Salute dei bambini Tutto sui farmaci che cos'è l'interferone alfa 2b umano

In studi clinici condotti a ampio spettro. Indicazioni e con una grande gamma di dose (da 6 milioni di IU / m2 a settimana - con leucemia a celle a livello tempistica; fino a 100 milioni di IU / m2 a settimana - con melanoma) I fenomeni indesiderati più comunemente che si verificano erano febbre, fatica, mal di testa, Malegy. La febbre e la fatica hanno avuto luogo 72 ore dopo la cessazione del farmaco. Sebbene la febbre possa essere uno dei sintomi della sindrome di influenza, che si verificano spesso nel trattamento degli interferoni, dovrebbe essere esaminato per escludere gli altri possibili ragioni febbre persistente.
Il profilo di sicurezza di seguito è stato ottenuto durante il 4 studi clinici Nei pazienti con epatite c cronica ottenendo introno e sotto forma di monoterapia o in combinazione con ribavirina per 1 anno. Tutti i pazienti hanno ricevuto 3 milioni di metroppo e 3 volte a settimana.
La Tabella 2 mostra i fenomeni indesiderati annotati con una frequenza di maggiore o uguale al 10% nei pazienti precedentemente non trattati e ottenuti introna A (o introna A in combinazione con ribavirina) entro 1 anno. Fondamentalmente, i fenomeni indesiderati annotati erano leggeri o moderatamente pronunciati.
Tavolo 2.

Fenomeni indesiderati	Introne A (n \u003d 806)	Introna A + Ribavirin (n \u003d 1010)
Reazioni locali
Reazioni infiammatorie al sito di iniezione	9–16%	6–17%
Altre reazioni al sito di iniezione	5–8%	3–36%
Reazioni generali
Mal di testa	51–64%	48–64%
Fatica	42–79%	43–68%
Brividi	15–39%	19–41%
Febbre	29–39%	29–41%
Influenzando la sindrome	19–37%	18–29%
Astenia	9–30%	9–30%
Riducendo il peso corporeo	6–11%	9–19%
Reazioni dal gastrointestinale
Nausea	18–31%	25–44%
Anoressia	14–19%	19–26%
Diarrea	12–22%	13–18%
Mal di stomaco	9–17%	9–14%
Vomot.	3–10%	6–10%
Reazioni dal sistema muscolare tettonico
Malgy	41–61%	30–62%
Arthralgia.	25–31%	21–29%
Dolore alle ossa e ai muscoli	15–20%	11–20%
Reazioni CNS.
Depressione	16–36%	25–34%
Irritabilità	13–27%	18–34%
Insonnia	21–28%	33–41%
Ansia	8–12%	8–16%
Interruzione della capacità di concentrare l'attenzione	8–14%	9–21%
Labilità emotiva	8–14%	5–11%
Reazioni cutanee
Alopecia	22–31%	26–32%
Prurito	6–9%	18–37%
Pelle secca	5–8%	5–7%
Eruzione cutanea	10–21%	15–24%
Reazioni respiratorie
Faringite	3–7%	7–13%
Tosse	3–7%	8–11%
Dispenere	2–9%	10–22%
Altri
Vertigini	8–18%	10–22%
Infezione virale	0–7%	3–10%

I fenomeni indesiderati osservati in pazienti con epatite C virale corrispondono a coloro che sono stati rilevati quando si utilizzano un introne secondo altre indicazioni con un aumento della dose-dipendente della frequenza di sviluppo.
Quando si utilizza Intron e per altre indicazioni (in studi clinici e esterni) raramente (| 1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Dal corpo nel suo complesso.Molto raramente - gonfiore del viso.
Sono stati riportati gli stati astentici (astenia, malessere e affaticamento), disidratazione, battito cardiaco, psoriasi, infezione fungina e infezione batterica (compresa la sepsi).
Dal sistema immunitario.Molto raramente - sarcoidosi o la sua esacerbazione.
Quando si applica alfa interferonov, è stato riportato lo sviluppo di vari sistemi di disturbi immunitari autoimmuni e mediati, nel PC di PURPURA trombocitopenico idiopatico o trombotico, è stato segnalato, artrite reumatoide, Lupus rosso sistemico, vasculite e sindrome da fohta-koanagi-harada.
Ci sono stati segnalati su casi di reazioni acute di ipersensibilità, tra cui orticaria, angioedema edema allergico e anafilassi.
Da lato. di sistema cardio-vascolare: raramente - aritmia (di solito si è verificata in pazienti con malattie precedenti del sistema cardiovascolare nella storia o con la precedente terapia cardioxica), cardiomiopatia transitoria (marcata in pazienti senza anamnesi gravate dal sistema cardiovascolare); Ipotensione arteriosa molto raramente, ischemia miocardica e infarto del miocardico.
Dal CNS e dal sistema nervoso periferico.Raramente - inclinazioni suicidali; Molto raramente - comportamento aggressivo, nel PM rivolto ad altre persone, tentativi suicidi, suicidio, psicosi (nella PM Hallucinazione), violazione della coscienza, neuropatia, polneuropopatia, encefalopatia, ischemia cerebrovascolare, emorragia cerebrovascolare, neuropatia periferica, convulsioni.
Dal lato del corpo uditivo.Molto raramente - Impairment udito.
Dal sistema endocrino.Raramente - diabete, peggioramento del flusso di diabete disponibile.
Dalla testa del gastrointestinaleMolto raramente - pancreatite, un aumento dell'appetito, sanguinando le gengive, la colite.
Dal lato del fegato e del tratto biliare.Molto raramente - epatotossicità (in PM con esito fatale).
Cambia da denti e parodonta. Nei pazienti che ricevono la terapia combinata nitrone A e ribavirina, c'erano cambiamenti patologici da denti e parodonta. La secchezza in bocca con terapia combinata a lungo termine con ribavirina e introno a può contribuire a danno ai denti e alla membrana mucosa della cavità orale. I pazienti devono lavarsi i denti con un pennello 2 volte al giorno e passare regolarmente l'ispezione dal dentista. Inoltre, alcuni pazienti possono osservare il vomito.
Dal metabolismo.Raramente - iperglicemia, ipertritrigyceridemia.
Sul lato del sistema muscoloscheletrico.Raramente - rabomiolesi (a volte pesante), crampi nelle gambe, dolore nella parte posteriore, la mia somma.
Dal lato della pelle.Molto raramente - eritema multiforme, sindrome di Stevens-Johnson, necroliz epidermico tossico, necrosi al sito di iniezione.
Dal sistema respiratorio.Raramente - polmonite; Molto raramente - infiltrati polmonari, pneumoniti.
Dal sistema urinario.Sindrome nefrotico molto raramente, funzione renale compromessa, insufficienza renale.
Dal lato del sistema di formazione del sangue.Molto raramente quando si utilizzano introno e sotto forma di monoterapia o in combinazione con ribavirina, anemia aplastica e aplasia completa del midollo osseo rosso sono stati segnati.
Dal corpo della visione.Raramente - emorragia nella retina, modifiche focali DNA dell'occhio, arterie trombosi e vene retiniche, riduzione dell'acuità visiva, riducendo i campi di visione, neurite il nervo visivo, il gonfiore del nervo ottico.
Clinicamente cambiamenti significativi Indicatori di laboratorio.(Era più spesso notato quando il farmaco è prescritto in dosi di oltre 10 milioni di me / giorno) è una diminuzione del numero di granulociti e leucociti, una diminuzione del livello di emoglobina e il numero di piastrine, un aumento del Attività del SFF, LDH, il livello di creatinina e azoto dell'urea del siero del sangue. L'aumento dell'attività dell'alt e dell'agire nel plasma del sangue è notato come patologico quando applicato in tutte le indicazioni, ad eccezione dell'epatite, nonché in alcuni pazienti con epatite B cronica in assenza di DNA HBV.
Se durante l'uso di introni e secondo qualsiasi indicazione, si sviluppano fenomeni indesiderati, una dose dovrebbe essere ridotta o interrompere temporaneamente il trattamento fino a eliminare i fenomeni indesiderati. Se la costante o la re-intolleranza si sta sviluppando quando si applica un regime di dosaggio adeguato o una malattia progressiva, la terapia di introno e dovrebbe essere annullata.

• Farmacologia clinica

  Effetto farmacologico - Antiviral, antitrumore e immunomodulatore.

  È una proteina ricombinante altamente purificata con un peso molecolare di 19.300 Dalton. Ricevuto da un clone di E. coli mediante ibridazione dei batteri plasmidi con il genoma dei leucociti umani che codificano la sintesi dell'interferone. A differenza dell'interferone ALFA-2A ha arginina in posizione 23. Ha un effetto antivirale, che è dovuto all'interazione con specifici recettori a membrana e l'induzione della sintesi dell'RNA e in definitiva proteine. Quest'ultimo a sua volta impedirà la normale riproduzione del virus o del suo rilascio. Ha un'attività immunomodulatoria, che è associata all'attivazione di fagocitosi, stimolando la formazione di anticorpi e linfokinov. Ha un effetto antiproliferativo sulle cellule tumorali.

  • Pharmacokinetics.

    A / m, il 70% entra nel flusso sanguigno sistemico. Biotransformato principalmente nei reni e in leggera laurea nel fegato. Interferone Alpha-2b è escreto dal corpo dai reni.

• Indicazioni per l'uso
  • Epatite B. cronica B.
  • Epatite cronica c.
  • Micaosi del fungo.
  • Linfosarcoma a cellule T primario.
  • Leucemia cella pelosa.
  • Malattia del mieloma (forme generalizzate).
  • Mieloomicosi cronica.
  • Melanoma maligno.
  • Cancro della vescica (situato in posizione superficiale).
  • Carcinoma delle cellule basali.
  • Condonatosi appuntita.
  • Sarcoma caposhi (compreso l'AIDS).
  • Linfoma non Hodgkinsky (come parte della terapia combinata).

• Metodo di applicazione e dose

  Individuo, a seconda della testimonianza e del regime di trattamento.

  • Con leucemia pelosa

    Gli adulti in / m o P / K vengono introdotti 2 milioni di metri / m 2 3 volte a settimana.

  • Con il sarcoma caposhi

    30 milioni di metri / m 2 33 a Ned.

• Controindicazioni
  • Malattie cardiovascolari pesanti.
  • Disturbi pesanti di fegato e renale.
  • Epilessia e / o gravi disturbi funzionali del CNS.
  • Epatite cronica con la minaccia della cirrosi del fegato.
  • Malattia del fegato nella fase di decompensazione.
  • Epatite cronica sullo sfondo o dopo la terapia precedente con immunosoppressori (ad eccezione dello stato dopo la cancellazione della terapia a breve termine con corticosteroidi).
  • Epatite autimmune.
  • Malattie autoimmuni nella storia.
  • Destinatari del trapianto nello stato di immunosoppressione.
  • Malattie precedenti ghiandola tiroidea.
  • Aumento della sensibilità all'interferone alfa-2b.

• Applicazione durante la gravidanza e nel periodo di allattamento al seno

  L'applicazione durante la gravidanza è possibile nei casi in cui il beneficio previsto per la madre supera il potenziale rischio per il feto. Le donne di età parziale durante l'applicazione di Interferon Alpha-2B dovrebbero essere utilizzate metodi affidabili di contraccezione.

  Se necessario, utilizzare durante il periodo di allattamento deve essere risolto allattamento al seno.

• Interazione

  Gli interferoni possono migliorare l'effetto neurotossico, mielotossico o cardioxico dei farmaci che sono stati prescritti prima o simultaneamente con loro.

• Condizioni speciali

  Non dovrebbe essere usato nei pazienti con disordini mentali Nella storia. Attenzione è utilizzata in pazienti con malattie polmonari nella storia (inclusa con malattia polmonare ostruttiva cronica), con diabete mellito con una tendenza alla chetoacidosi, aumento della coagulazione del sangue (incl. Con tromboflebite e tromboembolismo dell'arteria polmonare nella storia), stati di gravi mielodepressi.

  Prima di iniziare e sistematicamente durante il trattamento, la funzione del fegato dovrebbe essere monitorata, il modello di sangue periferico, indicatori biochimici del sangue, creatinina. Durante il periodo di trattamento, dovrebbe essere eseguita un'idratazione adeguata. Nei pazienti con epatite c cronica Durante il periodo di trattamento, è necessario monitorare il livello di ormone tirotropico.

  Nell'epatite B cronica B, accompagnata da una diminuzione della funzione del fegato sintetico (che si manifesta in una diminuzione del livello di albumina o in aumento del tempo di protrombina), dovrebbero essere valutati i benefici attesi possibile rischio Terapia. L'applicazione con la psoriasi di accompagnamento è giustificata nei casi in cui il beneficio atteso della terapia supera il potenziale rischio. Con diabete di accompagnamento o ipertensione arteriosa prima di iniziare e durante il periodo di trattamento, è necessario un esame oculistico. Quando si indica una storia di insufficienza cardiaca cronica, infarto miocardico e / o precedenti o aritmie esistenti, il trattamento di interferone alfa-2b deve essere eseguito sotto il rigoroso controllo del medico.

  • Impatto sulla capacità di guidare i veicoli e i meccanismi di controllo

    L'effetto sulla capacità di guidare veicoli e gestione dei meccanismi all'inizio della terapia dovrebbe essere rifrandito da potenzialmente specie pericolose Attività che richiedono una maggiore attenzione, rapide reazioni psicomotorie, fino ad un periodo di stabilizzazione dell'interferone ALFA-2B.

  Interferone Alpha-2b sotto forma di una soluzione di iniezione e iniezione iniezione è inclusa nell'elenco LVLS.

Forma di rilascio, composizione e imballaggio

Iniezione Trasparente, incolore.

Eccipienti:

0,5 ml - Ampoules (5) - Confezione cella di imballaggio (1) - Pacchetti in cartone.
0,5 ml - fiale (5) - Confezione cella di imballaggio (2) - cartone putre.
0,5 ml - Fials (1) - Pacchetti in cartone.
0,5 ml - Fials (5) - Confezione cella per imballaggio (1) - Pacchetti in cartone.
0,5 ml - Syrings in vetro (1) - Confezionamento cella contorno (1) - Pacchetti in cartone.
0,5 ml - Siringhe di vetro (1) - Confezione cella di imballaggio (3) - Pacchetti di cartone.
0,5 ml - Syrings in vetro (3) - Confezione cella di imballaggio (1) - Pacchetti in cartone.
0,5 ml - Syrings in vetro (3) - Confezione cella di imballaggio (3) - Pacchetti di cartone.

Iniezione Trasparente, incolore.

Eccipienti: Acetato di sodio, cloruro di sodio, sale diodatrice di acido tetraacetico etilendiammina, Twin-80, Destran 40, acqua d / e.

1 ml - Ampoules (5) - Confezionamento cella contorno (1) - Pacchetti in cartone.
1 ml - Ampoules (5) - Confezionamento cella contorno (2) - Pacchetti in cartone.
1 ml - Bottiglie (1) - Pacchetti in cartone.
1 ml - flaconcini (5) - Confezione cella contorno (1) - Pacchetti in cartone.
1 ml - Syrings in vetro (1) - Confezione cella per imballaggio (1) - Pacchetti in cartone.
1 ml - Syrings di vetro (1) - Confezione cella di imballaggio (3) - Pacchetti in cartone.
1 ml - Syrings in vetro (3) - Confezione cella di imballaggio (1) - Pacchetti in cartone.
1 ml - Syrings in vetro (3) - Contour cella di imballaggio (3) - Pacchetti in cartone.

Gruppo clinico e farmacologico

Interferone. Antitumore, antiviralico e farmaco immunomodulatore

Effetto farmacologico

Interferone. ALTEVIR ® ha un effetto antivirale, immunomodulatore antiproliferativo e antitrumore.

Interferone alfa-2b, interagendo con recettori specifici sulla superficie cellulare, avvia un circuito complesso di cambiamenti all'interno della cella, che include l'induzione della sintesi di un numero di specifiche citochine ed enzimi, interrompe la sintesi dell'RNA virale e delle proteine \u200b\u200bdel virus nella cella. Il risultato di tali modifiche è un'attività antivirale e antiproliferativa non specifica associata alla prevenzione della replica del virus nella cella, la frenata della proliferazione cellulare e l'effetto immunomodulatore dell'interferone. Interferone ALFA-2B stimola il processo di presentazione delle cellule immunocompetenti antigene, ha la capacità di stimolare l'attività fagocitica dei macrofagi, nonché l'attività citotossica delle cellule T e "" I killer naturali "" coinvolti nell'immunità antivirale.

Previene la proliferazione cellulare, in particolare il tumore. Ha un effetto inibitorio sulla sintesi di alcuni oncogeni, portando a inibire la crescita del tumore.

Pharmacokinetics.

Aspirazione

Con una somministrazione P / C o per / m di Interferon Alpha-2b, la sua biodisponibilità varia dall'80% al 100%. Dopo la somministrazione di interferone alfa-2b T Max nel plasma sanguigno è di 4-12 ore, t 1/2 - 2-6 ore dopo 16-24 ore dopo l'amministrazione, l'interferone ricombinante nel siero non è determinato.

Metabolismo

Il metabolismo viene effettuato nel fegato.

Gli interferoni alfa sono in grado di violare i processi metabolici ossidativi, riducendo l'attività degli enzimi del fegato microsomal del sistema del citocromo P450.

Elezione

È escreto principalmente dai reni dalla filtrazione glomerulare.

Indicazioni per l'uso del farmaco

Come una parte terapia complessa Negli adulti:

- con epatite virale cronica B senza segni di cirrosi del fegato;

- con epatite c cronica virale c in assenza di sintomi insufficienza epatica (monoterapia o terapia combinata con ribavirina);

- con papillomatosi della laringe;

- con capitale a punta;

- Con leucemia ad alta confusione, mielolomicosi cronica, linfoma non-khigkinsky, melanoma, mieloma multiplo, Caposhi Sarcoma sullo sfondo dell'AIDS, carcinoma del rene progressivo.

Modalità di dosaggio

Applicare n / k, in / m e in / c. Il trattamento deve essere avviato da un medico. Successivamente, con il permesso di un medico, il paziente può introdurre una dose di supporto da sola (nei casi in cui il farmaco è assegnato a P / C o V / M).

Epatite cronica in: Altevir ® viene introdotto P / C o V / M in una dose di 5-10 milioni di me 3 volte a settimana per 16-24 settimane. Il trattamento è terminato dopo 3-4 mesi di utilizzo in assenza di dinamiche positive (secondo lo studio del DNA del virus dell'epatite B).

Epatite cronica C: Altevir ® viene introdotto P / C o V / M ad una dose di 3 milioni di me 3 volte a settimana per 24-48 settimane. Nei pazienti con il corso ricorrente della malattia e dei pazienti che precedentemente non hanno ricevuto da Interferon Alpha-2b, l'efficacia del trattamento aumenta con la terapia combinata con ribavirina. La durata della terapia combinata è di almeno 24 settimane. La terapia altevir deve essere eseguita entro 48 settimane con pazienti con epatite c cronica e 1 ° genotipo di un virus di carico virale elevato, che, entro la fine delle prime 24 settimane di trattamento nel siero, l'RNA del virus dell'epatite c non è determinato .

Papillomatosi Lastani: AlteeVir ® viene introdotto in una dose di 3 milioni di me / m 2 3 volte a settimana. Il trattamento inizia dopo la rimozione chirurgica (o laser) del tessuto tumorale. La dose è selezionata tenendo conto della tolleranza del farmaco. Raggiungere una risposta positiva potrebbe richiedere un trattamento per 6 mesi.

Leucemia ad alta mungitura: La dose raccomandata di altevir per l'amministrazione P / K ai pazienti dopo la splenectomia o senza che sia 2 milioni me / m 2 3 volte a settimana. Nella maggior parte dei casi, la normalizzazione di uno e più indicatori ematologici si verifica dopo 1-2 mesi di trattamento, è possibile aumentare i tempi del trattamento a 6 mesi. Questa modalità di dosaggio dovrebbe essere aderire a costantemente se non si verifica la progressione rapida della malattia o il verificarsi di sintomi di grave intolleranza al farmaco.

Myelomicosis cronica: La dose raccomandata di altevir come monoterapia - 4-5 milioni di me / m 2 al giorno P / K quotidianamente. Per mantenere il numero di leucociti, potrebbe essere necessario utilizzare in una dose di 0,5-10 milioni di me / m 2. Se il trattamento consente di controllare il numero di leucociti, quindi per mantenere la remissione ematologica, il farmaco deve essere utilizzato nella dose portatile massima (4-10 milioni di me / m 2 al giorno). Il farmaco deve essere annullato in 8-12 settimane, se la terapia non ha portato alla parziale remissione ematologica o una diminuzione clinicamente significativa del numero di leucociti.

Linfoma non Hodgkin: Altevir ® è usato come terapia adiuvante in combinazione con schemi di chemioterapia standard. Il farmaco è introdotto in una dose di 5 milioni di me / m 2 3 volte a settimana entro 2-3 mesi. La dose deve essere regolata a seconda della tollerabilità del farmaco.

Melanoma: Altevir ® è usato come terapia adiuvante con un alto rischio di ricorrenza negli adulti dopo aver rimosso il tumore. Altevir ® è introdotto in / c ad una dose di 15 milioni di me / m 2 5 volte a settimana per 4 settimane, quindi P / K ad una dose di 10 milioni di me / m 2 3 volte a settimana per 48 settimane. La dose deve essere regolata a seconda della tollerabilità del farmaco.

Mieloma multiplo: Alterevir ® è prescritto durante il periodo di remissione sostenibile a una dose di 3 milioni di me / m 2 3 volte a settimana p / k.

Sarcoma Caposhi sullo sfondo dell'AIDS: La dose ottimale non è installata. Il farmaco può essere applicato in dosi di 10-12 milioni di me / m 2 / giorno p / k o in / m. In caso di stabilizzazione della malattia o della risposta al trattamento, la terapia continua fino a quando non verrà presa la regressione del tumore o l'abolizione del farmaco non sarà presa.

Cancro del rene:lo schema ottimale della dose e dell'applicazione non è installato. Si consiglia di applicare il farmaco P / C in dosi da 3 a 10 milioni di me / m 2 3 volte a settimana.

Preparazione di una soluzione per l'amministrazione in / in

Il volume della soluzione alterevir sta guadagnando, necessario per la preparazione della dose desiderata, viene aggiunto a 100 ml di una soluzione di sodio sterile dello 0,9% di cloruro e amministrata per 20 minuti.

Effetto collaterale

Reazioni generali: Molto spesso - febbre, debolezza (sono reazioni dipendenti dalla dose e reversibile, scompaiono entro 72 ore dopo una pausa nel trattamento o sulla cessazione), brividi; Meno spesso - malessere.

Dal CNS: Molto spesso - mal di testa; meno spesso - astenia, sonnolenza, vertigini, irritabilità, insonnia, depressione, pensieri e tentativi suicidi; Raramente - nervosismo, ansia.

Sul lato del sistema muscoloscheletrico: Molto spesso - Malegy; Meno spesso - Arthralgia.

Dal sistema digestivo:molto spesso - diminuzione dell'appetito, nausea; meno spesso - vomito, diarrea, bocca secca, cambiamento nel gusto; raramente - dolore addominale, dispepsia; Forse un aumento reversibile dell'attività degli enzimi epatici.

Dal lato del sistema cardiovascolare: Spesso - diminuzione della pressione sanguigna; Raramente - tachicardia.

Reazioni dermatologiche: meno spesso - alopecia, maggiore sudorazione; Raramente - eruzione cutanea, prurito della pelle.

Dal sistema ematopoietico: Leucopenia reversibile, granulocyptopenia, riduzione dei livelli di emoglobina, la trombocitopenia è possibile.

Altri: Raramente - una diminuzione del peso corporeo, tiroidite autoimmune.

Controindicazioni per l'uso del farmaco

- gravi malattie cardiovascolari nella cronologia (insufficienza cardiaca cronica incontrollata, infarto miocardico recentemente trasferito, gravi disturbi della frequenza cardiaca);

- insufficienza renale e / o epatica grave (incl. causata dalla presenza di metastasi);

- Epilessia, nonché gravi violazioni delle funzioni del CNS, particolarmente espresse dalla depressione, dai pensieri e dai tentativi suicidi (compresa la storia);

- epatite cronica con cirrosi decompesata del fegato e nei pazienti che ricevono o recentemente trattati con immunosoppressori (ad eccezione del completamento accoppiamento a breve termine del trattamento GCS);

- epatite autoimmune o altro una malattia autoimmune.;

- trattamento con immunosoppressori dopo il trapianto;

- la malattia della ghiandola tiroidea, non controllata dai metodi terapeutici generalmente accettati;

- malattie polmonari decompesate (compresa la BPCO);

- diabete decompesato;

- ipercoagulazione (compresa tromboflebite, tromboembolia dell'arteria polmonare);

- pronunciato myelodepression;

- gravidanza;

- Periodo di allattamento (allattamento al seno);

— aumento della sensibilità Alle componenti del farmaco.

Applicazione del farmaco durante l'allattamento al seno e al seno

Il farmaco è controindicato in gravidanza e durante l'allattamento (allattamento al seno).

Applicazione con violazioni della funzione epatica

Applicazione con violazioni della funzione renale

Il farmaco è controindicato in grave insufficienza renale e / o epatica (incl. Causata dalla presenza di metastasi).

istruzioni speciali

Prima del trattamento di alterevir cronico epatite virale Si raccomanda di condurre una biopsia del fegato per valutare il grado di danno del fegato (segni di processo infiammatorio attivo e / o fibrosi). L'efficacia del trattamento dell'epatite c cronica è in aumento nella terapia combinata con altevir e ribavirina. L'uso di alterira non è efficace nello sviluppo di una cirrosi epatica decompesata o coma epatico.

In caso di effetti collaterali durante il trattamento con dose altevir del farmaco, dovrebbe essere ridotto del 50% o annullare temporaneamente il farmaco prima della loro scomparsa. Se un effetti collaterali La cessione o si verificano di nuovo dopo una diminuzione della dose, o viene osservata la progressione della malattia, il trattamento dell'altereviro dovrebbe essere interrotto.

Quando un livello piastrinico diminuisce sotto i livelli di 50x10 9 / l o dei granulociti inferiori a 0,75x10 9 / l, una diminuzione della dose di altevir è raccomandata 2 volte con il controllo del test del sangue dopo 1 settimana. Se le modifiche specificate vengono salvate, il farmaco deve essere annullato.

Quando un livello piastrinico diminuisce sotto i livelli di 25x10 9 / l o dei granulociti inferiori a 0,5 x 10 9 / l, si consiglia l'abolizione del farmaco alterevir ® con il controllo del test del sangue dopo la 1 settimana.

Nei pazienti che ricevono preparati interferoni alfa-2b, gli anticorpi neutralizzano la sua attività antivirale possono essere determinati nel siero. In quasi tutti i casi, i titoli degli anticorpi sono bassi, il loro aspetto non porta a una diminuzione dell'efficacia del trattamento o di altre violazioni autoimmune.

Overdose

I dati sull'overdose del farmaco Alteevir ® non sono forniti.

Interazione medicinale

L'interazione medicinale tra alterevir e altri farmaci non è completamente studiata. Attenzione dovrebbe essere utilizzata altevir ® contemporaneamente con sonniferi e sedativi, analgesici narcotici e farmaci che influenzano potenzialmente l'effetto mielodeprescissione.

Con lo scopo simultaneo di Alterevir e Theofillin, deve essere monitorata la concentrazione di quest'ultima nel siero del sangue e, se necessario, cambia la sua modalità di dosaggio.

Quando si utilizza Alterevira in combinazione con i preparati chemioterapici (citarabina, ciclofosfamide, doxorubicina, cella ombreggiata) aumenta il rischio di effetti tossici.

Condizioni di vacanza da farmacie

Il farmaco è rilasciato dalla prescrizione.

Termini e termini di archiviazione

Il farmaco dovrebbe essere conservato in un luogo inaccessibile per i bambini, in conformità con la joint venture 3.3.2-1248-03 ad una temperatura da 2 ° a 8 ° C; Non congelare. Vita di conservazione - 18 mesi.

Trasporto a temperature da 2 ° a 8 ° C; Non congelare.

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L'invenzione riguarda l'ingegneria genetica, la biotecnologia, la medicina, la farmacologia. Il nuovo PSX50 PSX50 multicopico ricombinante PSX50, che codifica la sintesi del leucocita alfa-2b dell'Interferone di una persona, l'espressione di cui è sotto il controllo dei promotori del lattosio e del triptofano e del terminatore di trascrizione. Come risultato della trasformazione delle cellule del detentore del destinatario E. Coli BL21, il DNA Plashid-PSX50 ricombinante è stato ottenuto dal ceppo E. coli SX50 - il produttore del leucocita ricombinante alpha-2b di interferone umano con produttività a 0.9-1.0 g Interferone alpha-2b con 1 l di mezzi di cultura. Il metodo per ottenere interferone ricombinante alfa-2b si basa sull'uso del ceppo ricombinante creato E. coli SX50 e fornendo la sua profonda coltivazione su un supporto nutriente con un contenuto ridotto del triptofano nell'aggiunta continua dei substrati nutrienti nel processo di biosintesi , distruzione meccanica delle cellule di microrganismo ad alta pressione, dissolving della proteina aggregata in soluzione concentrata della guanidina cloridrato, seguita dalla rinatura del interferone in soluzioni di buffer fisiologica in presenza di agenti hotopic e della sua pulizia utilizzando una pulizia cromatografica a tre stadi di interferone su chelating safarose Resine a flusso veloce, Iobilizzato Cu +2 Ion, Chromatografia di scambio ionico sulle resine dello scambio ionico di tipo Sephsrose Flow Flow e Gel SuperDex 75 Tipo di cromatografia filtrazione. Il metodo consente di ottenere una sostanza interferone superiore al 99% della purezza in base ai dati dell'elettroforesi Riduzione e sicurezza non conforme Pensando con Gels argento e oltre il 98% secondo RF HPLC e non-Pyrogens (LAL-Test) in quantità di almeno 400-800 mg con 1 l di mezzi di cultura. 3n. e 3 zp ffs, 6 yl.

Immagini al brevetto brevettato 2242516

L'invenzione riguarda l'ingegneria genetica preparati medicinaliottenuto dalla biotecnologia, in particolare per i metodi di produzione industriale ricombinante leukocyte Interferon. Alpha-2b Person prescrizione medicale (di seguito interferone), così come ai ceppi ricombinanti di prodotti da Escherichia Coli (E. coli) e DNA plasmidico che codificano la sintesi dell'interferone.

Gli interferoni sono molecole proteiche con un peso molecolare da 15.000 a 21.000 Daltons, prodotti e secreti da cellule in risposta a infezione virale O altri agenti patogeni. Tre gruppi interferon principali si distinguono: alfa, beta e gamma. Questi stessi gruppi non sono omogenei e possono contenere diverse varietà molecolari di interferone. Pertanto, più di 14 varietà genetiche di Interferon Alpha, che sono di interesse e sono ampiamente utilizzate in medicina come fondi antivirali, antiproliferativi e immunomodulatori.

Sono noti metodi per ottenere un interferone di leucociti da un interferone di leucociti da leucociti. donor Blood. Una persona indotta da virus e altri induttori (SU1713591, RU 2066188).

Il principale svantaggio di questi metodi per ottenere interferone è la probabilità di contaminazione del prodotto finale da parte dei virus umani, come il virus dell'epatite B e C, il virus dell'immunodeficienza, ecc.

Attualmente, il metodo per ottenere la sintesi microbiologica Interferone è riconosciuta più promettente, che fornisce la possibilità di ottenere un prodotto target con una resa molto più elevata da un allestimento di allestimento relativamente economico. Gli approcci utilizzati sono ottimale per le opzioni di espressione batterica per i geni strutturali, nonché elementi normativi che controllano l'espressione.

I microrganismi iniziali usano vari disegni di ceppi di Pichia Pastoris, Pseudomonas Putida ed Escherichia coli.

Lo svantaggio dell'uso di P. Pastoris come produttore di interferone (JN Garcia, Ja Aguiar et. Al. // Elevata espressione di umana IFN-2B in Pichia Pastoris.//biotecnologia APLICADA, 12 (3), 152-155, 1995), sono condizioni estremamente complesse per la fermentazione di questo tipo di lievito, la necessità di mantenere rigorosamente la concentrazione dell'induttore, in particolare il metanolo, nel processo di biosintesi. Lo svantaggio dell'utilizzo dei ceppi PS. PUTIDA (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) è la complessità del processo di fermentazione a basso livello di espressione (10 mg di interferone per 1 litro di media media). Più produttivo è l'uso di ceppi ESCHERICHIA Coli (Semin. Oncol, 1997, IUN, 24 (3 supplezione 9): S9-41-S9-51).

Un gran numero di plasmidi e creato sulla loro base E. coli ceppi che esprimono interferone: ceppi E. coli ATCC 31633 e 31644 con Plasmids Z-PBR322 (PSTI) HCLF-11-206 o Z-PBR 322 (PSTL) / HCLN SN 35 -HL6 (SU 1764515), E. Coli Pinf-AP2 Dressione (SU 1312961), E. Coli Pinf- F-PA Diection (AU 1312962), E.Coli SG 20050 Dressione con Plashid P280 / 21FN (Kravchenko VV et al. Chimica Bioorganica, 1987, Vol.13, No. 9, P.1186-1193), E.Coli SG 20050 Striscio con Plasmid Pinf14 (SU 1703691), E.Coli SG 20050 Dressioni con Plasmid Pinf16 (RU 2054041) e Dr. La mancanza di tecnologie basate sull'uso di questi ceppi è la loro instabilità, nonché un livello insufficiente di espressione di interferone.

Insieme alle peculiarità dei ceppi utilizzati, l'efficienza del processo dipende in gran parte dalla separazione e dalla tecnologia di pulizia utilizzata e dalla pulizia dell'interferone.

C'è un metodo per ottenere interferone, che include la coltivazione delle cellule PS. Putida, Distruzione della biomassa, Trattamento in polietiletico, frazionario da ammonio solfato, cromatografia idrofobica sui cromato fenilxyl C-80, frazionamento del pH del lisato, la sua concentrazione e diafiltrazione, cromatografia di scambio ionico sulla cellulosa DE-52, eluizione nel gradiente di pH, scambio ionico cromatografia di L'eluente risultante sulla cellulosa -52, concentrando attraverso la trasmissione attraverso la cassetta del filtro e il filtro del gel su Sephadex G-100 (SU 1640996). Lo svantaggio di questo metodo oltre alla complessa fermentazione multistadio è una multi-stabilità al ricevimento del prodotto finale.

Noto anche è il metodo di ottenere interferone, compresa la coltivazione del ceppo E.Coli SG 20050 / PIF16, nel LB-Broth tra i boccette nello shaker termostato, la centrifugazione della biomassa, il suo lavaggio con una soluzione tampone e l'ultrasuoni di lavorazione a distruggere le cellule. Il lisato ottenuto è centrifugato, lavato con una soluzione 3M di urea nel buffer, sciolto nella soluzione di cloruro della guanidina nel tampone, viene trattato con ultrasuoni, centrifugati, ossidativi sulfitoliz, dialisi contro 8 m urea, renairation e cromatografia finale a due fasi Su cm-52 cellulosa e sephadex G-50 (RU 2054041). Gli svantaggi di questo metodo sono la sua produttività relativamente bassa delle fasi principali del processo di selezione e pulizia. In particolare, ciò si riferisce all'elaborazione ad ultrasuoni del prodotto, della dialisi e del solfatolisi ossidativa, che porta all'instabilità dell'output di interferone, nonché all'impossibilità di utilizzare questo metodo per la produzione industriale di interferone.

Come il più vicino analogico (prototipo), un metodo per ottenere l'interferone di leucociti di una persona può essere indicato nella coltivazione del ceppo ricombinante E. coli, congelando la biomassa ottenuta a una temperatura non superiore a -70 ° C, scongelamento, distruzione di cellule microrganismi di lisozima, rimozione del DNA e dell'RNA introducendo nel lisato di DNA-Aza e la purificazione della forma isolata isolata di interferone lavata con una soluzione tampone con detergenti, dissolvendo l'interferone precipitato in una soluzione di guanidina cloridrato, renaiturazione e Purificazione di un passo della cromatografia dello scambio ionico. E. Colie SS5 Strain, ottenuto utilizzando un plasmide PSS5 ricombinante contenente tre promotori: P Lac, P T7 e PR TRP e gene alfa-interferone con sostituzioni di nucleotide inserite.

L'espressione di interferone di E.Coli SS5 ceppo contenente questo plasmide è controllato da tre promotori: P Lac, P T7 e PRP. Il livello di espressione di interferone è di circa 800 mg per sospensione cellulare (RU 2165455).

Lo svantaggio del metodo è la bassa manutenzione dell'uso della distruzione enzimatica delle cellule, del DNA e dell'RNA del microrganismo e della pulizia cromatografica a un passo di interferone. Ciò causa l'instabilità del processo di assegnazione dell'interferone, porta a una diminuzione della sua qualità e limita la possibilità di utilizzare un dato schema per la produzione industriale di interferone. Gli svantaggi di questo plasmide e sforzo sulla sua base sono l'uso di un forte promotore non regolamentato FAGA T7 nel ceppo E. Coli BL21 (DE3) in cui il Gene del Gene della Polymerase RNA T7 è sotto il promotore dell'operatore LAC e che sempre "scorre". Pertanto, la sintesi dell'interferone si verifica continuamente nella cella, che porta alla dissociazione del plasmide e una diminuzione della redditività delle celle di tensione e di conseguenza, una diminuzione del rilascio dell'interferone.

L'obiettivo della presente invenzione è di progettare un ceppo industriale ricombinante del produttore di E. Coli con un nuovo DNA ricombinante plasmidico con un alto livello di biosintesi interferonale e lo sviluppo di una tecnologia industriale efficace per ottenere una sostanza di interferone a fini medici corrispondenti a La qualità della "Pharmacopoeia europea" per la sostanza di Interferon Alpha-2b.

Questo compito è stato risolto dalla creazione del Plasmid DNA PSX50 ricombinante del Plasmid PSX50 e del ceppo ESCHERICHIA Coli SX50, depositato nella collezione interamente russa di personale industriale dell'impresa di stato federale Gosny Gosny, VKPM IN-8550,

oltre a un metodo per la produzione di interferone alfa-2b ricombinante, basato sull'uso del ceppo ricombinante E. coli SX50 e fornendo la sua profonda coltivazione su un supporto nutriente con un contenuto ridotto del triptofano nell'aggiunta continua di substrati nutrienti nella biosintesi Processo, distruzione meccanica delle cellule di microrganismo ad alta pressione, dissolving dell'Accregata la proteina in una soluzione concentrata di Guanidina cloridrato, seguita da rinaturare dell'interferone in soluzioni di buffer fisiologica in presenza di agenti calopa e pulizia cromatografica a tre stadi di interferone sul chelationing sepharose Resine del flusso veloce, immobilizzate da ioni Cu +2, cromatografia dello scambio ionico sulle resine di scambio ionico di tipo cm Sepharose Flow e filtrazione gel cromatografia su superdex 75 resine.

Secondo l'invenzione, viene proposto un nuovo DNA Plasx-PSX50 multicopico ricombinante, che codifica la sintesi dell'Interferone alpha-2b del leucocyte di una persona la cui espressione è sotto il controllo dei promotori del lattosio e del tripotopan e del terminatore di trascrizione. Il PSX50 Plasmid ha 3218 coppie di base (BP.) Ed è caratterizzato dalla presenza dei seguenti frammenti:

La 2 sequenza nucleotidica del 176 nucleotide (n.) Include un frammento del DNA del 176 p.O., contenente un promotore triptofano (PRP);

Sequenza con 177 n. 194 n. Include un frammento sintetico del DNA di 18 p.O., contenente una sequenza di Shain Delgarino, responsabile per iniziare la trasmissione;

Sequenza con il 195 N. 695 N. Include un frammento del DNA di 501 p., Contenente la sequenza del gene interferone con le seguenti sostituzioni di nucleotidrico: in posizione 37, sostituzione A su c, in posizione 39, la sostituzione G con T, in posizione 40 sostituzione A su C, in Posizione 42 Sostituzione G On T, in posizione 67, Sostituzione A ON C, in posizione 69, la sostituzione G BY T, in posizione 70, sostituzione A su C, in posizione 72, sostituzione A on T, in posizione 96, G BY A, in posizione 100, sostituzione e su C, in posizione 102 Sostituzione A ON T, in posizione 114 Sostituzione A ON C, in posizione 120 Sostituzione con per G, in posizione 126 della sostituzione G da A, in posizione 129 del Sostituzione G AT, IN POSIZIONE 330 Sostituzione con ON G, IN POSIZIONE 339 Sostituzione G AT, IN POSIZIONE 342 Sostituzione G AT, IN POSIZIONE 487 Sostituzione della sostituzione A On C, in posizione 489 Sostituzione A on T, in posizione 495 Sostituzione G in a;

Sequenza con 696 N. 713 N. Include un frammento di DNA sintetico di 18 p. contenente un polylinker sintetico;

Sequenza con 714 n. a 1138 n. Include frammento di DNA Plasmid RSC223-3 con 4129 N. 4553 n. 425 ppm contenente una sequenza di un terminatore di trascrizione rigoroso RRNBT 1 T 2;

Sequenza con 1139 n. 1229 N. Include il frammento del DNA Plasmid PUC19 con 2487 N. 2577 n. 91 BP per dimensione, contenente un promotore di GheNotomasi-OLKTomasi (Gene di resistenza agli ampicillini - AMR R);

Sequenza con 1230 n. a 2045 N. Include frammento PUC4K Plasmid DNA con 720 N. 1535 N. 816 ppm contenente la regione strutturale del gene kan;

Sequenza con 2046 n. 3218 n. Include frammento PUC19 Plasmid DNA da 1625 a 453N. La dimensione di 1173 PN contenente la sequenza responsabile della replica del plasmide (ORI) e del promotore dell'CLAC (PC lac).

Sul fico raffigura schemi di progettazione e mappa fisica del plasmid PSX50.

La figura 6 presenta una sequenza completa di nucleotidi installati per Plasmid PSX50.

Il ceppo Escherichia Coli SX50 è stato ottenuto dalla trasformazione delle cellule ESCHERICHIA Coli BL21 del plasmide PSX50 utilizzando la tradizionale tecnologia di ingegneria genetica. Il ceppo E.Coli SX50 è caratterizzato dalle seguenti funzionalità.

Segni morfologici culturali.

Le cellule sono piccole, dritte, a forma di rotolamento addensato, gram-negativo, doro. Le cellule crescono bene su semplici media nutrienti. Quando cresce sull'agar "Difco" sono formati colonie rotonde, lisce, convesse, fangose, brillanti, grigie, con bordi lisci. Quando si cresce in media liquidi (in un mezzo minimo con glucosio o in brodo Lb), formano una tortura piatta intensa.

Segni fisico-biologici

Aerobe. Gamma di temperature di crescita 4-42 ° C con un pH di 6,5-7,5.

Come fonte di azoto, entrambi sali minerali nelle forme di ammonio e di nitrato e composti organici sotto forma di amminoacidi, peptone, tripton, estratto di lievito, ecc.

Gli aminoacidi, la glicerina, i carboidrati sono usati come fonte di carbonio. Resistenza agli antibiotici. Le cellule stanno esibendo la resistenza alla kanamicina (fino a 100 μg / ml).

Escherichia coli 8x50 ceppo - interferone viola.

Metodo, condizioni e composizione Personale di stoccaggio del mercoledì

A L-Arape con l'aggiunta di Canamicina ad una concentrazione di 20 μg / ml sotto olio, in brodo a l-brodo contenente il 15% di glicerolo e corrispondenti antibiotici nelle fiale ad una temperatura di meno 70 ° C, in uno stato liofilizzato nelle fiale Temperatura più 4 ° C.

Il ceppo di Escherichia Coli SX50 è identificato dal Definifier Berg (1974) come sforzo della forma di Escherichia Coli.

Il metodo della produzione industriale di un interferone alfa-2b

Una caratteristica del metodo proposto è lo sviluppo della tecnologia che consente di allocare interferone da una forma insolubile accumulata durante la fermentazione, il che consente di semplificare significativamente lo schema tecnologico del processo di selezione e aumentare la resa del prodotto di destinazione.

Il metodo sta nella coltivazione della tensione di Escherichia Coli SH50 nel mezzo nutritivo, con una costante aggiunta di substrati nutrienti, preferibilmente l'estratto di glucosio e lievito, nel processo di biosintesi, preferibilmente con un contenuto ridotto di triptofano, distruzione meccanica delle cellule di microrganismo Ad alta pressione 700-900 bar, interferone dissolving nella soluzione cloridrato del buffer hanidina, rimaturazione dell'interferone in soluzioni di buffer fisiologica in presenza di agenti hootropici, seguiti da una pulizia cromatografica a tre stadi dell'interferone sulle resine di flusso rapido safarose chelanti, immobilizzate con Cu +2 ION, Scambio di Ioni Chromatography sulle resine di scambio ionico di tipo cm Sepharose Fast Flow e Gel Filtration Chromatography su SuperDex 75 Resine.

Le condizioni ottimali per la conduzione di singole fasi di ottenere interferone sono le seguenti:

La fermentazione viene eseguita con un'aggiunta continua di substrati durante l'intero processo, che causa alto livello Espressione di interferone;

La distruzione delle cellule viene eseguita nella disintegrazione del tipo Gaulin ad una pressione di 900 bar;

Rimozione di componenti cellulari solubili (DNA, RNA, proteine, lipopolisaccaridi, ecc.) Producono il lavaggio della forma insolubile di interferone con soluzioni tampone contenenti detergenti (tritone XI00, urea, ecc.);

Il precipitato risultante che contiene interferone viene sciolto in una soluzione tampone di 6 m cloridrato di guanidina;

La rimaturazione dell'interferone viene effettuata in una soluzione di buffer fisiologica contenente agenti hootropici;

La pulizia cromatografica a tre stadi dell'Interferone viene effettuata sul flusso rapido di Chelazione Sepharose, immobilizzata da ioni Cu +2, sulla resina di scambio di cazione, vedere la cromatografia della filtrazione del flusso veloce di Sepharose e della filtrazione del gel su un tipo di resina SuperDex 75;

Dopo ogni pulizia cromatografica, il filtro sterilizzante viene eseguito tramite filtri apirogenici con pori di 0,22 μm.

L'output di interferone a seguito dell'uso del metodo descritto è di circa 400-800 mg di interferone con 1 litro di mezzi di cultura. La qualità del prodotto ottenuta è conforme alle norme e ai requisiti di "Pharmacopoeia europea" per la sostanza di Interferon Alpha-2b.

Le differenze essenziali nel metodo proposto dal prototipo sono:

L'uso di un design di tensione con prestazioni più elevate, che consente di ottenere una maggiore quantità di interferone con 1 litro di media media con biosintesi;

L'uso di un'efficace distruzione meccanica della biomassa cellulare, che consente di ottenere un estratto più pulito della forma insolubile di interferone in un tempo più breve, con meno perdita;

L'uso di soluzioni di buffer fisiologica con Renaturation in presenza di agenti hawropic ti consente di aumentare l'output della forma rinatoriale corretta di interferone;

La pulizia cromatografica a tre stadi dell'Interferon consente di ottenere una sostanza interferone di oltre il 99% della purezza in base ai dati dell'elettroforesi in condizioni di riduzione e non conformi quando la colorazione del gel argento e più del 98% su RF HPLC e praticamente non contenenti pirogeni (Test LAL).

L'essenza e i vantaggi del gruppo di invenzioni rivendicato sono illustrati dai seguenti esempi.

Esempio 1. Costruzione di Plashid PSX50 ricombinante

Il metodo di costruzione del Plashid PSX50 include i seguenti passaggi:

Costruzione del plasmide vettoriale PSX10;

1. Costruzione del Plasmid PSX3 (2641 p.)

2. Costruzione del plasmide vettoriale PSX10 (2553 p.O.)

Costruzione di plasmide ricombinante PSX41 (3218 p.O.);

Costruzione di plasmide ricombinante PSX43 (3218 p.O.);

Costruzione del plasmide ricombinante PSX45 (3218 p.O.);

Costruzione del plasmide ricombinante PSX50 (3218 p.O.).

Costruzione di Plashid PSX10 vettoriale

Il Plasmid PSX10 è un vettore PUC19 in cui la sequenza di codifica del gene della BETA Lactomasi che fornisce la resistenza alle ampicillina viene sostituita dalla sequenza di codifica del gene KAN e contiene un terminatore di trascrizione da Plasmid RSC223-3.

La progettazione del plasmide vettoriale PSS10 viene effettuata in due fasi:

Ottenere Plasmid PSX3 (2641 p.O.), che è un Plashid PUC19, in cui l'area di codifica del gene del gene è sostituita dalla regione di codifica del gene KAN;

Ottenere un plasmide del vento PSX10 (2553 p.O.), che è un Plasmid PSX3, in cui il frammento del DNA che codifica il terminatore di trascrizione GGBT 1 T 2 è inserito durante il sito Bamhi.

Per ottenere Plasmid PSX3, ci sono cinque round di amplificazione del DNA con PCR (reazione a catena della polimerasi). Durante il primo round, utilizzando il DNA plasmid PUC19 come matrice, viene eseguita l'amplificazione del frammento del DNA del 1828 BP. (Frammento PU1-PU2) con i primer:

Questa e le successive reazioni PCR sono eseguite nelle seguenti condizioni: 20 mm TIS-HCL, pH 8.8, 10 mm (NH 4) 2 SO 4, 10 mm KSL, 2 TM MGCL 2, 0,1% Triton x100,01 mg / ml BSA, 0,2 mm ogni DNTP, 1.25 unità. PULIMerase PFU DNA, 100 NG DNA. Il processo di amplificazione consiste nelle seguenti fasi: riscaldamento a 95 ° C 5 min, 35 cicli PCR (30 secondi 95 ° C, 30 secondi 56 ° C, 2 min 72 ° C) e incubazione 10 min a 72 ° C. Dopo l'amplificazione (e dopo le successive amplificazioni), il frammento del DNA è purificato da elettroforesticamente in gel di agarosio dell'1%. Durante il secondo e il terzo round, utilizzando il DNA Plasmid PUC4K come matrice, viene eseguita l'amplificazione del frammento del DNA di 555 BP. (Frammento di km1-km2) con i primer:

e l'amplificazione del frammento del DNA di 258 BP. (KMZ-Km4) con i primer

Nel quinto round, la PCR viene eseguita combinando frammenti (PU1-PU2) e (km1-km4) nelle seguenti condizioni: riscaldamento a 95 ° C 5 min, 5 cicli PCR (30 secondi 95 ° C, 30 secondi 56 ° C, 10 min 72 ° C) e incubazione 10 min a 72 ° C. Il DNA ottenuto dopo l'ultima PCR viene trasformata direttamente nelle celle del ceppo E.Coli DH5 e seminato su un supporto La contenente 20 μg / ml di kanamicina. Dopo l'incubazione per 12 ore a 37 ° C, i cloni sono Sefing, il DNA plasmidico è isolato e l'analisi della restrizione viene eseguita. Di conseguenza, è ottenuto da Plasmid PSH3 in taglia 2641 p.

Per ottenere un plasmide vettoriale PSX10, ci sono tre raddri di amplificazione del DNA da parte di PCR. Durante il primo round, utilizzando il DNA plasmid PSX3 come matrice, viene eseguita l'amplificazione del frammento del DNA del 2025 BP. (Frammento 10.1-10.2) con i primer:

Durante il secondo round, utilizzando il DNA del plasmid RSC223-3 come matrice, viene eseguita l'amplificazione del frammento del DNA di 528 BP. (Frammento di KK1-KK2) con i primer:

Nel terzo round, la PCR viene eseguita combinando frammenti (10.1-10.2) e (QC1-KK2) alle seguenti condizioni: Riscaldamento a 95 ° C 5 min, 5 cicli PCR (30 secondi 95 ° C, 30 secondi 56 ° C, 10 min 72 ° C) e incubazione 10 min a 72 ° C. Il DNA ottenuto dopo l'ultima PCR viene trasformata direttamente nelle celle del ceppo E.Coli DH5 e seminato su un supporto La contenente 20 μg / ml di kanamicina. Dopo l'incubazione per 12 ore a 37 ° C, i cloni sono Sefing, il DNA plasmidico è isolato e l'analisi della restrizione viene eseguita. Di conseguenza, è ottenuto da Plasmid PSX10 in taglia 2553 p.O.

Costruzione di plasmide ricombinante PSX41

Il plasmide ricombinante PSX41 è un frammento posteriori III - Bamhi del PSX3 vettoriale DNA PSX3 (2529 p.O.), POST III - Frammento del DNA posteriore del DNA del 168 p.O., codifica del promotore Triptopophan Opera E. coli (PRP), DNA sintetico Ecoori-Xbai Frammento di 20 PO, che codifica la sequenza SD (Shain-Delgarno) e il frammento del DNA di Xbai-Bamhi di 501 p., Codifica del gene alfa 2b di Inteferon umano.

Per ottenere il sinistro III - VMHI, il frammento vettoriale PSX3 Plasmid (2529 p.O.) Il DNA Plasx3 PSX3 è trattato con enzimi di restrizione hindIII e BAMHI con successiva pulizia elettroforetica in gel di agarosio dell'1%. Punta posteriore III Ecori DNA del 168 p.

Per ottenere un eco-Xbal, un frammento di DNA sintetico di 20 p.O., codifica della sequenza SD (Shain-Delgarno), i seguenti oligonucleotidi complementari sono sintetizzati:

Il frammento del DNA Xbai-VMIII di 501 p.O., codifica del gene umano Inteferon Alpha 2B, è ottenuto dal metodo PCR utilizzando il DNA umano totale come matrice e primer IFN1 e IFN2, con un successivo trattamento di un frammento amplificato di restrizioni XBAL e VMIII.

Inoltre, i frammenti elettroforeticamente purificati sono combinati, legati dall'enzima FAGA T4 Ligase, il DNA viene trasformato nelle cellule della cella di ceppo E.Coli DH5 e seminato su un mezzo di laurea contenente 20 μg / ml di kanamicina. Dopo l'incubazione per 12 ore a 37 ° C, i cloni sono selezionati, il DNA del plasmid è isolato, viene eseguita l'analisi delle restrizioni e viene determinata la struttura del DNA primario. Di conseguenza, è ottenuto dalla dimensione Plasmid PSX41 di 3218 p.O. Successivamente, la mutagenesi graduale del gene interferone viene effettuata per aumentare il livello di espressione del prodotto target. La mutagenesi del gene interferone è quella di sostituire raramente trovata nelle terzine di E. Coli codificando gli aminoacidi corrispondenti a frequentemente trovati in E. coli, i brividi codificano gli stessi amminoacidi. Il genico interferone DNA mutagenez viene effettuato da PCR.

Costruzione di plasmide ricombinante PSX43

Per ottenere il plasmide ricombinante PSX43, un'amplificazione rotonda del DNA tramite PCR utilizzando il DNA plasmid PSX41 come matrice e primer IFN3 e IFN4 vengono eseguiti.

La PCR viene eseguita nelle seguenti condizioni: riscaldamento a 95 ° C 5 min, 20 cicli PCR (30 secondi 95 ° C, 30 secondi 56 ° C, 10 min 72 ° C) e incubazione 20 min a 72 ° C. Il DNA ottenuto dopo la PCR viene trasformato direttamente nelle celle del ceppo E.Coli DH5 e seminato su un supporto La contenente 20 μg / ml di kanamicina. Dopo l'incubazione per 12 ore a 37 ° C, i cloni sono selezionati, il DNA del plasmid è isolato, viene eseguita l'analisi delle restrizioni e viene determinata la struttura del DNA primario. Di conseguenza, il Plasmid PSX43 è 3218 p.

Costruzione di Plashid PXX45 ricombinante

Per ottenere il Plashid PXX45 ricombinante, un DNA di amplificazione rotondo viene eseguito da PCR utilizzando il DNA plasmid PSX43 come matrice e primer IFN5 e IFN6:

La PCR viene eseguita nelle seguenti condizioni: riscaldamento a 95 ° C 5 min, 20 cicli PCR (30 secondi 95 ° C, 30 secondi 56 ° C, 10 min 72 ° C) e incubazione 20 min a 72 ° C. Il DNA ottenuto dopo la PCR viene trasformato direttamente nelle celle del ceppo E.Coli DH5 e seminato su un supporto La contenente 20 μg / ml di kanamicina. Dopo l'incubazione per 12 ore a 37 ° C, i cloni sono selezionati, il DNA del plasmid è isolato, viene eseguita l'analisi delle restrizioni e viene determinata la struttura del DNA primario. Di conseguenza, un Plasmid PSX45 è una dimensione del 3218 p.O.

Progettare il plasmide ricombinante PSX50.

Per ottenere il Plashid PXX50 ricombinante, un round di amplificazione del DNA da parte di PCR viene eseguita utilizzando il DNA plasmid PSX45 come matrice e primer IFN7 e IFN8:

La PCR viene eseguita nelle seguenti condizioni: riscaldamento a 95 ° C 5 min, 20 cicli PCR (30 secondi 95 ° C, 30 secondi 56 ° C, 10 min 72 ° C) e incubazione 20 min a 72 ° C. Il DNA ottenuto dopo la PCR viene trasformato direttamente nelle celle del ceppo E.Coli DH5 e seminato su un supporto La contenente 20 μg / ml di kanamicina. Dopo l'incubazione per 12 ore a 37 ° C, i cloni sono selezionati, il DNA del plasmid è isolato, viene eseguita l'analisi delle restrizioni e viene determinata la struttura del DNA primario. Di conseguenza, è ottenuto da una dimensione PSX50 plasmidica di 3218 p.O.

Esempio 2. Ottenere un ceppo E. Coli SX50 - Produttore Perferone

Il ceppo dell'interferone E. Coli SX50 è ottenuto mediante trasformazione delle cellule della tensione di E. coli BL21 dal plasmide ricombinante PSH50. Il ceppo del produttore di interferone viene coltivato in 30 litri di fermentatore a una densità ottica del 25,0-30.0 o.e. In un ambiente M9, contenente l'1% dell'idrolizzato acido della caseina (DIFCO), del glucosio dell'1%, 40 μg / ml di kanamicina, ad una temperatura di 38-39 ° C. Nel processo di fermentazione, viene effettuata un'aggiunta continua di un substrato nutriente utilizzando un controller gravitometrico.

Esempio 3. Il metodo di selezione dell'interferone dal ceppo E. Coli SX50

Ottenere interferone è stato effettuato in 4 fasi:

Fase 1. Coltivazione del ceppo E. Coli SX50.

Fase 2. Isolamento e purificazione della forma insolubile di interferone.

3 stadio. Dissoluzione e rimaturazione dell'interferone.

4 stadio. Pulizia cromatografica dell'interferone.

Fase 1. Ceppo di coltivazione E. Coli SX50

Il materiale della semina della Grown della tensione di E. Coli SX50 nel volume del 3 litro del ricco LB medio per 12 ore a 26 ° C è contribuito a demente al fermentatore contenente 27 litri di medio sterile contenente M9, caso idrolizzato acido 1% , Glucosio 1%, 1 mm MGCL 2, 0,1 mm Cacl 2, 40 mg / ml di kanamicina. La coltivazione nel fermentatore viene effettuata ad una temperatura di 38-39 ° C, supportando il pH 7 ± 0,15 mediante soluzioni automatiche con soluzione idrossido di sodio del 40%. La concentrazione di ossigeno disciolto nell'intervallo (50 ± 10)% della saturazione viene mantenuta cambiando la velocità dell'agitatore da 100 a 800 giri / min e fornitura d'aria da 1 a 15 l / min. La concentrazione di substrati, in particolare l'estratto di glucosio e lievito, viene misurata durante la fermentazione e mantenere la loro concentrazione cambiando la velocità di avanzamento delle soluzioni concentrate, attraverso le pompe peristaltiche utilizzando un controller gravimetrico.

L'accumulo di interferone sotto forma di forma insolubile è controllata mediante microscopia a contrasto di fase, mediante elettroforesi del 15% di gel poliacriticolismo (SDS-PAAG) e con cromatografia altamente efficiente inverso (RF HPLC). La fermentazione viene fermata al raggiungimento della massima densità ottica (~ 25-30 o.e.) e arrestando la sintesi dell'interferone. Alla fine della fermentazione, il fluido della cultura è separato mediante centrifugazione nel rotore di flusso a una velocità di rotazione di 5000-10000 giri / min. La biomassa è confezionata in pacchetti in polietilene e congelato a meno 70 ° C.

Fase 2. Isolamento e purificazione dell'interferone di forma insolubile

300-400 g di biomassa congelata E. Coli SX50 Strain è sospeso in un buffer da 3000 ml 1 (20 mm Tris-HCl, pH 8,0, 10 mm EDTA, 0,1% tritone X100). La sospensione viene trasmessa attraverso l'omogeneizzatore fluente gaulina, mantiene una pressione di 900 bar e centrifugata in un rotore di flusso a 15.000 rpm. Il precipitato risultante è stato lavato in condizioni analoghe coerentemente da tamponi 2 (20 mm tris-hcl, pH 8,0, 1 mm EDTA, 3 m di urea) e buffer 3 (20 mm tris-hcl ph 8.0, 1 mm EDTA) e infine il I sedimenti di interferone sono sospesi in 200 ml buffer 3. Allo stesso tempo, il tempo di isolamento e purificazione della forma insolubile di interferone non è superiore a 5 ore.

3 stadio. Dissoluzione Interferone e Renaturazione

La forma insolubile di interferone, ottenuta nella fase precedente della sospensione, viene aggiunta la guanidina secca cloridrato a una concentrazione di 6 m, DithioTitolo viene aggiunta a una concentrazione di 50 mm, tris-hcl pH 8,0 a una concentrazione di 50 mm, nacl A una concentrazione di 150 mm e triton X100 a una concentrazione dello 0,1%, incubata quando la temperatura ambiente per 2 ore. Il materiale insolubile è separato mediante sterilizzazione filtrando attraverso le membrane con diametri di pori di 0,22 micron.

La rinaturazione dell'interferone viene eseguita mediante la lente diluizione della soluzione risultante 100-200 volte con tampone 4 (20 mm tris-hcl ph 8,0, 100 mm nacl, 0,1 mm di carne). Dopodiché, la miscela rinatoriale è incubata con mescolamento costante per 12-15 ore a una temperatura di 4-8 ° C. Successivamente, il solfato di magnesio viene aggiunto a una concentrazione di 1 mm e il materiale aggregato viene rimosso mediante il filtraggio sterilizzante attraverso un filtro a membrana con un diametro del poro di 0,22 micron.

4 stadio. Pulizia cromatografica dell'interferone

La pulizia cromatografica dell'interferone viene effettuata in tre fasi.

1. L'interferone rinatoriale risultante al primo stadio viene purificato utilizzando la cromatografia di affinità sul tipo di resina chelationing chelationing safarose Flow Flow (Amersham Biosciences) Immobilizzato da IONI CU +2. Per questo, la soluzione di interferone viene applicata alla colonna con il flusso rapido di Sepharose Sepharose di CU +2 e interferone è eluito con un tampone acido limonico da 0,1 m pH 2.2 2.2.

2. Nella seconda fase della pulizia cromatografica, la soluzione di interferone viene applicata a cm Sepharose Flow Flow (Amersham Biosciences) (Amersham Biosciences) (Amersham Biosciences) (Amersham Biosciences) (Amersham Biosciences) e Interferone è eluito con un gradiente di soluzioni (0,0-0,5 m Nacl) in buffer 50 mm na (CH 3 SO), pH 5.5.

3. Pulizia della forma monomero di interferone dai residui di forme di polimero di interferone viene eseguita alla terza fase del filtro del gel di pulizia del gel interferone sul tipo di resina SuperDex 75 (Bioscienze Amersham). La cromatografia viene eseguita in buffer 50 mm NA (CH 3 COO), pH 5.0, contenente 0,15 m nacl.

Il metodo descritto di isolamento e purificazione dell'Interferone consente di ottenere 4-8 g di interferone purificato alto per un ciclo di selezione per 7-10 giorni dalla biomassa ottenuta da 10 litri di media media. La qualità dell'interferone ottenuto è pienamente conforme ai requisiti di "Pharmacopoeia europea" per la sostanza dell'Interferone Alpha-2B, vale a dire:

Concentrazione di interferone di almeno 2 × 10 8 IU / ml;

L'attività specifica dell'interferone è di almeno 2,0 × 10 8 IU / mg;

Purezza elettroofortale del farmaco almeno il 99% in condizioni di riduzione e non riducenti durante la colorazione con gel argento;

Il punto isoelettrico dell'interferone assegnato si trova nella regione del PH 5.8-6.3;

La mappa del peptidge dell'Interferone assegnata non è fondamentalmente diverso dalla carta peptide per lo standard CRS CRS europeo Interferon Alpha 2B;

Come segue dagli esempi sopra riportati, il gruppo di invenzioni rivendicato consente l'interferone alfa-2b con un'elevata resa con una tecnologia relativamente semplice e affidabile.

RICHIESTA

1. DNA Plasmid-PSX50 ricombinante, codifica della sintesi dell'Interferone alfa-2b umano ricombinante, caratterizzato dal fatto che ha una dimensione di 3218 paia di basi (PO) ed è composta dai seguenti frammenti: una sequenza da 1 a 176 nucleotidi ( n.) Include una dimensione del DNA del frammento 176 BP. contenente un promotore triptofano (PRP), sequenza dal 177 al 194 n. Include un frammento di DNA sintetico di 18 p.O., contenente la sequenza di Shain Delgarno, responsabile per l'avvio della trasmissione, sequenza dal 195 al 695 N. Include un frammento di DNA di 501 p.O., contenente il gene di interferone alfa-2b con sostituzioni di nucleotidica: 37 (A\u003e c), 39 (G\u003e T), 40 (A\u003e c), 42 (G\u003e T), 67 (A\u003e c), 69 (G\u003e T), 70 (A\u003e c), 72 (A\u003e T), 96 (G\u003e a), 100 (A\u003e c), 102 (A\u003e T), 114 (e\u003e c ), 120 (c\u003e g), 126 (G\u003e a), 129 (G\u003e a), 330 (C\u003e G), 339 (G\u003e a), 342 (G\u003e a), 487 (A\u003e c) , 489 (A\u003e T), 495 (G\u003e a), Sequenza da 696 a 713 N. Include un frammento di DNA sintetico di 18 p.O., contenente un polylinker sintetico, sequenza da 714 a 1138 N. Include frammento di DNA Plasmid RSC223-3 da 4129 a 4553 N. 425 ppm contenente una sequenza di un terminatore di trascrizione rigoroso RRNBT 1 T 2, sequenza da 1139 a 1229 N. Include frammento PUC19 Plasmid DNA da 2487 a 2577 N. 91 PPM, contenente un promotore GheNotomase-Olktomasi (Gene Resistenza Amillina R), sequenza da 1230 a 2045 n. Include frammento PUC4K Plasmid DNA con 720 N. 1535 N. La dimensione di 816 p.O., contenente la regione strutturale del gene KAN, sequenza dal 2046 n. 3218 n. Include frammento PUC19 Plasmid DNA da 1625 a 453N. La dimensione di 1173 PN contenente la sequenza responsabile della replica del plasmide (ORI) e del promotore dell'CLAC (PC lac).

2. L'Eschcerichia Coli SX50 ha trasformato la deformazione dei batteri plasmidi ricombinanti secondo la rivendicazione 1 - il produttore del leucocito ricombinante Interferone ALFA-2B dell'uomo.

3. il metodo per ottenere l'interferone alfa-2b persona, compresa la coltivazione della tensione di Escherichia coli SX5 secondo la rivendicazione 2 nel mezzo nutritivo con una costante aggiunta di substrati nutrienti nel processo di biosintesi, distruzione meccanica delle cellule di microrganismo ad una pressione di 700-900 bar, dissoluzione dell'Interferone in una soluzione tampone idrocloruro di Guanidina, interferone Renolum in soluzioni di buffer fisiologica in presenza di agenti calopa, pulizia cromatografica a tre stadi di interferone su chelationing safarose veloci di tipo di flusso, immobilizzata con Cu +2 ION, Scambio ionico Chromatography sulle resine di scambio ionico cm Sepharose Fast Flow e Gel Filtration Chromatography su SuperDex 75 Resine.

4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui la coltivazione viene effettuata su un supporto nutritivo con un contenuto ridotto di triptofano nell'aggiunta continua di substrati nutrienti, preferibilmente l'estratto di glucosio e lievito.

5. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui viene purificato rimuovendo componenti cellulari solubili da rimuovere, compresi DNA, RNA, proteine, lipopolisaccaridi, lavaggio con soluzioni tampone contenenti detergenti triton XI 00, urea.

6. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui, dopo ogni pulizia cromatografica, il filtro sterilizzante viene effettuato attraverso i filtri con una dimensione del poro di 0,22 μm.