Zdravlje djece. Sve o lijekovima Što je interferon alfa 2b za ljude

21.04.2020

U kliničkim studijama provedenim sa širokim rasponom indikacija i sa širokim rasponom doza (od 6 milijuna IU / m2 tjedno za dlakavu staničnu leukemiju; do 100 milijuna IU / m2 tjedno za melanom), najčešći neželjeni događaji bili su groznica, umor, glavobolja, mijalgija. Groznica i umor umire u roku od 72 sata nakon prestanka primjene lijeka. Iako groznica može biti jedan od simptoma sindroma nalik gripi, koji se često može vidjeti liječenjem interferonom, testiranje treba učiniti kako bi se isključili drugi. mogući razlozi uporna groznica.
Sigurnosni profil ispod dobiven je od 4 klinička istraživanja u bolesnika s kroničnim hepatitisom C koji su primali Intron A kao monoterapiju ili u kombinaciji s ribavirinom 1 godinu. Svi su pacijenti primali 3 milijuna IU Introna A 3 puta tjedno.
Tablica 2 prikazuje neželjene događaje opažene s učestalošću većom ili jednakom 10% u bolesnika koji su prethodno bili ne liječeni i primali su Intron A (ili Intron A u kombinaciji s ribavirinom) 1 godinu. Općenito, prijavljeni štetni događaji bili su blagi do umjereni.
Tablica 2.

Nuspojave	Intron A (n \u003d 806)	Intron A + ribavirin (n \u003d 1010)
Lokalne reakcije
Upalne reakcije na mjestu ubrizgavanja	9–16%	6–17%
Ostale reakcije na mjestu ubrizgavanja	5–8%	3–36%
Opće reakcije
Glavobolja	51–64%	48–64%
Umor	42–79%	43–68%
Zimica	15–39%	19–41%
Vrućica	29–39%	29–41%
Sindrom nalik gripi	19–37%	18–29%
Astenija	9–30%	9–30%
Gubitak težine	6–11%	9–19%
Gastrointestinalne reakcije
Mučnina	18–31%	25–44%
Anoreksija	14–19%	19–26%
Proljev	12–22%	13–18%
Bolovi u stomaku	9–17%	9–14%
povraćanje	3–10%	6–10%
Reakcije mišićno-koštanog sustava
Mialgija	41–61%	30–62%
artralgija	25–31%	21–29%
Bolovi u kostima i mišićima	15–20%	11–20%
Reakcije CNS-a
Depresija	16–36%	25–34%
Razdražljivost	13–27%	18–34%
Nesanica	21–28%	33–41%
Anksioznost	8–12%	8–16%
Oslabljena sposobnost koncentracije	8–14%	9–21%
Emocionalna labilnost	8–14%	5–11%
Kožne reakcije
alopecija	22–31%	26–32%
svrabež	6–9%	18–37%
Suha koža	5–8%	5–7%
Osip	10–21%	15–24%
Respiratorne reakcije
upala grla	3–7%	7–13%
Kašalj	3–7%	8–11%
dispneja	2–9%	10–22%
drugo
Vrtoglavica	8–18%	10–22%
Virusna infekcija	0–7%	3–10%

Neželjeni događaji primijećeni u bolesnika s virusnim hepatitisom C odgovaraju onima primijećenima kad su uzimali Intron A za druge indikacije s nekim povećanjem incidencije ovisnim o dozi.
Kada se Intron A koristi za druge indikacije (u kliničkim i izvan kliničkim ispitivanjima), rijetko (| 1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Iz tijela u cjelini.Vrlo rijetko - edem lica.
Zabilježena su astenska stanja (astenija, nelagoda i umor), dehidracija, palpitacije, psorijaza, gljivične infekcije i bakterijske infekcije (uključujući sepsu).
Iz imunološkog sustava.Vrlo rijetko, sarkoidoza ili pogoršanje.
Upotrebom alfa interferona zabilježen je razvoj različitih autoimunih i imunološki posredovanih poremećaja, uključujući idiopatske ili trombotske trombocitopenične purpure, reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus, vaskulitis i Vogt-Koyanagi-Harada sindrom.
Zabilježeni su slučajevi akutnih reakcija preosjetljivosti, uključujući urtikariju, angioedem alergijski edem i anafilaksije.
Sa strane kardiovaskularnog sustava: rijetko - aritmija (obično se javlja kod bolesnika s poviješću prethodnih bolesti kardiovaskularnog sustava ili s prethodnom kardiotoksičnom terapijom), prolaznom reverzibilnom kardiomiopatijom (zabilježeno kod bolesnika bez opterećene povijesti kardiovaskularnog sustava); vrlo rijetko - arterijska hipotenzija, ishemija miokarda i infarkt miokarda.
Iz središnjeg živčanog sustava i perifernog živčanog sustava.Rijetko - suicidne sklonosti; vrlo rijetko - agresivno ponašanje, uključujući usmjereno na druge ljude, pokušaji samoubojstva, samoubojstvo, psihoza (uključujući halucinacije), oslabljena svijest, neuropatija, polineuropatija, encefalopatija, cerebrovaskularna ishemija, cerebrovaskularna krvarenja, periferna neuropatija, napadaji.
Iz organa sluha.Vrlo rijetko - oštećenje sluha.
Iz endokrinog sustava.Rijetko - dijabetes, pogoršanje tijeka postojećeg dijabetes melitusa.
Iz gastrointestinalnog trakta.Vrlo rijetko - pankreatitis, pojačani apetit, krvarenje desni, kolitis.
Iz jetre i žučnih puteva.Vrlo rijetko - hepatotoksičnost (uključujući smrt).
Promjene na zubima i parodonciju. U bolesnika koji su primali kombiniranu terapiju s nitronom A i ribavirinom, primijećene su patološke promjene na zubima i parodonciju. Suha usta s dugotrajnom kombiniranom terapijom ribavirinom i Intronom A mogu uzrokovati oštećenje zuba i oralne sluznice. Pacijenti bi trebali četkati zube 2 puta dnevno i imati redovite stomatološke preglede. Pored toga, kod nekih bolesnika može se pojaviti povraćanje.
Sa strane metabolizma.Rijetko - hiperglikemija, hipertrigliceridemija.
Iz mišićno-koštanog sustava.Rijetko - rabdomioliza (ponekad teška), grčevi u nogama, bol u leđima, miozitis.
Na dijelu kože.Vrlo rijetko - multiformni eritem, Stevens-Johnsonov sindrom, toksična epidermalna nekroliza, nekroza na mjestu uboda.
Iz dišnog sustava.Rijetko - upala pluća; vrlo rijetko - plućni infiltrati, pneumonitis.
Iz mokraćnog sustava.Vrlo rijetko - nefrotski sindrom, bubrežna disfunkcija, zatajenje bubrega.
Iz hematopoetskog sustava.Vrlo rijetko, kada se koristi Intron A samostalno ili u kombinaciji s ribavirinom, primijećena je aplastična anemija i potpuna aplazija crvene koštane srži.
Na dijelu organa vida.Rijetko - krvarenje u mrežnici, žarišne promjene na fundusu, tromboza retinalnih arterija i vena, smanjena oštrina vida, smanjenje vidnih polja, optički neuritis, edem glave optičkog živca.
klinički značajne promjene laboratorijski parametri.(što se češće primjećuje prilikom propisivanja lijeka u dozama većim od 10 milijuna IU / danu) - smanjenje broja granulocita i leukocita, pad razine hemoglobina i broja trombocita, porast aktivnosti alkalne fosfataze, LDH, razine kreatinina i serumskog dušika uree. Zabilježeno je povećanje aktivnosti ALT-a i ACT-a u krvnoj plazmi kao patološko kada se koristi za sve indikacije, osim za hepatitis, kao i kod nekih bolesnika s kroničnim hepatitisom B u odsutnosti HBV DNA.
Ako se tijekom primjene Introna A zbog bilo koje indikacije pojave neželjeni učinci, dozu treba smanjiti ili liječenje privremeno prekinuti dok se neželjeni učinci ne uklone. Ako se razvije trajna ili ponovljena netolerancija primjenom odgovarajućeg režima doziranja ili bolest napreduje, terapiju Intronom A treba otkazati.

Klinička farmakologija
Farmakološko djelovanje - antivirusno, antitumorsko i imunomodulacijsko.

To je visoko pročišćeni rekombinantni protein s molekulskom masom od 19 300 daltona. Dobiven iz klona E. coli hibridizacijom bakterijskog plazmida s ljudskim genom leukocita koji kodira sintezu interferona. Za razliku od interferona, alfa-2a ima arginin na položaju 23. Ima antivirusni učinak, koji je posljedica interakcije sa specifičnim membranskim receptorima i indukcije sinteze RNA i na kraju proteina. Potonji, pak, ometaju normalnu reprodukciju virusa ili njegovo oslobađanje. Ima imunomodulatorno djelovanje, koje je povezano s aktiviranjem fagocitoze, stimulacijom stvaranja antitijela i limfokina. Ima antiproliferativni učinak na stanice tumora.
- farmakokinetika
  Kada se daje intramuskularno, 70% ulazi u sistemsku cirkulaciju. Biotransformira se uglavnom u bubrezima i u maloj mjeri u jetri. Interferon alfa-2b izlučuje se bubrezima.

Indikacije za uporabu
- Kronični hepatitis B.
- Kronični hepatitis C
- Mikoza gljiva.
- Primarni limfosarkom T-stanica.
- Dlakasta stanična leukemija.
- Višestruki mijelom (generalizirani oblici).
- Kronična mijeloidna leukemija.
- Maligni melanom.
- Rak mjehura (površno smješten).
- Karcinom bazalnih stanica.
- Ukazana kondilomatoza.
- Kaposijev sarkom (uključujući AIDS).
- Non-Hodgkinov limfom (u sklopu kombinirane terapije).

Način primjene i doziranje
Pojedinačno, ovisno o indikacijama i režimu liječenja.
- S dlakavom staničnom leukemijom
  Odrasli intramuskularno ili subkutano daju 2 milijuna IU / m2 3 puta tjedno.
- S Kaposijevim sarkomom
  30 milijuna IU / m 3 3 puta tjedno.

kontraindikacije
- Teška kardiovaskularna bolest.
- Teška disfunkcija jetre i / ili bubrega.
- Epilepsija i / ili ozbiljni funkcionalni poremećaji središnjeg živčanog sustava.
- Kronični hepatitis s prijetnjom ciroze jetre.
- Bolest jetre u fazi dekompenzacije.
- Kronični hepatitis s ili nakon prethodne terapije imunosupresivima (osim stanja nakon otkazivanja kratkotrajne terapije kortikosteroidima).
- Autoimuni hepatitis.
- Povijest autoimunih bolesti.
- Imunosupresirani primatelji transplantacije.
- Prethodne bolesti štitnjače.
- Preosjetljivost na interferon alfa-2b.

Primjena tijekom trudnoće i dojenja
Primjena tijekom trudnoće moguća je u slučajevima kada očekivana korist za majku nadmašuje potencijalni rizik za plod. Žene u rodnoj dobi trebaju koristiti pouzdane metode kontracepcije dok koriste interferon alfa-2b.

Ako je potrebno, upotreba tijekom dojenja treba odlučiti o prekidu dojenje.

Interakcija
Interferoni mogu pojačati neurotoksične, mijelotoksične ili kardiotoksične učinke lijekova koji su prethodno propisani ili istodobno s njima.

Posebni uvjeti
Ne smije se koristiti u bolesnika sa mentalni poremećaji u anamnezi. Koristite s oprezom u bolesnika s plućnom bolešću u povijesti (uključujući kroničnu opstruktivnu plućnu bolest), dijabetes melitusom sklonim ketoacidozi, povećanim zgrušavanja krvi (uključujući anamnezu tromboflebita i plućne embolije), stanja teške mijelodepresije.

Prije početka i sustavno tijekom razdoblja liječenja potrebno je provesti kontrolu jetre, uzorka periferne krvi, biokemijske parametre krvi, kreatinin. Tijekom razdoblja liječenja treba provoditi odgovarajuću hidrataciju tijela. U bolesnika s kroničnim hepatitisom C tijekom liječenja treba nadzirati razinu hormona koji stimulira štitnjaču.

Kod kroničnog hepatitisa B, praćenog smanjenjem sintetičke funkcije jetre (što se očituje padom razine albumina ili povećanjem protrombinskog vremena), treba procijeniti očekivanu korist mogući rizik terapija. Primjena s istodobnom psorijazom opravdana je u slučajevima kada očekivana korist terapije nadmašuje potencijalni rizik. Uz istodobni dijabetes melitus ili arterijsku hipertenziju, potrebno je pregledati fundus prije i za vrijeme liječenja. Ako postoji povijest kroničnog zatajenja srca, infarkta miokarda i / ili prethodnih ili postojećih aritmija, liječenje interferonom alfa-2b mora se provoditi pod strogim nadzorom liječnika.
- Utjecaj na sposobnost upravljanja vozilima i korištenje mehanizama
  Utjecaj na sposobnost upravljanja vozilima i upravljačke mehanizme Na početku terapije, potencijalno biste se trebali suzdržati opasne vrste aktivnosti koje zahtijevaju pojačanu pažnju, brze psihomotorne reakcije, sve do razdoblja stabilizacije djelovanja interferona alfa-2b.
Interferon alfa-2b u obliku praška za injekcije i otopine za injekcije uključen je na VED popis.

Oblik otpuštanja, sastav i pakiranje

ubrizgavanje prozirno, bezbojno.

Pomoćne tvari:

0,5 ml - ampule (5) - konturirane ćelijske omotnice (1) - kartonske kutije.
0,5 ml - ampule (5) - konturirane ćelijske kutije (2) - kartonske kutije.
0,5 ml - boce (1) - kartonske kutije.
0,5 ml - boce (5) - obložene ćelije (1) - kartonske kutije.
0,5 ml - staklene šprice (1) - konturirane ćelijske kutije (1) - kartonske kutije.
0,5 ml - staklene šprice (1) - konturirane ćelijske kutije (3) - kartonske kutije.
0,5 ml - staklene šprice (3) - obložene ćelijske kutije (1) - kartonske kutije.
0,5 ml - staklene šprice (3) - konturirane ćelijske kutije (3) - kartonske kutije.

ubrizgavanje prozirno, bezbojno.

Pomoćne tvari: natrijev acetat, natrijev klorid, etilendiamin tetra octene kiseline, dinatrijeva sol, tween-80, dekstran 40, voda d / i.

1 ml - ampule (5) - konturirane ćelijske omotnice (1) - kartonske kutije.
1 ml - ampule (5) - konturirane ćelijske omotnice (2) - kartonske kutije.
1 ml - boce (1) - kartonske kutije.
1 ml - boce (5) - obložene ćelije (1) - kartonske kutije.
1 ml - staklene šprice (1) - obložene ćelijske kutije (1) - kartonske kutije.
1 ml - staklene šprice (1) - konturirano stanično pakiranje (3) - kartonske kutije.
1 ml - staklene šprice (3) - obložene ćelijske kutije (1) - kartonske kutije.
1 ml - staklene šprice (3) - obložene ćelijske kutije (3) - kartonske kutije.

Klinička i farmakološka skupina

Interferon. Antineoplastični, antivirusni i imunomodulacijski lijek

farmakološki učinak

Interferon. Altevir ® ima antivirusno, imunomodulacijsko, antiproliferativno i antitumorsko djelovanje.

Interferon alfa-2b, interakcija sa specifičnim receptorima na staničnoj površini, pokreće složeni lanac promjena unutar stanice, uključujući indukciju sinteze niza specifičnih citokina i enzima, ometa sintezu virusne RNA i virusnih proteina u stanici. Rezultat ovih promjena je nespecifično antivirusno i antiproliferativno djelovanje povezano s sprječavanjem replikacije virusa u stanici, inhibicijom stanične proliferacije i imunomodulacijskim učinkom interferona. Interferon alfa-2b potiče proces prezentacije antigena imunokompetentnim stanicama, ima sposobnost stimuliranja fagocitne aktivnosti makrofaga, kao i citotoksične aktivnosti T stanica i "prirodnih ubojica stanica" uključenih u antivirusni imunitet.

Sprječava staničnu proliferaciju, posebno tumorskih stanica. Ima depresivni učinak na sintezu nekih onkogena, što dovodi do inhibicije rasta tumora.

farmakokinetika

Usisavanje

S potkožnim ili intramuskularnim davanjem interferona alfa-2b, njegova bioraspoloživost kreće se od 80% do 100%. Nakon uvođenja interferona alfa-2b, T max u krvnu plazmu je 4-12 sati, T 1/2 - 2-6 sati 16-24 sata nakon primjene, rekombinantni interferon u krvnom serumu nije detektiran.

Metabolizam

Metabolizam se provodi u jetri.

Alpha interferoni su sposobni da poremete oksidativne metaboličke procese, smanjujući aktivnost mikrosomalnih jetrenih enzima u sistemu citokroma P450.

Povlačenje

Izlučuje se uglavnom putem bubrega glomerularnom filtracijom.

Indikacije za uporabu lijeka

Kao dio složene terapije kod odraslih:

- s kroničnim virusnim hepatitisom B bez znakova ciroze jetre;

- s kroničnim virusnim hepatitisom C u nedostatku simptoma zatajenje jetre (monoterapija ili kombinirana terapija ribavirinom);

- s papilomatozom grkljana;

- s genitalnim bradavicama;

- s dlakavom staničnom leukemijom, kroničnom mijeloidnom leukemijom, ne-Hodgkinovim limfomom, melanomom, multiplim mijelomom, Kaposijevim sarkomom u pozadini AIDS-a, progresivnog karcinoma bubrega.

Režim doziranja

Primijenite s / c, i / m i i / v. Liječenje mora započeti liječnik. Nadalje, uz dozvolu liječnika, pacijent može sam sebi injektirati dozu održavanja (u slučajevima kada je lijek propisan s / c ili i / m).

Kronični hepatitis B: Altevir ® se daje supkutano ili intramuskularno u dozi od 5-10 milijuna IU 3 puta tjedno tijekom 16-24 tjedna. Liječenje se zaustavlja nakon 3-4 mjeseca uporabe u nedostatku pozitivne dinamike (prema studiji DNK virusa hepatitisa B).

Kronični hepatitis C: Altevir ® se daje supkutano ili intramuskularno u dozi od 3 milijuna ME 3 puta tjedno tijekom 24-48 tjedana. U bolesnika s ponavljajućim tijekom bolesti i u bolesnika koji prethodno nisu primili liječenje interferonom alfa-2b, učinkovitost liječenja povećava se u kombinaciji s kombiniranom terapijom ribavirinom. Trajanje kombinirane terapije je najmanje 24 tjedna. Terapija altevirom treba se provoditi 48 tjedana kod bolesnika s kroničnim hepatitisom C i genotipom 1 virusa s velikim virusnim opterećenjem, pri čemu do kraja prva 24 tjedna liječenja RNA virusa hepatitisa C nije otkrivena u serumu.

Larinksa papilomatoza: Altevir ® se daje supkutano u dozi od 3 milijuna IU / m 3 3 puta tjedno. Liječenje započinje nakon kirurškog (ili laserskog) uklanjanja tumorskog tkiva. Doza se bira uzimajući u obzir podnošljivost lijeka. Postizanje pozitivnog odgovora može zahtijevati 6 mjeseci liječenja.

Dlakava stanična leukemija: preporučena doza Altevira za supkutanu primjenu bolesnicima nakon splenektomije ili bez nje je 2 milijuna IU / m 3 3 puta tjedno. U većini slučajeva normalizacija jednog ili više hematoloških parametara događa se nakon 1-2 mjeseca liječenja, moguće je povećati trajanje liječenja na 6 mjeseci. Ovaj se režim doziranja treba stalno pridržavati, osim ako nema naglog napredovanja bolesti ili pojave simptoma teške netolerancije na lijekove.

Kronična mijeloična leukemija: Preporučena doza Altevira kao monoterapije je 4-5 milijuna IU / m2 dnevno s / c. Za održavanje broja leukocita možda će biti potrebna doza od 0,5-10 milijuna IU / m2. Ako vam liječenje omogućuje kontrolu broja leukocita, a zatim za održavanje hematološke remisije, lijek treba koristiti u najvećoj toleriranoj dozi (4-10 milijuna IU / m 2 dnevno). Lijek se mora prekinuti nakon 8-12 tjedana ako terapija nije dovela do djelomične hematološke remisije ili klinički značajnog smanjenja broja leukocita.

Non-Hodgkinov limfom: Altevir ® se koristi kao pomoćna terapija u kombinaciji sa standardnim režimima kemoterapije. Lijek se daje supkutano u dozi od 5 milijuna IU / m 3 3 puta tjedno tijekom 2-3 mjeseca. Doza se mora prilagoditi ovisno o podnošljivosti lijeka.

Melanoma: Altevir ® se koristi kao pomoćna terapija u prisutnosti visokog rizika od recidiva kod odraslih nakon uklanjanja tumora. Altevir ® se daje intravenski u dozi od 15 milijuna IU / m2 5 puta tjedno u trajanju od 4 tjedna, zatim s / c u dozi od 10 milijuna IU / m2 3 puta tjedno tijekom 48 tjedana. Doza se mora prilagoditi ovisno o podnošljivosti lijeka.

Multipli mijelom: Altevir ® se propisuje tijekom razdoblja postizanja stabilne remisije u dozi od 3 milijuna IU / m 2 3 puta tjedno n / a.

Kaposijev sarkom sa AIDS-om: optimalna doza nije utvrđena. Lijek se može koristiti u dozama od 10-12 milijuna IU / m2 / dan s / c ili i / m. U slučaju stabilizacije bolesti ili odgovora na liječenje, terapija se nastavlja sve dok ne dođe do regresije tumora ili dok ne bude potrebno povlačenje lijeka.

Rak bubrega:optimalna doza i režim nisu utvrđeni. Preporučuje se upotreba lijeka supkutano u dozama od 3 do 10 milijuna IU / m 3 3 puta tjedno.

Priprema otopine za intravensku primjenu

Volumen otopine Altevir potreban za pripremu potrebne doze se sakuplja, doda se u 100 ml sterilne 0,9% otopine natrijevog klorida i ubrizgava se tijekom 20 minuta.

Nuspojava

Opće reakcije: vrlo često - vrućica, slabost (ovisne su o dozi i reverzibilne reakcije, nestaju u roku od 72 sata nakon prekida liječenja ili njegovog prekida), zimica; rjeđe, slabost.

Sa strane središnjeg živčanog sustava: vrlo često - glavobolja; rjeđe - astenija, pospanost, vrtoglavica, razdražljivost, nesanica, depresija, suicidne misli i pokušaji; rijetko - nervoza, anksioznost.

Iz mišićno-koštanog sustava: vrlo često - mijalgija; rjeđe - artralgija.

Iz probavnog sustava:vrlo često - smanjen apetit, mučnina; rjeđe - povraćanje, proljev, suha usta, promjena ukusa; rijetko - bol u trbuhu, dispepsija; moguće reverzibilno povećanje aktivnosti jetrenih enzima.

Na dijelu kardiovaskularnog sustava: često - smanjenje krvnog tlaka; rijetko - tahikardija.

Dermatološke reakcije: rjeđe - alopecija, pojačano znojenje; rijetko - kožni osip, svrbež na koži.

Iz hematopoetskog sustava: moguća reverzibilna leukopenija, granulocitopenija, snižena razina hemoglobina, trombocitopenija.

Drugi: rijetko - gubitak težine, autoimuni tiroiditis.

Kontraindikacije za uporabu lijeka

- povijest teške kardiovaskularne bolesti (nekontrolirano kronično zatajenje srca, nedavni infarkt miokarda, teška srčana aritmija);

- teška bubrežna i / ili jetrena insuficijencija (uključujući one uzrokovane prisutnošću metastaza);

- epilepsiju, kao i teške disfunkcije središnjeg živčanog sustava, posebno izražene depresijom, samoubilačkim razmišljanjima i pokušajima (uključujući povijest);

- kronični hepatitis s dekompenziranom cirozom jetre i u bolesnika koji su primali ili su nedavno primili liječenje imunosupresivima (s izuzetkom završenog kratkoročnog tijeka liječenja GCS-om);

- autoimuni hepatitis ili na neki drugi način autoimune bolesti;

- liječenje imunosupresivima nakon transplantacije;

- bolest štitne žlijezde, koju nije moguće kontrolirati konvencionalnim terapijskim metodama;

- dekompenzirane bolesti pluća (uključujući KOPB);

- dekompenzirani dijabetes melitus;

- hiperkoagulabilnost (uključujući tromboflebitis, plućnu emboliju);

- teška mijelodepresija;

- trudnoća;

- razdoblje dojenja (dojenje);

- preosjetljivost na komponente lijeka.

Uporaba lijeka tijekom trudnoće i dojenja

Lijek je kontraindiciran tijekom trudnoće i dojenja (dojenja).

Primjena za kršenje funkcije jetre

Primjena za oslabljenu funkciju bubrega

Lijek je kontraindiciran kod teškog zatajenja bubrega i / ili jetre (uključujući one uzrokovane prisutnošću metastaza).

posebne upute

Prije liječenja Altevirom za kronični virusni hepatitis B i C preporučuje se biopsija jetre kako bi se procijenio stupanj oštećenja jetre (znakovi aktivnog upalnog procesa i / ili fibroze). Učinkovitost liječenja kroničnog hepatitisa C povećava se kombiniranom terapijom s Altevirom i ribavirinom. Primjena Altevira nije učinkovita u razvoju dekompenzirane ciroze jetre ili jetrene kome.

U slučaju nuspojava tijekom liječenja Altevirom, dozu lijeka treba smanjiti za 50% ili lijek privremeno ukinuti dok ne nestanu. Ako a nuspojave perzistirati ili se ponovo pojaviti nakon smanjenja doze ili je uočeno napredovanje bolesti, tada je potrebno liječenje Altevirom prekinuti.

Ako je broj trombocita ispod 50x10 9 / L ili je broj granulocita ispod 0,75x10 9 / L, preporučuje se smanjiti dozu Altevira za 2 puta kontrolnom kontrolom krvi nakon 1 tjedna. Ako se te promjene nastave, lijek treba otkazati.

Ako broj trombocita padne ispod 25x10 9 / l ili je broj granulocita ispod 0,5x10 9 / l, preporučuje se prekinuti lijek Altevir s kontrolom krvnih testova nakon 1 tjedna.

U bolesnika koji primaju pripravke interferona alfa-2b, u serumu krvi mogu se otkriti antitijela koja neutraliziraju njegovo antivirusno djelovanje. U skoro svim slučajevima, titri protutijela su niski, njihova pojava ne dovodi do smanjenja učinkovitosti liječenja ili pojave drugih autoimunih poremećaja.

Predozirati

Podaci o predoziranju Altevir® nisu navedeni.

Interakcije s lijekovima

Interakcija lijeka između Altevira i drugih lijekova nije u potpunosti proučena. Altevir treba primjenjivati \u200b\u200bs oprezom istovremeno s tabletama za spavanje i sedativi, opojni analgetici i lijekovi koji potencijalno imaju mijelodepresivni učinak.

Istodobnim imenovanjem Altevira i teofilina treba nadzirati koncentraciju lijeka u krvnom serumu i, ako je potrebno, promijeniti režim doziranja.

Kada se Altevir koristi u kombinaciji s lijekovima za kemoterapiju (citarabin, ciklofosfamid, doksorubicin, teniposid), povećava se rizik od toksičnih učinaka.

Uvjeti izdavanja iz ljekarni

Lijek je dostupan na recept.

Uvjeti i razdoblja skladištenja

Lijek treba čuvati izvan dohvata djece, u skladu s SP 3.3.2-1248-03, na temperaturi od 2 ° do 8 ° C; ne smrzavaj se. Rok trajanja je 18 mjeseci.

Transport na temperaturama od 2 ° do 8 ° C; ne smrzavaj se.

Izum se odnosi na genetski inženjering, biotehnologiju, medicinu, farmakologiju. Nova rekombinantna multikopijska plazmidna DNA pSX50 koja kodira sintezu humanog leukocita alfa-2b interferona, čija je ekspresija pod kontrolom promotora laktoze i triptofana i terminatora transkripcije. Kao rezultat transformacije stanica primatelja soja E. coli BL21 s rekombinantnim plazmidnim DNA pSX50, dobiven je soj E. coli SX50 - proizvođač rekombinantnog humanog leukocita alfa-2b interferona s produktivnošću do 0,9-1,0 g alfa-2b interferona iz 1 litre medija kulture. Metoda dobivanja rekombinantnog alfa-2b interferona temelji se na upotrebi stvorenog rekombinantnog soja E. coli SX50 i osiguravanju njegove duboke kultivacije na hranjivom mediju sa smanjenim sadržajem triptofana uz kontinuirano dodavanje hranjivih supstrata tijekom biosinteze, mehaničko uništavanje stanica mikroorganizma pri visokom tlaku, otapanje agregiranog proteina u koncentrirana otopina gvanidin hidroklorida, nakon čega slijedi renaturacija interferona u fiziološkim puferskim otopinama u prisutnosti chaotropnih agensa i njegovo pročišćavanje upotrebom trostupanjskog kromatografskog pročišćavanja interferona na smolama poput Chelation Sepharose Fast Flow imobiliziranog s Cu +2 ionima, ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom na ionski izmjenjivačkim smolama kao što su CM Flow i Sef Seph filtracijskom kromatografijom na smolama tipa Superdex 75. Metoda omogućava dobivanje interferonske tvari čistoće veće od 99% prema podacima elektroforeze u uvjetima smanjenja i ne redukcije pri bojenju gelova sa srebrom i više od 98% prema RF HPLC i bez pirogena (LAL test) u količinama od najmanje 400-800 mg iz 1 litre medija kulture. 3 n. i 3 k.p f-kristala, 6 bolesnih.

Crteži za RF patent 2242516

Izum se odnosi na genetski inženjering lijekovi, dobiveni biotehnološki, naime postupcima industrijske proizvodnje rekombinantnog humanog leukocita interferona alfa-2b za medicinske svrhe (u daljnjem tekstu interferon), kao i za rekombinantne sojeve koji proizvode Escherichia coli (E. coli) i plazmidnu DNA koja kodira sintezu interferona.

Interferoni su proteinske molekule s molekularnom masom od 15 000 do 21 000 daltona, koje proizvode i izlučuju stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge patogene. Postoje tri glavne skupine interferona: alfa, beta i gama. Te skupine same po sebi nisu homogene i mogu sadržavati nekoliko različitih molekularnih vrsta interferona. Tako je identificirano više od 14 genetskih sorti interferona alfa, koje su od interesa i široko se koriste u medicini kao antivirusna, antiproliferativna i imunomodulatorna sredstva.

Poznate metode za proizvodnju humanog leukocitnog interferona iz leukocita darovao krv ljude inducirane virusima i drugim induktorima (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Glavni nedostatak ovih metoda za proizvodnju interferona je vjerojatnost kontaminacije konačnog proizvoda ljudskim virusima, kao što su virus hepatitisa B i C, virus imunodeficijencije itd.

Trenutno je metoda dobivanja interferona mikrobiološkom sintezom prepoznata kao perspektivnija, što omogućava dobivanje ciljanog proizvoda sa znatno većim prinosom iz relativno jeftine sirovine. Pristupi korišteni u ovom slučaju omogućavaju stvaranje varijanti strukturalnog gena koji su optimalni za bakterijsku ekspresiju, kao i regulatornih elemenata koji kontroliraju njegovu ekspresiju.

Kao polazni mikroorganizmi koriste se različiti konstrukti sojeva Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli.

Nedostatak upotrebe P. pastoris kao proizvođača interferona (JN Garcia, JA Aguiar i dr. // Ekspresija humanog IFN-2b na visokoj razini u Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995), izuzetno su teški uvjeti fermentacije ove vrste kvasca, potreba strogog održavanja koncentracije induktora, posebno metanola, u procesu biosinteze. Nedostatak upotrebe Ps-a. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) je složenost fermentacijskog postupka na niskoj razini ekspresije (10 mg interferona na 1 litru medija kulture). Produktivnija je upotreba sojeva Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Poznat je veliki broj plazmida i sojeva E. coli stvorenih na njihovoj osnovi koji eksprimiraju interferon: sojevi E. coli ATCC 31633 i 31644 sa plazmidima Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ili Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), soj E. coli pINF-AP2 (SU 1312961), soj E. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), soj E. coli SG 20050 s plazmidom p280 / 21FN (Kravchenko V.V. et al. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, br. 9, str. 1186-1193), soj E. coli SG 20050 s plazmidom pINF14 (SU 1703691), sojem E. coli SG 20050 s plazmidom pINF16 (RU 2054041) i Ostali nedostatak tehnologija temeljenih na upotrebi ovih sojeva je njihova nestabilnost, kao i nedovoljna razina ekspresije interferona.

Uz karakteristike korištenih sojeva, učinkovitost postupka uvelike ovisi o tehnologiji koja se koristi za izolaciju i pročišćavanje interferona.

Poznata metoda proizvodnje interferona, uključujući kultivaciju Ps stanica. putida, uništavanje biomase, tretiranje polietileniminom, frakcioniranje amonijevim sulfatom, hidrofobna kromatografija na fenilsilokromu C-80, pH frakcioniranje lizata, njegova koncentracija i diafiltracija, ionska izmjena kromatografija na celulozi DE-52, ispiranje u pH gradijentu, ionski izmjenjivački eluent -52, koncentracija prolaskom kroz filter kasetu i gel filtracijom na Sephadex G-100 (SU 1640996). Nedostatak ove metode, osim složenog fermentacije u više faza, je višestepeni postupak dobivanja konačnog proizvoda.

Poznat je i postupak za proizvodnju interferona, uključujući uzgoj soja E. coli SG 20050 / pIF16, u LB-bujonu u tikvicama u termostatiranom tresalici, centrifugiranje biomase, ispiranje s puferskom otopinom i ultrazvuk za uništavanje stanica. Rezultirajući lizat je centrifugiran, ispran s 3M otopinom uree u puferu, otopljen u otopini gvanidin-klorida u puferu, soniciran, centrifugiran, oksidativna sulfitoliza, dijaliza protiv 8 M ureje, renaturacija i konačna dvostepena kromatografija na CM-52 celulozi i Sephadec G-50 ( RU 2054041). Nedostaci ove metode je njezina relativno niska produktivnost glavnih faza procesa izolacije i pročišćavanja. To se posebno odnosi na ultrazvučnu obradu proizvoda, dijalizu i oksidativnu sulfitolizu, što dovodi do nestabilnosti prinosa interferona, kao i do nemogućnosti korištenja ove metode za industrijsku proizvodnju interferona.

Kao najbliži analog (prototip) može se navesti metoda za proizvodnju humanog leukocitnog interferona koja se sastoji u uzgoju rekombinantnog soja E. coli, zamrzavanju dobivene biomase na temperaturi ne većoj od -70 ° C, odmrzavanju, uništavanju stanica mikroorganizma s lizocimom, uklanjanjem DNK i RNK unošenjem prelaze u lizat DNaze i pročišćavanje izoliranog netopljivog oblika interferona ispiranjem s puferskom otopinom s deterdžentima, otapanjem taloga interferona u otopini gvanidina hidroklorida, renaturacijom i jednofaznim pročišćavanjem kromatografijom s ionskom izmjenom. Kao producent koristio je soj E. coli SS5, dobiven upotrebom rekombinantnog plazmida pSS5, koji sadrži tri promotora: P lac, P t7 i P trp i gen alfa-interferona s uvedenim nukleotidnim supstitucijama.

Ekspresija interferona od bakterija E. coli SS5 koja sadrži ovaj plazmid kontroliraju tri promotora: P lac, P t7 i P trp. Razina ekspresije interferona je oko 800 mg po 1 litri suspenzije stanica (RU 2165455).

Nedostatak ove metode je niska obradivost upotrebe enzimskog uništavanja stanica, DNA i RNA mikroorganizma i jednofazno kromatografsko pročišćavanje interferona. To uzrokuje nestabilnost postupka oslobađanja interferona, dovodi do smanjenja njegove kvalitete i ograničava mogućnost korištenja gornje sheme za industrijsku proizvodnju interferona. Nedostaci ovog plazmida i soja koji se temelji na njemu su upotreba u plazmidu snažnog nereguliranog promotora faza T7 u soju E. coli BL21 (DE3), u kojem je gen T7 RNA polimeraze smješten pod promotorom lac-operona i koji uvijek "teče". Posljedično, u stanici se kontinuirano odvija sinteza interferona, što dovodi do disocijacije plazmida i smanjenja vitalnosti stanica soja, i kao rezultat - smanjenja prinosa interferona.

Cilj ovog izuma je konstruirati rekombinantni industrijski soj E. coli koristeći novi rekombinantni plazmidni DNA s visokom razinom biosinteze interferona i razviti učinkovitu industrijsku tehnologiju za proizvodnju medicinske tvari interferona koja po kvaliteti odgovara "Europskoj farmakopeji" za tvar interferona alfa-2b.

Taj je problem riješen stvaranjem rekombinantne plazmidne DNA pSX50 i soja Escherichia coli SX50, pohranjene u rusku kolekciju industrijskih sojeva Federalnog državnog unitarnog poduzeća GosNII Genetics, broj VKPM B-8550,

kao i postupak za proizvodnju rekombinantnog alfa-2b interferona temeljen na upotrebi rekombinantnog soja E. coli SX50 i osiguravanje njegovog potopljenog kultivacije na hranjivom mediju sa smanjenim sadržajem triptofana uz kontinuirano dodavanje hranjivih supstrata tijekom biosinteze, mehaničko uništavanje stanica mikroorganizma pri visokom tlaku, otapanje agregiranih proteina u koncentriranoj otopini gvanidin hidroklorida, nakon čega slijedi renaturacija interferona u fiziološkim puferskim otopinama u prisutnosti katropnih agensa i trostupanjsko kromatografsko pročišćavanje interferona na smolama tipa Chelation Sepharose Fast Flow, imobiliziranih s ionima Cu +2, ionsko-izmjenjivačka kromatografija na ionski izmjenjivačkim smolama tipa CM Flow gel gela i CM gel gel filtracije kromatografija na Superdex 75 smolama.

Prema izumu, osigurana je nova rekombinantna multikopijska plazmidna DNA pSX50 koja kodira sintezu humanog leukocita alfa-2b interferona, čija je ekspresija pod kontrolom promotora laktoze i triptofana i terminatora transkripcije. Plazmid pSX50 ima 3218 parova baza (bp), a karakteriziraju ga sljedeći fragmenti:

Sekvenca od 1 nukleotida do 176 nukleotida (nt) uključuje DNK fragment od 176 bp koji sadrži promotor triptofana (P trp);

Slijed iz 177 n. do 194 N. uključuje sintetički fragment DNA od 18 bp koji sadrži Shine Delgarno slijed odgovoran za pokretanje prevođenja;

Sukcesija od 195. god do 695 N. uključuje DNK fragment od 501 bp koji sadrži slijed gena interferona sa sljedećim nukleotidnim supstitucijama: na položaju 37, promjena od A do C, na položaju 39, promjena iz G u T, na položaju 40, promjena iz A u C, na položaju 42, promjena iz G u T , u položaju 67, zamjena A sa C, u položaju 69 zamjena G s T, u položaju 70 zamjena A sa C, u položaju 72 zamjena A s T, u položaju 96 zamjena G s A, u položaju 100 zamjena A sa C, c na položaju 102 promjena A u T, u položaju 114 promjena A u C, u položaju 120 promjena C u G, u položaju 126 promjena G u A, u položaju 129 promjena G u A, u položaju 330 promjena C u G, na poziciji 339 zamjena G s A, na položaju 342 zamjena G s A, u položaju 487 zamjena A s C, na položaju 489 zamjena A s T, u položaju 495 zamjena G s A;

Slijed iz 696. n. do 713 N. uključuje sintetski fragment DNA od 18 bp koji sadrži sintetički polilinker;

Slijed iz 714. n. do 1138. god uključuje DNK fragment plazmida pKK223-3 s 4129 nt. do 4553 N. veličina 425 bp, koja sadrži slijed strogog terminatora transkripcije rrnBT 1 T 2;

Slijed iz 1139. god do 1229. god uključuje DNK fragment plazmida pUC19 sa 2487 nt. do 2577. n. veličina 91 bp, koja sadrži promotor gena β-laktozaza (otpornost gena na ampicilin - Amp R);

Slijed iz 1230. god do 2045. n. uključuje DNK fragment plazmida pUC4K sa 720 nt. do 1535. god veličina 816 bp, koja sadrži strukturno područje gena kan;

Slijed iz 2046. god do 3218. n. uključuje DNK fragment plazmida pUC19 od 1625 do 453 nt. veličine 1173 bp, koja sadrži slijed odgovoran za replikaciju plazmida (ori) i lac-promotora (P lac).

Slike 1-5 prikazuju sheme konstrukcije i fizičku kartu plazmida pSX50.

Slika 6 prikazuje kompletnu nukleotidnu sekvencu za plazmid pSX50.

Soj Escherichia coli SX50 dobiven je transformacijom stanica Escherichia coli BL21 s pSX50 plazmidom korištenjem tradicionalne tehnologije genetskog inženjeringa. Soj E. Coli SX50 karakteriziraju sljedeće karakteristike.

Kulturne i morfološke karakteristike

Stanice su male, ravne, zadebljanog šipkastog oblika, gram-negativne, nesportske. Stanice dobro rastu na jednostavnim hranjivim medijima. Kod uzgoja na Difco agaru formiraju se okrugle, glatke, konveksne, oblačno, sjajne, sive kolonije s glatkim rubovima. Kad rastu u tekućim medijima (u minimalnom mediju s glukozom ili u LB bujonu), tvore intenzivno, ravnomjernu izmaglicu.

Fizičko-biološki znakovi

Aerobni. Raspon temperature za rast je 4-42 ° C s optimalnim pH od 6,5-7,5.

Kao izvor dušika koriste se i mineralne soli u obliku amonijaka i nitrata te organski spojevi u obliku aminokiselina, peptona, triptona, ekstrakta kvasca itd.

Kao izvor ugljika koriste se aminokiseline, glicerin, ugljikohidrati. Otpornost na antibiotike. Stanice pokazuju rezistenciju na kanamicin (do 100 µg / ml).

Escherichia coli 8X50 soj je proizvođač interferona.

Metoda, uvjeti i sastav sredstva za čuvanje soja

U L-arapeu s dodatkom kanamicina u koncentraciji od 20 µg / ml ispod ulja, u L-bujonu koji sadrži 15% glicerola i odgovarajućim antibioticima u ampulama na temperaturi od minus 70 ° C, u liofiliziranom stanju u ampulama pri temperaturi od plus 4 ° C.

Soj Escherichia coli SX50 identificiran je u Bergi's Guide (1974) kao soj vrste Escherichia coli.

Metoda industrijske proizvodnje interferona alfa-2b

Značajka predložene metode je razvoj tehnologije koja omogućuje izoliranje interferona iz netopljivog oblika koji se akumulira tijekom fermentacije, što može značajno pojednostaviti tehnološku shemu postupka izolacije i povećati prinos ciljanog proizvoda.

Metoda se sastoji u uzgoju soja Escherichia coli SX50 u hranjivom mediju, uz stalno dodavanje hranjivih supstrata, po mogućnosti glukoze i ekstrakta kvasca, u procesu biosinteze, poželjno sa smanjenim sadržajem triptofana, mehaničko uništavanje stanica mikroorganizma pri visokom tlaku od 700-900 bara, otapanje interferona u puferu otopina gvanidin hidroklorida, renaturacija interferona u fiziološkim puferskim otopinama u prisutnosti chaotropnih sredstava, nakon čega slijedi trofazno kromatografsko pročišćavanje interferona na helirajuće sefarozne smole brzog protoka imobilizirane s Cu +2 ionima, ionska izmjena kromatografija na ionskim izmjenjivačkim smolama gela tipa CM Sepharose Flow smole poput Superdex 75.

Optimalni uvjeti za pojedine faze dobivanja interferona su sljedeći:

Fermentacija se provodi uz kontinuirano dodavanje supstrata tijekom cijelog postupka, što dovodi do visoka razina ekspresija interferona;

Uništavanje stanica provodi se u dezintegratoru tipa Gaulin pod pritiskom od 900 bara;

Uklanjanje topljivih staničnih komponenti (DNA, RNA, proteini, lipopolisaharidi, itd.) Provodi se ispiranjem netopljivog oblika interferona s puferskim otopinama koje sadrže deterdžente (Triton XI00, urea itd.);

Rezultirajući talog koji sadrži interferon otopi se u pufernoj otopini 6 M gvanidin hidroklorida;

Renaturacija interferona provodi se u fiziološkoj puferskoj otopini koja sadrži kaotropne agense;

Trofazno kromatografsko pročišćavanje interferona provodi se na brzoj protoci helirajuće sefaroze, imobiliziranoj Cu +2 ionima, na CM Sepharose Fast Flow kation izmjenjivačkoj smoli i gel filtracijskoj kromatografiji na smoli tipa Superdex 75;

Nakon svakog kromatografskog pročišćavanja, provodi se sterilizacija filtracijom kroz filtere bez pirogena s veličinom pora od 0,22 µm.

Prinos interferona kao rezultat korištenja opisane metode je otprilike 400-800 mg interferona iz 1 litre medija kulture. Kvaliteta dobivenog proizvoda udovoljava standardima i zahtjevima "Europske farmakopeje" za tvar interferon alfa-2b.

Bitne razlike između predložene metode i prototipa su:

Upotreba sojeva s većom produktivnošću, što omogućava dobivanje veće količine interferona iz 1 litre medija kulture tijekom biosinteze;

Korištenje učinkovite mehaničke destrukcije stanične biomase, koja vam omogućuje da dobijete čistiji ekstrakt netopljivog oblika interferona u kraćem vremenu, s manjim gubicima;

Upotreba fizioloških puferskih otopina tijekom renaturacije u prisustvu kaootropnih sredstava povećava prinos ispravno renaturiranog oblika interferona;

Trofazno kromatografsko pročišćavanje interferona omogućuje dobivanje interferonske tvari čistoće veće od 99% u skladu s elektroforezom u reducirajućim i ne reducirajućim uvjetima, pri bojenju gelova srebrom i više od 98% prema RF HPLC i praktički bez pirogena (test LAL).

Suština i prednosti zahtjevane skupine izuma ilustriraju slijedećim primjerima.

Primjer 1. Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX50

Metoda za izgradnju plazmida pSX50 uključuje sljedeće korake:

Konstrukcija vektorskog plazmida pSX10;

1.konstrukcija plazmida pSX3 (2641 bp)

2.konstrukcija vektorskog plazmida pSX10 (2553 bp)

Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX41 (3218 bp);

Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX43 (3218 bp);

Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX45 (3218 bp);

Izgradnja rekombinantnog plazmida pSX50 (3218 bp).

Konstrukcija vektorskog plazmida pSX10

Vektorski plazmid pSX10 je vektor pUC19 u kojem se kodirajuća sekvenca gena beta-laktozaza koja daje otpornost na ampicilin zamijenjena kodirajućom sekvencom kan gena i sadrži terminator transkripcije iz plazmida pKK223-3.

Konstrukcija vektorskog plazmida pSS10 provodi se u dvije faze:

Dobivanje plazmida pSX3 (2641 bp), koji je plazmid pUC19, u kojem je kodirajuće područje amp gena zamijenjeno kodirajućim područjem kan gena;

Dobivanje plazmida vjetra pSX10 (2553 bp), koji je plazmid pSX3, u koji je DNK fragment koji kodira transkripcijski terminator rBT 1 T2 umetnut iza BamHI mjesta.

Da bi se dobio plazmid pSX3, provodi se pet krugova amplifikacije DNA PCR-om (lančana reakcija polimerazom). Tijekom prvog kruga, koristeći DNK plazmida pUC19 kao predložak, provodi se amplifikacija DNA fragmenta 1828 bp. (ulomak PU1-PU2) pomoću primera:

Ova i sljedeće PCR reakcije provode se u slijedećim uvjetima: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4) 2S04, 10 mM KCl, 2 tM MgCl2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg / ml BSA, 0,2 mM svakog dNTP-a, 1,25 jedinica. Pfu DNA polimeraza, 100 ng DNA. Postupak amplifikacije sastoji se od sljedećih faza: zagrijavanje na 95 ° C 5 minuta, 35 PCR ciklusa (30 s na 95 ° C, 30 s na 56 ° C, 2 min na 72 ° C) i inkubacija 10 minuta na 72 ° C. Nakon amplifikacije (i nakon naknadnih amplifikacija), DNA fragment se pročišćava elektroforezom u 1% agaroznom gelu. Tijekom drugog i trećeg kruga, koristeći pUC4K plazmidnu DNA kao predložak, pojačan je 555 bp DNA fragment. (fragment KM1-KM2) pomoću primera:

i amplifikacija DNA fragmenta od 258 bp. (KMZ-KM4) s temeljnim premazima

U petom krugu PCR-a, fragmenti (PU1-PU2) i (KM1-KM4) se kombiniraju u sljedećim uvjetima: grijanje na 95 ° C 5 min, 5 PCR ciklusa (30 sec 95 ° C, 30 sec 56 ° C, 10 min 72 ° C) i inkubacija 10 minuta na 72 ° C. DNA dobivena nakon posljednjeg PCR-a izravno se transformira u stanice E. coli DH5 soja i sadi na LA medij koji sadrži 20 µg / ml kanamicina. Nakon inkubacije 12 sati na 37 ° C, klonovi se prosijavaju, izolira se plazmidna DNA i vrši se restrikcijska analiza. Kao rezultat, dobiva se plazmid pSX3 veličine 2641 bp.

Da bi se dobio vektorski plazmid pSX10, provode se tri kruga amplifikacije DNA PCR-om. Tijekom prvog kruga, koristeći DNK plazmida pSX3 kao predložak, provodi se amplifikacija DNA fragmenta od 2025 bp. (ulomak 10.1-10.2) pomoću primera:

Tijekom drugog kruga, koristeći DNK plazmida pKK223-3 kao predložak, provodi se amplifikacija DNA fragmenta od 528 bp. (fragment KK1-KK2) pomoću primera:

U trećem krugu PCR-a fragmenti (10.1-10.2) i (KK1-KK2) se kombiniraju u sljedećim uvjetima: zagrijavanje na 95 ° C 5 min, 5 PCR ciklusa (30 sec 95 ° C, 30 sec 56 ° C, 10 min 72 ° C) i inkubacija 10 minuta na 72 ° C. DNA dobivena nakon posljednjeg PCR-a izravno se transformira u stanice E. coli DH5 soja i sadi na LA medij koji sadrži 20 µg / ml kanamicina. Nakon inkubacije 12 sati na 37 ° C, klonovi se prosijavaju, izolira se plazmidna DNA i vrši se restrikcijska analiza. Kao rezultat toga, dobiva se plazmid pSX10 od 2553 bp.

Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX41

Rekombinantni plazmid pSX41 je Hind III - BamHI DNA fragment vektorskog plazmida pSX3 (2529 bp), Hind III je EcoRI 168 bp fragment DNA koji kodira promotor triptofana E. coli (P trp), EcoRI-XbaI sintetički DNA fragment od 20 bp koji kodira SD sekvencu (Shine-Delgarno) i XbaI-BamHI DNA fragment od 501 bp koji kodira humani interferon alfa 2b gen.

Da bi se dobio Hind III - BamHI, DNK fragment vektorskog plazmida pSX3 (2529 bp), DNA plazmida pSX3 je tretirana restrikcijskim enzimima HindIII i BamHI, nakon čega slijedi elektroforetsko pročišćavanje u 1% -tnom agaroznom gelu. Hind III EcoRI DNK fragment od 168 bp koji kodira promotor triptofanovog operona (P trp) dobiven je PCR upotrebom ukupne E. coli DNA kao predloška i primera TRP1 i PRP2, nakon čega slijedi obrada pojačanog fragmenta restriktivnim enzimima Hindlll i EcoRI:

Da bi se dobio EcoRI-Xbal sintetički DNK fragment od 20 bp koji kodira SD sekvencu (Shine-Delgarno), sintetiziraju se sljedeći komplementarni oligonukleotidi:

XbaI-BamIII DNK fragment 501 bp koji kodira humani gen interferona alfa 2b dobiven je PCR upotrebom ukupne ljudske DNA kao predloška i primera IFN1 i IFN2, nakon čega slijedi obrada amplificiranog fragmenta restrikcijskim enzimima Xbal i BamIII:

Zatim se elektroforetski pročišćeni fragmenti kombiniraju, povežu s enzimom T4 faga ligaza, DNA se transformira u stanice soja E. coli DH5 i prelije na LA medij koji sadrži 20 µg / ml kanamicina. Nakon inkubacije 12 sati na 37 ° C, klonovi se prosijavaju, izolira se plazmidna DNA, provodi se restrikcijska analiza i određuje primarna struktura DNK. Kao rezultat, dobiva se 3218 bp plazmid pSX41. Zatim se provodi postupna mutageneza gena interferona da bi se povećala razina ekspresije ciljnog proizvoda. Mutageneza gena interferona sastoji se u zamjeni tripleta, koji su u E. coli rijetki, a kodiraju se za odgovarajuće aminokiseline, trostrukim vrstama koje se često nalaze u E. coli, a kodiraju iste aminokiseline. DNA mutageneza gena interferona provodi se PCR-om.

Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX43

Da bi se dobio rekombinantni plazmid pSX43, provodi se jedan krug amplifikacije DNA PCR-om koristeći DNK plazmida pSX41 kao predložak i prajmere IFN3 i IFN4:

PCR se provodi u sljedećim uvjetima: zagrijavanje na 95 ° C 5 min, 20 ciklusa PCR (30 sec 95 ° C, 30 sec 56 ° C, 10 min 72 ° C) i inkubacija 20 minuta na 72 ° C. DNA dobivena nakon PCR-a izravno se transformira u stanice E. coli DH5 soja i postavlja na LA medij koji sadrži 20 µg / ml kanamicina. Nakon inkubacije 12 sati na 37 ° C, kloni se pregledaju, izolira se plazmidna DNA, provede se restrikcijska analiza i utvrdi primarna struktura DNK. Kao rezultat, dobiva se plazmid pSX43 veličine 3218 bp.

Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX45

Da bi se dobio rekombinantni plazmid pSX45, provodi se jedan krug amplifikacije DNA PCR-om koristeći DNK plazmida pSX43 kao predložak i prajmere IFN5 i IFN6:

PCR se provodi u sljedećim uvjetima: zagrijavanje na 95 ° C 5 min, 20 PCR ciklusa (30 sec 95 ° C, 30 sec 56 ° C, 10 min 72 ° C) i inkubacija 20 minuta na 72 ° C. DNA dobivena nakon PCR-a izravno se transformira u stanice E. coli DH5 soja i postavlja na LA medij koji sadrži 20 µg / ml kanamicina. Nakon inkubacije 12 sati na 37 ° C, klonovi se prosijavaju, izolira se plazmidna DNA, provodi se restrikcijska analiza i određuje primarna struktura DNK. Kao rezultat toga, dobiva se 3218 bp plazmid pSX45.

Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX50.

Da bi se dobio rekombinantni plazmid pSX50, provodi se jedan krug amplifikacije DNA PCR-om koristeći DNK plazmida pSX45 kao predložak i prajmere IFN7 i IFN8:

Primjer 2. Dobijanje vrste E. coli SX50 - proizvođač interferona

Soj koji proizvodi interferon E. coli SX50 dobiva se transformiranjem stanica vrste E. coli BL21 s rekombinantnim plazmidom pSX50. Soj koji proizvodi interferon uzgaja se u fermentoru od 30 L do optičke gustoće od 25,0-30,0 o.u. u M9 mediju koji sadrži 1% kiselinski kazein hidrolizat (Difco), 1% glukoze, 40 µg / ml kanamicina, na 38-39 ° C. Tijekom fermentacije hranjivi supstrat se kontinuirano dodaje gravitometrijskim regulatorom.

Primjer 3. Postupak za izoliranje interferona iz E. coli SX50 soja

Interferon je dobiven u 4 faze:

1. faza Uzgoj soja E. coli SX50.

2. faza Izolacija i pročišćavanje netopljivog oblika interferona.

3. faza Otapanje i renaturacija interferona.

4. faza Kromatografsko pročišćavanje interferona.

1. faza Uzgoj soja E. coli SX50

Uzgojeni inokulum soja E. coli SX50 u zapremini 3 l bogatog LB medija 12 h na 26 ° C aseptično se unosi u fermentor koji sadrži 27 1 sterilnog medija koji sadrži M9, 1% kiseli hidrolat kazeina, 1% glukoze, 1 mM MgCl 2, 0,1 mM CaCl2, 40 mg / ml kanamicina. Uzgoj u fermentoru vrši se na temperaturi 38-39 ° C, održavajući pH 7 ± 0,15 automatskim titracijom s 40% -tnom otopinom natrijevog hidroksida. Koncentracija otopljenog kisika u području (50 ± 10)% zasićenja održava se promjenom brzine miješalice s 100 na 800 okr / min i dovodom zraka s 1 na 15 l / min. Koncentracija supstrata, posebno glukoze i ekstrakta kvasca, mjeri se tijekom fermentacije, a njihova koncentracija se održava promjenom brzine doziranja koncentriranih otopina kroz peristaltičke pumpe pomoću gravimetrijskog regulatora.

Akumulacija netopljivog interferona nadgleda se faznom kontrastnom mikroskopijom, 15% poliakrilamidnom elektroforezom (SDS-PAAG) i kromatografijom visokih performansi reverzne faze (RF HPLC). Fermentacija se zaustavlja nakon postizanja maksimalne optičke gustoće (~ 25-30 pu) i zaustavljanja sinteze interferona. Na kraju fermentacije tekućina za kulturu se odvaja centrifugiranjem u protočnom rotoru sa brzinom rotacije 5000-10000 o / min. Biomasa se pakira u plastične vrećice i smrzava na temperaturi od minus 70 ° C.

2. faza Izolacija i pročišćavanje netopljivog oblika interferona

300-400 g smrznute biomase soja E. coli SX50 suspendirano je u 3000 ml pufera 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspenzija je propuštena kroz homogenizator protoka tipa Gaulin, održavana na 900 bara i centrifugirana u protočnom rotoru pri 15.000 o / min. Rezultirajući talog ispere se u sličnim uvjetima sekvencijalno s puferima 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M urea) i puferom 3 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) i na kraju se talog interferona suspendira u 200 ml pufera 3. U ovom slučaju vrijeme izolacije i pročišćavanja netopljivog oblika interferona nije više od 5 sati.

3. faza Otapanje i renaturacija interferona

Suhom gvanidin hidrokloridu dodaje se suspenzija netopljivog oblika interferona dobivenog u prethodnoj fazi do koncentracije od 6 M, ditiotreitol se dodaje u koncentraciji od 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 do koncentracije 50 mM, NaCl u koncentraciji od 150 mM, a Triton X100 u koncentraciji od 0,1%, incu. sobna temperatura tijekom 2 sata Neraztopljeni materijal odvaja se sterilizacijom filtracije kroz membrane s promjerom pora od 0,22 mikrona.

Renaturacija interferona provodi se polaganim razrjeđivanjem dobivene otopine 100-200 puta s puferom 4 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Tada se renaturacijska smjesa inkubira uz stalno miješanje tokom 12-15 sati, na temperaturi od 4-8 ° C. Zatim se doda magnezijev sulfat u koncentraciji od 1 mM, a skupljeni materijal se odstrani sterilizacijom filtracije kroz membranski filter s promjerom pora od 0,22 mikrona.

4. faza Kromatografsko pročišćavanje interferona

Kromatografsko pročišćavanje interferona provodi se u tri stupnja.

1. Rezultirajući renaturirani interferon u prvom stupnju pročišćen je afinitetnom kromatografijom na brzonamjenskoj smoli za heliranje sefarozu (Amersham Biosciences) imobiliziranom s Cu +2 ionima. Za to se otopina interferona nanese na stupac s Cu +2 brzim protokom helirajuće sefaroze i interferon se eluira s 0,1 M puferom limunske kiseline, pH 2,2.

2. U drugoj fazi kromatografskog pročišćavanja, otopina interferona se nanese na CM Sepharose Fast Flow kation-izmjenjivačku smolu (Amersham Biosciences) i interferon se eluira gradijentom otopina (0,0-0,5 M NaCl) u 50 mM Na (CH3COO) puferu, pH 5,5.

3. Pročišćavanje monomernog oblika interferona iz ostataka polimernih oblika interferona provodi se u trećem stupnju pročišćavanja interferona gel filtracijom na smoli Superdex 75 (Amersham Biosciences). Kromatografija se vrši u 50 mM Na (CH3COO) puferu, pH 5,0, koji sadrži 0,15 M NaCl.

Opisana metoda izolacije i pročišćavanja interferona omogućava dobivanje 4-8 g visoko pročišćenog interferona u jednom izolacijskom ciklusu u trajanju od 7-10 dana iz biomase dobivene iz 10 1 medija kulture. Kvaliteta dobivenog interferona u potpunosti je u skladu sa zahtjevima "Europske farmakopeje" za tvar interferona alfa-2b, naime:

Koncentracija interferona nije manja od 2 × 10 8 IU / ml;

Specifična aktivnost interferona nije manja od 2,0 × 10 8 IU / mg;

Elektroforetska čistoća pripravka nije manja od 99% u reducirajućim i ne reducirajućim uvjetima prilikom bojenja gelova srebrom;

Izoelektrična točka izoliranog interferona nalazi se u području pH 5,8-6,3;

Peptidna karta izoliranog interferona bitno se ne razlikuje od mape peptida prema europskom standardu za interferon alfa 2b CRS;

Kao što slijedi iz gornjih primjera, tvrđena grupa izuma omogućava dobivanje interferona alfa-2b s visokim prinosom s relativno jednostavnom i pouzdanom tehnologijom.

ZAHTJEV

1. Rekombinantna plazmidna DNA pSX50, koja kodira sintezu rekombinantnog humanog alfa-2b interferona, karakterizirana time da ima veličinu od 3218 baznih parova (bp) i sastoji se od sljedećih fragmenata: niz od 1 do 176 nukleotida (bp) uključuje fragment DNA od 176 bp koja sadrži promotor triptofana (P trp), niz od 177 do 194 bp. uključuje sintetski fragment DNA od 18 bp koji sadrži Shine Delgarno sekvencu odgovornu za pokretanje prevođenja, slijed od 195 do 695 nt. uključuje DNK fragment od 501 bp koji sadrži gen interferona alfa-2b s nukleotidnim supstitucijama: 37 (A\u003e C), 39 (G\u003e T), 40 (A\u003e C), 42 (G\u003e T), 67 ( A\u003e C), 69 (G\u003e T), 70 (A\u003e C), 72 (A\u003e T), 96 (G\u003e A), 100 (A\u003e C), 102 (A\u003e T), 114 (A \u003e C), 120 (C\u003e G), 126 (G\u003e A), 129 (G\u003e A), 330 (C\u003e G), 339 (G\u003e A), 342 (G\u003e A), 487 (A\u003e C), 489 (A\u003e T), 495 (G\u003e A), slijed od 696 do 713 n. uključuje sintetski fragment DNA od 18 bp koji sadrži sintetski polilinker, slijed od 714 do 1138 bp. uključuje DNK fragment plazmida pKK223-3 od 4129 do 4553 nt. veličina 425 bp, koja sadrži niz strogog terminatora transkripcije rrnBT 1 T 2, slijed od 1139 do 1229 nt. uključuje DNK fragment plazmida pUC19 od 2487 do 2577 nt. veličine 91 bp, koji sadrži promotor gena β-laktozaza (otpornost gena na ampicilin -AmpR), slijed od 1230 do 2045 nt. uključuje DNK fragment plazmida pUC4K sa 720 nt. do 1535. god veličine 816 bp, koja sadrži strukturno područje gena kan, niz od 2046 bp. do 3218. n. uključuje DNK fragment plazmida pUC19 od 1625 do 453 nt. veličine 1173 bp, koja sadrži slijed odgovoran za replikaciju plazmida (ori) i lac-promotora (P lac).

2. Bakterijski soj Eschcerichia coli SX50 transformiran s rekombinantnim plazmidom u skladu s patentnim zahtjevom 1 - proizvođač rekombinantnog humanog leukocita interferona alfa-2b.

3. Postupak dobivanja humanog interferona alfa-2b, uključujući kultivaciju soja Escherichia coli SX5 prema zahtjevu 2 u hranjivom mediju uz konstantno dodavanje hranjivih supstrata tijekom biosinteze, mehaničko uništavanje stanica mikroorganizma pri tlaku od 700-900 bara, otapanje interferona u pufernoj otopini guanidin hidroklorida , renaturacija interferona u fiziološkim puferskim otopinama u prisutnosti chaotropic agensa, trostupanjsko kromatografsko pročišćavanje interferona na helirajuće sefarozne smole brzog toka imobiliziranih s ionima Cu +2, ionsko-izmjenjivačka kromatografija na ionski izmjenjivačkim smolama tipa CM Sepharose Fast Flow i gel filtracijska kromatografija na Superdex 75 smolama ...

4. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time da se kultivacija vrši na hranjivom mediju sa smanjenim sadržajem triptofana uz kontinuirano dodavanje hranjivih supstrata, poželjno glukoze i ekstrakta kvasca.

5. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time da se prije otapanja interferona pročišćava uklanjanjem rastvorljivih staničnih komponenti, uključujući DNK, RNK, proteine, lipopolisaharide, ispiranjem puferskim otopinama koje sadrže deterdžente poput Triton XI 00, ureje.

6. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 3, naznačen time što se nakon svakog kromatografskog pročišćavanja vrši sterilizacija filtracijom kroz filtere veličine veličine 0,22 µm.