-ээс багагүй;
Интерфероны өвөрмөц үйл ажиллагаа нь 2.0 × 10 8 IU / мг-аас багагүй;
Бэлдмэлийн электрофоретик цэвэршилт нь гельийг мөнгөөр \u200b\u200bбудахад бууруулж, бууруулдаггүй нөхцөлд 99% -иас багагүй;
Тусгаарлагдсан интерфероны изоэлектрик цэг нь рН-ийн 5.8-6.3;
Тусгаарлагдсан интерфероны пептидийн зураглал нь Европын стандарт интерферон альфа 2b CRS-ийн пептидийн зураглалаас үндсэндээ ялгаатай биш юм;
Дээрх жишээнээс харахад нэхэмжлэлийн бүлгүүд нь харьцангуй энгийн бөгөөд найдвартай технологиор интерферон альфа-2b-ийг өндөр ургацаар авах боломжтой болгож байна.
ШҮҮХ
1. Хүний рекомбинант альфа-2б интерфероны синтезийг кодчилдог рекомбинант плазмидын ДНХ pSX50 нь 3218 суурь хос (bp) хэмжээтэй бөгөөд дараахь хэсгүүдээс бүрддэг онцлогтой: 1-ээс 176 нуклеотид (bp) хүртэлх дараалал нь фрагмент орно. Триптофан промотор (P trp) агуулсан 176 морины хүчтэй ДНХ, 177 - 194 морины хүчтэй. Орчуулгын эхлэлийг хариуцах Шин Делгарногийн дарааллыг агуулсан 18 б.р. хэмжээтэй синтетик ДНХ-ийн фрагмент орно. үүнд 371 (A\u003e C), 39 (G\u003e T), 40 (A\u003e C), 42 (G\u003e T), 67 (341 bp) нуклеотид орлуулалттай интерферон альфа-2б ген агуулсан ДНХ-ийн хэсэг орно. A\u003e C), 69 (G\u003e T), 70 (A\u003e C), 72 (A\u003e T), 96 (G\u003e A), 100 (A\u003e C), 102 (A\u003e T), 114 (A) \u003e C), 120 (C\u003e G), 126 (G\u003e A), 129 (G\u003e A), 330 (C\u003e G), 339 (G\u003e A), 342 (G\u003e A), 487 (A\u003e) C), 489 (A\u003e T), 495 (G\u003e A), 696-аас 713 n хүртэлх дараалал. синтетик полинлинкер агуулсан 18 морины хүчтэй, синтетик ДНХ-ийн фрагментийг багтаасан бөгөөд 714-ээс 1138 морины хүчтэй. 4129-ээс 4553 нт хүртэлх pKK223-3 плазмидын ДНХ-ийн хэсэг орно. 425 bp хэмжээтэй, транскрипцийн хатуу төгсгөлийн дарааллыг агуулсан rrnBT 1 T 2, 1139-1229 nt хүртэлх дараалал. 2487-аас 2577 нт хүртэлх плазмид pUC19-ийн ДНХ-ийн хэсэг орно. 91 bp хэмжээтэй, β-лактомаза генийг дэмжигч агуулсан (генийн ампициллин -Amp R-ийн эсэргүүцэл), 1230-2045 нт хүртэлх дараалал. 720 nt бүхий pUC4K плазмидын ДНХ-ийн хэсэг орно. МЭ 1535 он хүртэл Кан генийн бүтцийн мужийг агуулсан 816 bp хэмжээтэй, 2046 bp-ээс авсан дараалал. 3218 н хүртэл. 1625-аас 453 нт-ийн хоорондох pUC19 плазмидын ДНХ-ийн хэсэг орно. 1173 bp хэмжээтэй, плазмид (ori) ба лак промотор (P lac) -ийг хуулбарлах үүрэгтэй дарааллыг агуулна.
2. Хүний 1-р лейкоцитын интерферон альфа-2b үйлдвэрлэгч 1-р нэхэмжлэлийн дагуу рекомбинант плазмидаар өөрчлөгдсөн бактерийн омог Eschcerichia coli SX50.
3. Хүний интерферон альфа-2b-ийг олж авах арга, үүнд биосинтезийн үед тэжээлийн субстратыг тогтмол нэмж тэжээлийн орчинд 2-р зүйлд заасны дагуу Escherichia coli SX5 омгийг тариалах, 700-900 бар даралтанд бичил биетний эсийг механик аргаар устгах, гуанидин гидрохлоридын буфер уусмалд интерферон уусгах. Хаотроп бодис агуулсан физиологийн буфер уусмал дахь интерфероны ренатураци, Cu +2 ионоор хөдөлгөөнгүйжүүлсэн Хелат Сепарарозын хурдан урсгалын давирхай дээрх интерфероныг гурван үе шаттай хроматографийн аргаар цэвэршүүлэх, CM Sepharose Fast Flow ион солилцооны давирхай дээр ион солилцооны хроматографи, Superdex 75 давирхай дээр гель шүүх хроматографи ...
4. Нэхэмжлэлийн 3-д заасны дагуу тариалалтыг шим тэжээлийн субстрат, глюкоз ба мөөгөнцрийн хандыг тасралтгүй нэмж, триптофаны агууламж багатай тэжээллэг орчинд хийдэг.
5. Интерфероныг уусгахаас өмнө эсийн уусдаг бүрэлдэхүүн хэсгүүд, үүнд ДНХ, РНХ, уураг, липополисахарид зэргийг зайлуулж, Triton XI 00 төрлийн угаалгын нунтаг агуулсан буферийн уусмалаар угаах замаар цэвэршүүлсэн 3-р арга.
6. Хроматографийн цэвэршүүлэлт бүрийн дараа ариутгалын шүүлтүүрийг 0.22 мкм-ийн нүх сүвний хэмжээтэй шүүлтүүрээр дамжуулан хийдэг 3-р нэхэмжлэлийн дагуу арга.